八角莲人工种子的制作方法

摘要

本发明公开一种八角莲人工种子的制作方法，包括：将八角莲胚性愈伤组织经过分化培养得到体细胞胚胎，然后将体细胞胚胎进行增殖培养得到增殖的体细胞胚胎，将所得增殖的体细胞胚胎用包埋剂包裹即得所述八角莲人工种子，最后使用2.5-40g/L的普鲁兰多糖溶液对八角莲人工种子喷洒后贮藏提高人工种子的萌发率。本发明旨在利用现代生物技术有效缓解八角莲野生资源濒临枯竭和规模化人工栽培中种苗短缺的局面，满足人们生活中对八角莲的需求。本发明利用胚性愈伤组织分化得到体细胞胚胎后，制作得到种子，减少生产步骤，缩短生产周期。本发明使用普鲁兰多糖溶液对人工种子喷洒后，提高种子的萌发率。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种八角莲人工种 子的制作方法。

背景技术

八角莲Dysosmaversipellis(Hance)M.Cheng是我国传统常用中药之一， 具清热解毒，化痰散结、祛痰消肿之功效，其主要活性成分是具有抗肿瘤活 性的天然产物-鬼臼毒素，一种人工合成依托泊苷(etoposide，VP-16)和替尼 泊苷(teniposide，VM-26)等药物的前体。近年来的临床研究表明，VP-16和 VM-26的临床效果优越，是治疗睾丸癌、淋巴癌、白血病、小细胞肺癌的重 要药物；且体外实验显示，VP-16能增强抗癌药物对黑色素瘤的疗效。目前， VP-16和VM-26已获得美国FDA批准上市，具有巨大的市场潜力。另外， 八角莲叶较大，边缘4-9浅裂或深裂，花艳丽，极具观赏价值。

随着鬼臼毒素新功能的不断开发和人类患癌率的逐年增加，八角莲的市 场需求量也日益增加，其资源问题也就成为研究的焦点。长期以来由于过度 采挖，造成八角莲野生资源亏缺，物种濒危，目前已被列为国家珍稀濒危三 级保护植物。加之八角莲植株座果率低，种子自然繁殖率极低，难以满足规 模化人工种植的需要。

传统的根茎分株和根诱导苗的繁殖方式繁殖率也很低，且生产成本很高， 同时不利于野生资源的保护。利用组织培养快速繁殖的方式，虽然能够在一 定程度上解决八角莲快速繁殖的问题，但同时也存在着，愈伤组织在继代多 代后出现变异、种质退化，愈伤组织分化苗移栽成活率低和生产成本高等瓶 颈问题，很大程度上限制了八角莲的大规模化栽培生产。

人工种子事实上是与体细胞胚胎实际应用密切相关。体细胞胚胎具有增 殖快、产量高、遗传稳定的优点，更为重要的是，它还具有双极性结构，可 以一步到位形成完整的植株，不需要按常规分步诱导芽和根的形成。因而， 人工种子的应用前景广阔。对八角莲而言，人工种子即是将八角莲的体细胞 胚胎经过包埋处理之后，直接播种到土壤中，它为八角莲的人工栽培提供了 一个新途径。

目前国内外尚无有关八角莲人工种子的相关报道。而我们课题组在前期 的研究中，已成功诱导获得八角莲的体细胞胚胎，为八角莲人工种子的研制 提供了可利用的生产材料。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的目的在于提供了一种珍稀濒危药用植物八角莲的人工种子制作 方法，旨在利用现代生物技术有效缓解八角莲野生资源濒临枯竭和规模化人 工栽培中种苗短缺的局面，满足人们生活中对八角莲的需求。

本发明还有一个目的是利用胚性愈伤组织分化得到体细胞胚胎后，制作 得到种子，减少生产步骤，缩短生产周期。

本发明还有一个目的是使用普鲁兰多糖溶液对人工种子喷洒后，提高种 子的萌发率。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种八角莲人工种 子的制作方法，其中，包括：

将八角莲胚性愈伤组织经过分化培养得到体细胞胚胎，然后将体细胞胚 胎进行增殖培养得到增殖的体细胞胚胎，将所得增殖的体细胞胚胎用包埋剂 包裹即得所述八角莲人工种子。

优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，

采用分化培养基进行所述分化培养；

所述分化培养基主要由MS培养基、浓度0-1.0mg/L的6-BA以及浓度为 0.1-2.0mg/L的NAA组成；

分化分化培养条件为：暗培养，温度20-24℃，培养周期为15-20天。

优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，

采用增殖培养基进行增殖培养；

所述增殖培养基为液体培养基，所述增殖培养基主要由MS培养基、浓 度0-1.0mg/L的6-BA、浓度0-1.0mg/L的NAA、浓度0-2.0mg/L的2，4-D 以及浓度0-0.5mg/LABA组成；

所述增殖培养方法为：悬浮培养，暗培养，温度20-24℃，培养周期为 10-20天。

优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，

使用2.5-40g/L的普鲁兰多糖溶液对所述八角莲人工种子喷洒后贮藏。

优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，所述体细胞胚胎为继 代培养3-4代的体细胞胚胎。

优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，所述包埋剂通过以下 方法制得：

步骤一、制备人工胚乳，所述胚乳中含有1/2MS培养基、浓度0.3-0.6mg/L 的6-BA、浓度0.3-0.6mg/L的GA3、浓度0.3-0.6mg/L的IBA、浓度13-16g/L 麦芽糖、质量百分比为0.3-0.5％的多菌灵以及质量百分比为0.3-0.5％的活性 炭；

步骤二、将海藻酸钠粉末与所述人工胚乳以3-4：100的质量比例混合， 加热搅拌成溶胶状态，即得到所述包埋剂。

优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，所述包埋剂的pH＝5.8.

优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，用包埋剂进行所述包 埋的方法为：

步骤一、将所述包埋剂经110-125℃灭菌15-25min得到无菌包埋剂；

步骤二、在无菌条件下，将所述增殖的体细胞胚胎在100目滤网过滤后， 均匀悬浮于所述无菌包埋剂中，同时再加入四环素和硫酸链霉素得到悬浊液， 所述四环素和硫酸链霉素的用量均为100mg/L；

步骤三、使用滴管吸取所述悬浊液中带胚状体的液滴；

步骤四、将所述带胚状体的液滴滴入无菌的质量分数为2％的氯化钙溶液 中，10-15min后去除氯化钙溶液，再使用无菌水冲洗18-20min即得到所述人 工种子。

优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，所述人工种子进行贮 藏前先进行干燥。

优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，所述人工种子贮藏的 条件为：无菌密封，温度3-5℃。

本发明至少包括以下有益效果：首先，本发明中的八角莲胚性细胞具有 生长速度快、植株再生频率高、性状稳定等优点，克服了八角莲常规组织培 养中易褐化、变异和生长周期长及成本高等缺点；本发明也解决了八角莲种 子量少、繁殖率低的生产问题；同时，本发明不受季节限制、可大量生产人 工种子，能够择时播种。本项发明成果为八角莲的规模化人工栽培提供了生 产所需的种子种苗，有益效果明显。通过本发明所述方法制得的种子萌发率 高达85％以上。

其次，本发明利用普鲁兰多糖溶液对八角莲人工种子进行喷洒，有效的 保持人工种子的水分，特别针对利用了海藻酸钠和氯化钙的人工种子，能够 有效解决这类人工种子易失水的缺点，相比不适用普鲁兰多糖喷洒的种子， 萌发率提高了60％左右，效果非常显著。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将 通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照 说明书文字能够据以实施。

本发明的八角莲人工种子的制作方法包括以下步骤：

一、体细胞胚胎的诱导：将八角莲胚性愈伤组织转入分化培养基 MS+0-1.0mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.1-2.0mg/LNAA(萘乙酸)的培 养基上，诱导体细胞胚胎的形成，得到体细胞胚胎。培养条件为：暗培养， 温度22℃±2℃，培养周期15-20d。

二、体细胞胚胎液体增殖培养：将继代3-4代的体胚转接到MS+0-1.0 mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0-1.0mg/LNAA(萘乙酸)+0-2.0mg/L2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)+0-0.5mg/LABA(脱落酸)的液体培养基中悬浮培养。 培养条件为：暗培养，温度22℃±2℃，培养周期10-20d。该步骤中也可 以使用固体培养基，但是优选使用液体培养基，因为体细胞胚胎在液体中悬 浮能够更加均匀地吸收养分，利于生长。

三、八角莲人工种子制作：包括以下步骤：

1)制备包埋剂：以1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LGA3(赤霉素)+0.5 mg/LIBA(吲哚丁酸)+15g/L麦芽糖+0.3-0.5％多菌灵+0.3-0.5％活性炭为人 工胚乳。并按3-4％比例加入海藻酸钠粉末后，混合加热使之成溶胶状态， 即包埋剂，所述包埋剂的pH＝5.8。包埋剂经121℃高压灭菌20min后，冷却 备用。

2)种子的制作：在无菌条件下，将3-5mm的八角莲体细胞胚胎在100 目的镍网上过滤后，均匀悬浮于灭菌后的包埋剂中，同时加入过滤灭菌的四 环素100mg/L和硫酸链霉素100mg/L；然后，用直径为5mm的滴管吸取带 胚状体的液滴，滴入已灭菌的2％氯化钙溶液中，约10-15min后，倒去氯化 钙溶液，用无菌水冲洗20min，得到八角莲人工种子。

3)人工种子后处理：在得到的八角莲人工种子表面喷洒浓度2.5-40g/L 的普鲁兰多糖溶液，待干燥后放入无菌的三角瓶中，用封口膜封好，在4℃ 的冰箱中贮藏30天左右，即得到所述的人工种子。普鲁兰多糖溶液可以保持 人工种子的水分，克服海藻酸钠+氯化钙包裹系统易失水的缺点，提高人种子 的萌发率。

实例1

一、制作八角莲人工种子

1)八角莲体细胞胚胎的诱导

将八角莲松散的胚性愈伤组织转入分化培养基MS+1.0mg/L6-BA+2.0 mg/LNAA的培养基上，暗培养20d后，组织结构的质地紧密，愈伤组织表 面形成一堆堆较为松散的结节状突起。随着暗培养时间的延长，结节状突起 大部分分化出胚状体，有少量则分化出根，所述胚状体即为体细胞胚胎，培 养条件为：暗培养，温度22℃±2℃，培养周期20d。

2)体细胞胚胎液体增殖培养

将继代4代的胚状体转接到MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA+2.0 mg/L2，4-D+0.5mg/LABA的液体培养基中悬浮培养，同时使用搅拌机搅拌。 每个250mL三角瓶装培养液100mL，接种量体细胞胚胎的重量为8g。培养 条件为：暗培养，温度22℃±2℃，培养周期20d，搅拌机转速为120r/min。

3)包埋剂的制作

以1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LGA3+0.5mg/LIBA+15g/L麦芽糖 +0.5％多菌灵+0.5％活性炭为人工胚乳，并按4％比例加入海藻酸钠粉末后， 混合加热使之成溶胶状态，即包埋剂，所述包埋剂的pH＝5.8，包埋剂经121℃ 高压灭菌20min后，冷却备用。

4)八角莲人工种子的制作

在已进行灭菌的超净工作台上，将液体培养的3-5mm胚状体在100目的 镍网上过滤后，均匀悬浮于灭菌后的包埋剂中，同时加入过滤灭菌的四环素 100mg/L和硫酸链霉素100mg/L；然后，用直径为5mm的滴管吸取带胚状 体的液滴(确保每个液滴含有1个胚状体)，滴入已灭菌的2％氯化钙溶液中， 经过约15min的离子交换后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即可 得到八角莲人工种子。

5)八角莲人工种子后处理：在八角莲人工种子表面喷洒30g/L的普鲁兰 多糖溶液，待干燥后放入无菌的三角瓶中，用封口膜封好，在4℃的冰箱中 贮藏30天即得到所述的人工种子。

二、八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液的对比实验

在八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液，待干燥后放入无菌的三角 瓶中，用封口膜封好，在4℃的冰箱中贮藏。普鲁兰多糖的浓度设计为5个 梯度：0g/L、10g/L、30g/L、50g/L、100g/L。每个浓度处理50粒种子。

30天后，将本实验中的人工种子接种到有5cm厚的腐殖土育苗盆中，密 度为1粒/cm2，深度为0.5cm。培养条件为：25℃恒温光/暗交替培养，湿度 为85％，30天后观察种子的转化情况，统计萌发率。实验结果见表1。

转发率的统计依据：将八角莲人工种子接种于腐殖土中，恒温培养1个 月后，统计转发率，以体胚产生子叶和根作为转化成功的标准。

表1八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液的对比实验

由表1可知，普鲁兰多糖可以保持人工种子的水分，克服海藻酸钠+2％ 氯化钙包裹系统易失水的缺点，提高人种子的萌发率。

实施例2

一、制作八角莲人工种子

1)八角莲体细胞胚胎的诱导

将八角莲松散的胚性愈伤组织转入分化培养基MS+0.8mg/L6-BA +1.5mg/LNAA的培养基上，暗培养20d后，组织结构的质地紧密，愈伤组 织表面形成一堆堆较为松散的结节状突起。随着暗培养时间的延长，结节状 突起大部分分化出胚状体，有少量则分化出根，所述胚状体即为体细胞胚胎， 培养条件为：暗培养，温度22℃±2℃，培养周期15-20d。

2)体细胞胚胎液体增殖培养：

将继代3代的胚状体转接到MS+0.8mg/L6-BA+0.8mg/LNAA+1.5mg/L 2，4-D+0.4mg/LABA的液体培养基中悬浮培养，同时使用搅拌机搅拌。每个 250mL三角瓶装培养液100mL，接种量体细胞胚胎的重量为7g。培养条件 为：暗培养，温度22℃±2℃，培养周期10一20d，搅拌机转速为120r/min。

3)包埋剂的制作

以1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LGA3+0.5mg/LIBA+15g/L麦芽糖 +0.4％多菌灵+0.5％活性炭为人工胚乳，并按3％比例加入海藻酸钠粉末后， 混合加热使之成溶胶状态，即包埋剂，所述包埋剂的pH＝5.8，包埋剂经121℃ 高压灭菌20min后，冷却备用。

4)八角莲人工种子的制作

在已进行灭菌的超净工作台上，将液体培养的3-5mm胚状体在100目的 镍网上过滤后，均匀悬浮于灭菌后的包埋剂中，同时加入过滤灭菌的四环素 100mg/L和硫酸链霉素100mg/L；然后，用直径为5mm的滴管吸取带胚状 体的液滴(确保每个液滴含有1个胚状体)，滴入已灭菌的2％氯化钙溶液中， 经过约13min的离子交换后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即可 得到八角莲人工种子。

5)人工种子后处理：在八角莲人工种子表面喷洒30g/L的普鲁兰多糖溶 液，待干燥后放入无菌的三角瓶中，用封口膜封好，在4℃的冰箱中贮藏30 天左右即得到所述人工种子。

二、八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液的对比实验

在八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液，待干燥后放入无菌的三角 瓶中，用封口膜封好，在4℃的冰箱中贮藏。普鲁兰多糖的浓度设计为5个 梯度：0g/L、10g/L、30g/L、50g/L、100g/L。每个浓度处理50粒种子。

30天后，将本实验中的人工种子接种到有5cm厚的腐殖土育苗盆中，密 度为1粒/cm2，深度为0.5cm。培养条件为：25℃恒温光/暗交替培养，湿度 为85％，30天后观察种子的转化情况，统计萌发率。实验结果见表1。

转发率的统计依据：将八角莲人工种子接种于腐殖土中，恒温培养1个 月后，统计转发率，以体胚产生子叶和根作为转化成功的标准。

表2八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液的对比实验

由表2可知，普鲁兰多糖可以保持人工种子的水分，克服海藻酸钠+2％ 氯化钙包裹系统易失水的缺点，提高人种子的萌发率。

实施例3

一、制作八角莲人工种子

1)八角莲体细胞胚胎的诱导

将八角莲松散的胚性愈伤组织转入分化培养基MS+0.5mg/L6-BA +1mg/LNAA的培养基上，暗培养20d后，组织结构的质地紧密，愈伤组织 表面形成一堆堆较为松散的结节状突起。随着暗培养时间的延长，结节状突 起大部分分化出胚状体，有少量则分化出根，所述胚状体即为体细胞胚胎， 培养条件为：暗培养，温度22℃±2℃，培养周期15-20d。

2)体细胞胚胎液体增殖培养：

将继代4代的胚状体转接到MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+1mg/L2， 4-D+0.2mg/LABA的液体培养基中悬浮培养，同时使用搅拌机搅拌。每个250 mL三角瓶装培养液100mL，接种量体细胞胚胎的重量为5g。培养条件为： 暗培养，温度22℃±2℃，培养周期15D，搅拌机转速为120r/min。

3)包埋剂的制作

以1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LGA3+0.5mg/LIBA+15g/L麦芽糖 +0.3％多菌灵+0.3％活性炭为人工胚乳，并按4％比例加入海藻酸钠粉末后， 混合加热使之成溶胶状态，即包埋剂，所述包埋剂的pH＝5.8，包埋剂经121℃ 高压灭菌20min后，冷却备用。

4)八角莲人工种子的制作

在已进行灭菌的超净工作台上，将液体培养的3-5mm胚状体在100目的 镍网上过滤后，均匀悬浮于灭菌后的包埋剂中，同时加入过滤灭菌的四环素 100mg/L和硫酸链霉素100mg/L；然后，用直径为5mm的滴管吸取带胚状 体的液滴(确保每个液滴含有1个胚状体)，滴入已灭菌的2％氯化钙溶液中， 经过约13min的离子交换后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即可 得到八角莲人工种子。

5)人工种子后处理：在所得的八角莲人工种子表面喷洒30g/L的普鲁兰 多糖溶液，待干燥后放入无菌的三角瓶中，用封口膜封好，在4℃的冰箱中 贮藏30天左右即得到所述的人工种子。

二、八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液的对比实验

在八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液，待干燥后放入无菌的三角 瓶中，用封口膜封好，在4℃的冰箱中贮藏。普鲁兰多糖的浓度设计为5个 梯度：0g/L、10g/L、30g/L、50g/L、100g/L。每个浓度处理50粒种子。

30天后，将本实验中的人工种子接种到有5cm厚的腐殖土育苗盆中，密 度为1粒/cm2，深度为0.5cm。培养条件为：25℃恒温光/暗交替培养，湿度 为85％，30天后观察种子的转化情况，统计萌发率。实验结果见表1。

转发率的统计依据：将八角莲人工种子接种于腐殖土中，恒温培养1个 月后，统计转发率，以体胚产生子叶和根作为转化成功的标准。

表3八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液的对比实验

由表3可知，普鲁兰多糖可以保持人工种子的水分，克服海藻酸钠+2％ 氯化钙包裹系统易失水的缺点，提高人种子的萌发率。

实施例4

一、制作八角莲人工种子

1)八角莲体细胞胚胎的诱导

将八角莲松散的胚性愈伤组织转入分化培养基MS+0mg/L6-BA +0.1mg/LNAA的培养基上，暗培养20d后，组织结构的质地紧密，愈伤组 织表面形成一堆堆较为松散的结节状突起。随着暗培养时间的延长，结节状 突起大部分分化出胚状体，有少量则分化出根，所述胚状体即为体细胞胚胎， 培养条件为：暗培养，温度22℃±2℃，培养周期15-20d。

2)体细胞胚胎液体增殖培养：

将继代4代的胚状体转接到MS+0mg/L6-BA+0mg/LNAA+0mg/L2， 4-D+0mg/LABA的液体培养基中悬浮培养，同时使用搅拌机搅拌。每个250 mL三角瓶装培养液100mL，接种量体细胞胚胎的重量为3g。培养条件为： 暗培养，温度22℃±2℃，培养周期10d，搅拌机转速为120r/min。

3)包埋剂的制作

以1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LGA3+0.5mg/LIBA+15g/L麦芽糖 +0.3％多菌灵+0.3％活性炭为人工胚乳，并按3％比例加入海藻酸钠粉末后， 混合加热使之成溶胶状态，即包埋剂，所述包埋剂的pH＝5.8，包埋剂经121℃ 高压灭菌20min后，冷却备用。

4)八角莲人工种子的制作

在已进行灭菌的超净工作台上，将液体培养的3-5mm胚状体在100目的 镍网上过滤后，均匀悬浮于灭菌后的包埋剂中，同时加入过滤灭菌的四环素 100mg/L和硫酸链霉素100mg/L；然后，用直径为5mm的滴管吸取带胚状 体的液滴(确保每个液滴含有1个胚状体)，滴入已灭菌的2％氯化钙溶液中， 经过约10min的离子交换后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即可 得到八角莲人工种子。

5)八角莲人工种子制作：在八角莲人工种子表面喷洒30g/L的普鲁兰多 糖溶液，待干燥后放入无菌的三角瓶中，用封口膜封好，在4℃的冰箱中贮 藏30天左右即得到所述八角莲的人工种子。

二、八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液的对比实验

在八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液，待干燥后放入无菌的三角 瓶中，用封口膜封好，在4℃的冰箱中贮藏。普鲁兰多糖的浓度设计为5个 梯度：0g/L、10g/L、30g/L、50g/L、100g/L。每个浓度处理50粒种子。

30天后，将本实验中的人工种子接种到有5cm厚的腐殖土育苗盆中，密 度为1粒/cm²，深度为0.5cm。培养条件为：25℃恒温光/暗交替培养，湿度 为85％，30天后观察种子的转化情况，统计萌发率。实验结果见表1。

转发率的统计依据：将八角莲人工种子接种于腐殖土中，恒温培养1个 月后，统计转发率，以体胚产生子叶和根作为转化成功的标准。

表4八角莲人工种子表面喷洒普鲁兰多糖溶液的对比实验

由表4可知，普鲁兰多糖可以保持人工种子的水分，克服海藻酸钠+2％ 氯化钙包裹系统易失水的缺点，提高人种子的萌发率。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方 式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领 域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范 围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实 例。