一种规模化获取桃胚培养无菌苗的技术

摘要

一种规模化获取桃胚培养无菌苗的技术，属于植物生物技术领域，包括培养基制备、桃果实的清洗、表面浸泡杀菌、种子分离、梯度H

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体为一种规模化获取桃胚培养无菌苗的技术。

背景技术

桃为核果类落叶果树，其果实为大众喜爱的水果之一。桃早熟品种果实发育时间短，果实成熟时其种胚尚未发育成熟。常规层积早熟桃种子，播种后出苗率很低。胚培养技术能有效提高早熟品种种子的萌芽率及成苗率，为桃早熟品种育种必备技术之一。桃胚培养技术通常包括培养基的制备、果实的清洗、种子的取出、种子的消毒、无菌水冲洗、种仁分离与接种、低温处理和无菌苗获得等技术环节。从种子分离出来到接种在培养基上所需时间长短，决定着技术的效率与规模化应用；在获得质量良好的桃胚培养无菌苗方面，发生的微生物污染是重要的技术瓶颈。

在现实操作中，种仁剥离前获得消毒彻底的种子是一个关键环节之一，其中从种子取出到经种子无菌蒸馏水冲洗后（接种前）的时间长短又是影响规模化桃胚培养接种效率的重要组成因子。其次，种仁剥离与接种完成所需时间在接种操作上也影响污染率的高低。所需时间愈长，由人员操作引入的污染机会就越多。在愈短的时间内完成接种操作，后期发生的污染率就愈少。种皮与种仁分离的难易是限制接种效率的关键。在种仁剥离前，延长种子浸入无菌水中的时间，可以降低种皮种仁分离的难度，但长时间的浸泡，水中氧含量低，种子的无氧呼吸使其生命力下降，会出现后期胚坏死现象，不能正常出苗。如何能将种子消毒效率与种仁分离难度两者统筹起来，是规模化桃胚培养要解决的技术难题，也是很多桃育种工作着经常思考问题之一。

现行的桃胚培养技术在消毒上多采用70%酒精消毒结合饱和漂白粉溶液或次氯酸钠溶液消毒种子，或者采用饱和漂白粉溶液与0.1%升汞消毒种子，或者用70%酒精结合0.1%升汞消毒种子，经灭菌蒸馏水冲洗后分离种仁接种在培养基上。这些技术在实践上，一是操作要求高，操作过程中工作人员安全防护意识要求高。技术环节中有70%酒精或0.1%升汞使用时，时间控制要求严格，消毒时间稍长，种子受到损伤，发芽率降低，不利于获取质量良好的无菌苗；消毒时间过短，杀菌不彻底，后续污染率高。饱和漂泊粉溶液或次氯酸钠溶液属于腐蚀品，操作过程中需要防止游离氯引起中毒；升汞为A级无机剧毒化学品，使用操作中要严格防护，以防造成急性中毒，其使用过的溶液要特殊处理，以免严重污染环境。使用上述消毒剂对工作人员的安全防护要求很高。二是不能很好地兼顾消毒效率和种皮与种仁分离效率，限制规模化操作效率。在操作上，延长种子在水溶液中的浸泡时间有利于后续种仁的分离，但会因人为造成种子无氧呼吸进而降低种子活力。

本发明在仔细探究污染的形成环节、限制桃胚培养接种效率因子的基础上，公开了一种行之有效的桃胚培养技术，不仅操作方便，安全环保，还能很好地兼顾消毒效率与种仁分离效率，减少接种操作时间，为早熟桃的规模化桃胚培养提供了新技术选择。

发明内容

本发明提供了一种规模化获取桃胚培养无菌苗的方法，它为早熟桃的胚培养提供了一种可资选择的方法，简化了技术操作，降低了桃胚培养试管污染率，创新了规模化获取桃胚培养无菌苗技术。

本发明实现上述目的采用以下技术方案：

一种规模化获取桃胚培养无菌苗的方法，它包括以下操作步骤：培养基的制备、果实的清洗、浸泡杀菌、种子的取出、种子消毒、无菌水冲洗、种仁剥离与接种、低温处理、出苗管理。

所述的一种规模化获取桃胚培养无菌苗的方法，其具体工艺如下：

1）培养基的制备

制备桃胚培养用WPM培养基，并分装在相应的塑料或玻璃试管至试管的五分之一到四分之一高度，盖上试管塞，高压灭菌后室温冷却备用；

2）果实清洗

成熟的桃果实除去果梗后，用加适量洗涤液的自来水清洗干净；

3）酒精浸泡

桃果实在干净的室内用75%酒精浸泡10～15min；

4）种子的取出

用剪核刀抛开果实，剪开种核，取出种子；

5）种子消毒

①梯度H₂O₂溶液浸泡之低浓度H₂O₂溶液浸泡：种子浸入盛有0.2%～0.5%H₂O₂溶液的组培瓶中，直至取完实验种子。为便于后续操作，含200ml低浓度H₂O₂溶液的组培瓶以放入100～150粒种子为宜；

②梯度H₂O₂溶液浸泡之高浓度H₂O₂溶液浸泡：

操作转移到超净台上，将低浓度的H₂O₂溶液倒出至空烧杯，加入3%～5%H₂O₂溶液，盖上组培瓶盖子，缓慢摇动瓶子5～8min，使种子浮动与溶液充分接触；

6）无菌水冲洗

倒出瓶中的H₂O₂溶液，加入无菌水冲洗种子3～4次，最后一次的无菌水不用倒出；

7）种仁剥离与接种

超净台上用镊子稍微夹破胚乳端种皮，用带有无菌手套的母指和食指轻微挤压种子，取出种仁，接种到含有实验用培养基的试管中；

8）低温处理

接种试管置于2～4℃冷库中低温处理3个月左右；

9）出苗管理

将接种桃胚的试管取出，置于22～28℃有散射光的环境中使幼胚萌发成苗。

优选的，所述的步骤5）中，第一次浸泡种子用0.5%的H₂O₂溶液，浸泡时间为10min～3h；第二次浸泡种子用3%的H₂O₂溶液，浸泡时间8min，其他步骤无变化。

优选的，所述的步骤5）中，第一次浸泡种子用0.2%的H₂O₂溶液，浸泡时间为10min～3h；第二次浸泡种子用5%的H₂O₂溶液，浸泡时间5min，其他步骤无变化。

本发明采用上述技术方案具有以下优点：

本发明的技术方案，不仅操作方便，安全环保，还兼顾了种子消毒效率和种仁与种皮的分离效率。

选用中低浓度的H₂O₂溶液作为消毒剂，安全系数高且环境友好,操作简便易行。H₂O₂溶液本身为一种氧化性消毒剂，在消毒过程中分解形成为水和氧气，无毒无害，对环境友好，使用浓度为0.2%～5%的中低浓度，安全系数较高，与70%酒精、次氯酸钠溶液和升汞相比，中低浓度的H₂O₂溶液作用相对温和，对操作人员在时间控制和安全防护上要求不高，操作起来简单方便。

采用梯度浓度H₂O₂溶液处理桃胚，利用幼嫩种皮与胚乳中含有的过氧化物酶催化H₂O₂产生活性氧进行种子上微生物的杀灭，同时反应生成的氧为种子在浸泡过程中提供氧气，避免了长时间无氧呼吸引起胚坏死进而降低出苗率，种子经梯度浓度的H₂O₂溶液处理后，种子处于无菌状态，且种皮种仁更易分离，后续操作简便效率高，便于大规模胚培养应用，很好地兼顾了消毒效率与种仁的高效分离。

具体实施方式

实施例1

1）培养基的制备

制备桃胚培养用WPM培养基，并分装在相应的塑料或玻璃试管至试管的五分之一到四分之一高度，盖上试管塞，高压灭菌后室温冷却备用；

2）果实清洗

成熟的桃果实除去果梗后，用加适量洗涤液的自来水清洗干净；

3）酒精浸泡

桃果实在干净的室内用75%酒精浸泡10～15min；

4）种子的取出

用剪核刀抛开果实，剪开种核，取出种子；

5）种子消毒

①梯度H₂O₂溶液浸泡之低浓度H₂O₂溶液浸泡：种子浸入盛有0.3%H₂O₂溶液的组培瓶中，直至取完实验种子，时间应小于4h；

②梯度H₂O₂溶液浸泡之高浓度H₂O₂溶液浸泡：

操作转移到超净台上，将低浓度的H₂O₂溶液倒出至空烧杯，加入5%H₂O₂溶液，盖上组培瓶盖子，缓慢摇动瓶子5min，使种子浮动与溶液充分接触；此时现象：沉在瓶底的种子加入H₂O₂溶液后，种子表面产生大量小气泡，种子逐渐上浮，周围不断冒小气泡，此过程为H₂O₂分解产生活性氧，活性氧氧化有机质即杀灭微生物的过程；

6）无菌水冲洗

倒出瓶中的H₂O₂溶液，加入无菌水冲洗种子3～4次，最后一次的无菌水不用倒出；

7）种仁剥离与接种

超净台上用镊子稍微夹破胚乳端种皮，用带有无菌手套的母指和食指轻微挤压种子，取出种仁，接种到含有实验用培养基的试管中；

8）低温处理

接种试管置于2～4℃冷库中低温处理3个月左右；

9）出苗管理

将接种桃胚的试管取出，置于22～28℃有散射光的环境中使幼胚萌发成苗。

实施例2

1）培养基的制备

制备桃胚培养用WPM培养基，并分装在相应的塑料或玻璃试管至试管的五分之一到四分之一高度，盖上试管塞，高压灭菌后室温冷却备用；

2）果实清洗

成熟的桃果实除去果梗后，用加适量洗涤液的自来水清洗干净；

3）酒精浸泡

桃果实在干净的室内用75%酒精浸泡10～15min；

4）种子的取出

用剪核刀抛开果实，剪开种核，取出种子；

5）种子消毒

①梯度H₂O₂溶液浸泡之低浓度H₂O₂溶液浸泡：种子浸入盛有0.5%H₂O₂溶液的组培瓶中，直至取完实验种子，时间应小于4h；

②梯度H₂O₂溶液浸泡之高浓度H₂O₂溶液浸泡：

操作转移到超净台上，将低浓度的H₂O₂溶液倒出至空烧杯，加入3%H₂O₂溶液，盖上组培瓶盖子，缓慢摇动瓶子8min，使种子浮动与溶液充分接触；此时现象：沉在瓶底的种子加入H₂O₂溶液后，种子表面产生大量小气泡，种子逐渐上浮，周围不断冒小气泡，此过程为H₂O₂分解产生活性氧，活性氧氧化有机质即杀灭微生物的过程；

6）无菌水冲洗

倒出瓶中的H₂O₂溶液，加入无菌水冲洗种子3～4次，最后一次的无菌水不用倒出；

7）种仁剥离与接种

超净台上用镊子稍微夹破胚乳端种皮，用带有无菌手套的母指和食指轻微挤压种子，取出种仁，接种到含有实验用培养基的试管中；

8）低温处理

接种试管置于2～4℃冷库中低温处理3个月左右；

9）出苗管理

将接种桃胚的试管取出，置于22～28℃有散射光的环境中使幼胚萌发成苗。