一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法

摘要

本发明涉及到一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其具体包括如下步骤：(1)制备断层皮片；(2)分离表皮和真皮；(3)脱细胞处理；(4)交联；(5)病毒灭活；(6)精制；（7）Co-60辐照灭菌。本发明提供的方法得到的脱细胞组织工程材料的细胞毒性稳定，细胞相容性更好。

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法。

背景技术

现代生物医学的发展非常注重以细胞为基础的研究，包括细胞内生物大分子的组成和变化规律。一方面关于分子水平的研究受到重视，另一方面关于细胞与细胞之间的相互关系，组织﹑器官以及机体的赋型和功能的完成，也都是非常重要的研究内容。这样的认识，促使人们更加关注位于上皮或内皮细胞下层﹑结缔组织细胞周围，为组织﹑器官甚至整个机体的完整性提供力学支持和物理强度的物质—细胞外基质。近年来，关于细胞外基质的种类﹑结构﹑功能﹑调控的研究变得非常重要。除了机体的生理功能与细胞外基质的关系不可或缺，细胞外基质在各种疾病的形成和演变中也具有非常重要的作用。因此，细胞外基质的研究已经成为生物医学领域中非常重要的研究方向和研究内容。

脱细胞技术就是通过脱除组织细胞的方法得到无定型的胞外基质，去除组织的移植免疫原性，同时产生空间及保留相应的生化信号，让干细胞或者宿主相容的细胞能够生长并重建组织。

目前国内外常用到的脱细胞方法有机械法、酶消化法、化学去垢剂法等，只要条件控制适度，这些方法均可制备出合乎条件的组织工程材料，但这些方法或多或少会影响胞外基质的生物性能。1﹑未交联型的组织工程材料几乎没有表面张力，力学性能差，尽管有一些工艺中复合了高分子生物材料，增加了组织工程材料的力学性能，但植入人体后，在使用过程中，在极其复杂的人体环境中，受到各种因素的影响，会失去原有的机械强度。而细胞外基质是细胞赖以生存的微环境，基质硬度的增加能影响DNA的复制和表达、影响干细胞的分化方向，促进细胞迁移、改变细胞核的形态。2﹑目前现有脱细胞技术中交联型组织工程材料则是通过一些化学和物理方法改性，增加胞外基质的生物力学性能，通常都是利用胶原蛋白螺旋结构X和Y位置的特殊氨基酸侧链来进行交联，提高脱细胞基质的强度、耐用性和降低免疫性。然而，在交联的同时，更重要的是交联剂本身的毒性及其残留成为影响细胞相容性的一个隐性原因。3﹑另外，在我们产业化研究的过程中发现，脱细胞技术制备的产品，一个主要的问题是细胞毒性不稳定，不易控制。国内已上市产品，未交联型及交联型组织工程材料仍然存在细胞毒性不合格产品，虽然在脱细胞技术制备工艺中已经过磷酸盐缓冲液和纯化水大量洗涤，但仍有细胞毒性。目前几乎所有的生物材料都必须通过相关实验来检测其是否具有良好的生物相容性，以确保生物材料安全地应用于人体组织。其中最常用的就是细胞毒性实验，它也是最敏感的生物学实验之一。细胞毒性实验是指应用体外细胞培养的方法，通过检测材料或者其浸提液对细胞生长情况的影响来评价对细胞的毒性，通过观察细胞形态及数量改变初步判断材料是否具有毒性，是检测生物相容性的一种快速、价廉、重复性好的方法。动物源性生物材料本身所含生物大分子的复杂性，原材料经过复杂的加工过程时，其中还可能添加很多辅助作用的化学试剂,样品的初始污染菌数量、内毒素含量以及酸碱度等，每一环节都有可能产生毒性作用。

理想的脱细胞技术制备的样品，应该具有优越的生物相容性、可降解性及具备一定的机械强度。因此在现有脱细胞制备技术中，怎样解决既要完全脱除细胞等抗原成分，又能最大限度的保留胞外基质等有用成分，在工艺产业化过程中优化脱细胞组织工程材料的机械性能并且保证其良好、稳定的组织相容性，是我们要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，通过该方法制备得到的组织工程材料细胞毒性稳定，细胞相容性更好。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：

一种生物相容性良好的异种脱细胞真皮基质的制备方法，其具体包括如下步骤：

(1)制备断层皮片

取0.1-2.0mm厚的动物断层皮片，裁成长、宽、高所需尺寸，PBS液洗涤，0.1%（质量体积比（质量体积比g/100ml））新洁尔灭去脂，再用PBS液洗涤；

(2)分离表皮和真皮

将步骤(1)得到的断层皮片用0.1%～0.3%（质量体积比g/100ml）的胰蛋白酶的PBS液在4℃-20℃下，浸泡6-36h，依次用乙醇、双氧水和纯水洗涤，洗涤，最后PBS洗涤；

(3)脱细胞处理

将步骤(2)处理后的材料先用0.1～0.5%（质量体积比g/100ml）SDS水溶液洗涤1～6小时，再用水溶性含羟基化合物的水溶液洗涤，然后用纯化水洗涤，最后PBS液洗涤；

(4)交联

将步骤(3)处理后的材料用0.024～0.1mol/L的交联液交联，按每片脱细胞动物皮干重对应215ml交联液反应，反应结束后，用0.1mol/L磷酸氢二钠洗涤，再用纯化水洗涤；

(5)病毒灭活

将步骤(4)处理后的材料用0.2～1.2mol/L氢氧化钠浸泡30～60分钟，纯化水洗涤至中性；

(6)精制

将步骤(5)处理后的材料用乙醇洗涤，再用纯化水充分洗涤；

（7）Co-60辐照灭菌

将步骤(6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌，即得成品。

进一步的，所述的PBS液的配制方法如下：

NaCl8.00g/L；

KCl0.20g/L；

Na₂HPO₄1.56g/L；

KH₂PO₄0.20g/L；

将上述各成分依次溶解于含有800ml水的容量瓶中，补加水至1000ml，混匀。

进一步地，所述步骤(2)中用乙醇洗涤，为40%~75%乙醇（体积分数）洗涤6～12小时，3%双氧水洗涤15分钟。

进一步地，所述步骤(3)中水溶性含羟基化合物包括水溶性氨基酸类、羧甲基壳聚糖或水溶性醇类，浓度为2~10%（质量体积比g/100ml），用水溶性含羟基化合物的水溶液洗涤的洗涤时间为1～6小时。

进一步地，水溶性含羟基化合物的水溶液为乙醇溶液，优选浓度为4%（质量体积比g/100ml），洗涤时间为1～6小时。

进一步地，所述步骤(4)中的交联液通过如下方法配置：以浓度为0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES)水溶液为交联液溶剂，先向其中加入EDC.HCL，然后再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，所述EDC.HCL和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为3：1～8：1，交联液浓度为0.024～0.1mol/L。

进一步地，所述步骤(6)中用乙醇洗涤，浓度为40%（体积分数）。

进一步地，具体步骤如下：

(1)制备断层皮片

取0.1-2.0mm厚的动物断层皮片，裁成长、宽、高所需尺寸，PBS液洗涤，0.1%新洁尔灭去脂，再用PBS液洗涤3-6次；

(2)分离表皮和真皮

将步骤(1)得到的断层皮片用0.1%～0.3%（质量体积比g/100ml）的胰蛋白酶的PBS液在4℃-20℃下，浸泡16-36h，用乙醇洗涤，优选为70%乙醇洗涤6～12小时，3%双氧水洗涤15分钟，然后用PBS洗涤，3～6次，然后再用纯化水洗涤12～24次，隔1小时换液；

(3)脱细胞处理

将骤(2)处理后的材料用0.1～0.5%（质量体积比g/100ml）SDS水溶液洗涤1～6小时，用浓度为3~5%（质量体积比g/100ml）的水溶性含羟基化合物水溶液洗涤，1～6小时，继续用纯化水洗涤12～24次，每隔1小时换液，最后PBS液洗涤12～24次，每隔两小时换液；

(4)交联

将步骤(3)处理后的材料用0.024～0.1mol/L的交联液交联，按每片脱细胞动物皮干重对应215ml交联液反应，于25℃条件下交联4小时，80转/分；反应结束后，用0.1mol/L磷酸氢二钠震荡洗涤，120转/分，洗涤4次，每隔30分钟换液，然后纯化水洗涤4次，120转/分，每隔30分钟换液；

(5)病毒灭活

将步骤(4)处理后的材料用0.2～1.2mol/L氢氧化钠浸泡30～60分钟，纯化水洗涤至中性；

(6)精制

将步骤(5)处理后的材料用40%乙醇（体积分数）洗涤，洗涤12次，每次间隔一小时，然后用纯化水充分洗涤；

（7）Co-60辐照灭菌

用双层铝箔袋包装将步骤(6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌，即得成品。

本发明中用到的新洁尔灭和乙醇浓度为业内常规表示方法。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：

1．本发明的制备方法中，步骤1中清洗血液和其它污垢均采用PBS缓冲液，新洁尔灭对其进行去脂以及病毒的初始灭活。

2．步骤2中不同浓度的胰酶脱细胞液具有不同的渗透压，可能会影响胰酶对基质的透入以及影响到消化后的细胞碎片游离出基质,本发明的制备方法中，采用较低浓度胰蛋白酶低温处理，分离去除表皮细胞，更好的保护了胞外基质的物理性能，而经乙醇处理可通过脱水作用破坏细胞，溶解并去除脂质，可从致密组织上有效去除细胞和致热源，后续利用PBS与纯化水充分洗涤，以除去胰蛋白酶及乙醇残留，确保组织的生物相容性。

3．步骤2完成后，步骤3离子型去污剂SDS的加入使脱细胞效果更彻底，但通过对未交联型脱细胞基质的细胞毒性实验检测,经SDS洗涤后,尽管经过PBS洗涤，仍然有细胞毒性,基质表面的化学元素分析也表明SDS在洗涤后有残留且较难清洗；但本发明提出了使用水溶性含羟基化合物短时间处理及其严格清洗的方法，可做到基质无细胞毒性。

4．通过脱细胞技术可以大大减小异种脱细胞真皮基质的免疫原性，步骤4中采用零交联剂EDC.HCL与NHS联合使用，对基质进行交联，不仅可以进一步屏蔽部分抗原决定簇，还可大大提高材料的生物力学性能，交联过程中，EDC.HCL/NHS不进入材料结构，转变为水溶性脲，细胞毒性很小，且残留易清除,另EDC.HCL较其它碳化二亚胺类更稳定和易溶于水。

5．在步骤5中，对生物材料进行病毒灭活的关键在于彻底进行病毒灭活的同时，最大限度地保留材料的生物活性和结构性质，而对动物源性生物制品来说，原材料需要经过强酸或强碱处理，而实验证明直接对原材料进行酸碱处理，对材料的有效成分破坏严重，而本发明采用先交联后病毒灭活，大大减小了强酸强碱对基质的损伤。在本发明的优选方案中，在4℃条件下，采用氢氧化钠溶液处理30分钟，即可以有效灭活疯牛病病原体，还可以杀灭病毒、细菌等所有病原体，也可以分解微生物死后产生的内毒素，保证产品的安全。

6．在本发明的制备方法中，步骤1～5均经过严格洗涤，但产业化实践证明，一个批次3000片的产量，合格率为90%，依然出现个别样品不合格。所以本发明提出了一种可以彻底清除工艺中未反应残留试剂的方法，在材料经过步骤1～5处理后，采用20~50%的乙醇充分清洗，20~50%的乙醇可以减少介质的电介质绝缘常数，提高氢键的稳定性,不仅使交联好的脱细胞技术制备的组织工程材料能够长时间储存，并且可以有效除去工艺中未反应的残留试剂和组织上的致热源，极大的提高了脱细胞真皮的组织相容性。

附图说明

图1为原料脱细胞前的HE染色图；从图中明显可见大量蓝染，说明有大量细胞存在。

图2为通过本工艺制备所得样品的HE染色图；从图中可见无蓝染，说明原料经过本工艺处理后，细胞脱除干净。

图3为通过本工艺制备所得样品的电镜扫描图片；从图中可见样品纤维上无细胞层覆盖，与HE观察结果一致，纤维层排列规律，纤维保存完好，纤维之间有腔隙存在。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明进行进一步详细的说明。

本实施例和对比例中的磷酸盐缓冲液（PBS液）的制备方法如下：

NaCl8.00g/L；

KCl0.20g/L；

Na₂HPO₄1.56g/L；

KH₂PO₄0.20g/L；

将上述各成分依次溶解于含有800ml水的容量瓶中，补加水至1000ml，混匀。

实施例1

(1)制备断层皮片

取0.6mm厚的猪断层皮片，裁成5*7cm大小，PBS液洗涤三次，0.1%新洁尔灭去脂30分钟，再用PBS液洗涤3次；

(2)分离表皮和真皮

将步骤(1)得到的断层皮片用0.2%（质量体积比g/100ml）的胰蛋白酶的PBS液在20℃下，浸泡16h，70%乙醇洗涤8小时，3%双氧水洗涤15分钟，然后用PBS洗涤，3次，然后再用纯化水洗涤24次，隔1小时换液；

(3)脱细胞处理

将骤(2)处理后的材料用0.3%（质量体积比g/100ml）SDS水溶液洗涤4小时，4%乙醇洗涤4小时，继续用纯化水洗涤12次，每隔1小时换液，最后PBS液洗涤24次，每隔两小时换液；

(4)交联

将步骤(3)处理后的材料用0.05mol/L交联液交联，按每片脱细胞猪皮干重（经实验证明，0.6mm厚5*7cm大小的皮片干重约为0.47g）对应215ml交联液反应，于25℃条件下交联4小时，80转/分；反应结束后，用0.1mol/L磷酸氢二钠震荡洗涤，120转/分，洗涤4次，每隔30分钟换液，然后纯化水洗涤4次，120转/分，每隔30分钟换液；

所述的交联液的配制方法如下：以浓度为0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES)水溶液101ml为交联液溶剂，先向其中加入EDC.HCL0.9681g，然后再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.242g，所述EDC.HCL和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为4：1。

(5)病毒灭活

将步骤(4)处理后的材料在4℃条件下，1mol/L氢氧化钠浸泡30分钟，纯化水洗涤至中性；

(6)精制

将步骤(5)处理后的材料先用40%的乙醇洗涤12次，每次间隔一小时，然后用纯化水充分洗涤；

（7）Co-60辐照灭菌

用双层铝箔袋包装将步骤(6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌，即得成品。

未脱细胞前的HE染色图见附图2，对成品进行HE染色见附图1，两个进行对比可以说明原料经过本工艺处理后，细胞脱除干净。如附图3所示，对成品进行电镜扫描，可见样品纤维上无细胞层覆盖，与HE观察结果一致，纤维层排列规律，纤维保存完好，纤维之间有腔隙存在。

实施例2

(1)制备断层皮片

取0.6mm厚的动物断层皮片，裁成5*7cm大小，PBS液洗涤三次，0.1%新洁尔灭去脂30分钟，再用PBS液洗涤3次；

(2)分离表皮和真皮

将步骤(1)得到的断层皮片用0.15%（质量体积比g/100ml）的胰蛋白酶的PBS液，在4℃下，浸泡30h，40%乙醇洗涤10小时，3%双氧水洗涤15分钟，然后用PBS洗涤3次，然后再用纯化水洗涤24次，隔1小时换液；

(3)脱细胞处理

将骤(2)处理后的材料用0.1%（质量体积比g/100ml）SDS水溶液洗涤6小时，2%乙醇洗涤6小时，继续用纯化水洗涤12次，每隔1小时换液，最后PBS液洗涤24次，每隔两小时换液；

(4)交联

将步骤(3)处理后的材料用0.03mol/L交联液交联，按每片脱细胞猪皮干重（经实验证明，0.6mm厚5*7cm大小的皮片干重约为0.47g）对应215ml交联液反应，于25℃条件下交联4小时，80转/分；反应结束后，用0.1mol/L磷酸氢二钠震荡洗涤，120转/分，洗涤4次，每隔30分钟换液，然后纯化水洗涤4次，120转/分，每隔30分钟换液；

所述的交联液的配制方法如下：以浓度为0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES)水溶液101ml为交联液溶剂，先向其中加入EDC.HCL0.4704g，然后再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.242g，所述EDC.HCL和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为2：1。

(5)病毒灭活

将步骤(4)处理后的材料在4℃条件下，用0.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡60分钟，纯化水洗涤至中性；

(6)精制

将步骤(5)处理后的材料先用20%的乙醇洗涤12次，每次间隔一小时，然后用纯化水充分洗涤；

（7）Co-60辐照灭菌

用双层铝箔袋包装将步骤(6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌，即得成品。

实施例3

(1)制备断层皮片

取0.6mm厚的动物断层皮片，裁成5*7cm，PBS液洗涤3次，0.1%新洁尔灭去脂30分钟，再用PBS液洗涤3次；

(2)分离表皮和真皮

将步骤(1)得到的断层皮片用0.25%（质量体积比g/100ml）的胰蛋白酶的PBS液，在10℃下，浸泡24h，75%乙醇洗涤6小时，3%双氧水洗涤15分钟，然后用PBS洗涤3次，然后再用纯化水洗涤24次，隔1小时换液；

(3)脱细胞处理

将步骤(2)处理后的材料用0.5%（质量体积比g/100ml）SDS水溶液洗涤3小时，10%乙醇洗涤2小时，继续用纯化水洗涤12次，每隔1小时换液，最后PBS液洗涤24次，每隔两小时换液；

(4)交联

将步骤(3)处理后的材料用0.1mol/L交联液交联，按每片脱细胞猪皮干重（经实验证明，0.6mm厚5*7cm大小的皮片干重约为0.47g）对应215ml交联液反应，于25℃条件下交联4小时，80转/分；反应结束后，用0.1mol/L磷酸氢二钠震荡洗涤，120转/分，洗涤4次，每隔30分钟换液，然后纯化水洗涤4次，120转/分，每隔30分钟换液；

所述的交联液的配制方法如下：以浓度为0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES)水溶液101ml为交联液溶剂，先向其中加入EDC.HCL1.936g，然后再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.242g，所述EDC.HCL和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为8：1。

(5)病毒灭活

将步骤(4)处理后的材料在4℃条件下，用1mol/L氢氧化钠浸泡30分钟，纯化水洗涤至中性；

(6)精制

将步骤(5)处理后的材料先用50%的乙醇洗涤12次，每次间隔一小时，然后用纯化水充分洗涤；

（7）Co-60辐照灭菌

用双层铝箔袋包装将步骤(6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌，即得成品。

对比例1

(1)制备断层皮片

取0.6mm厚的动物断层皮片，裁成5*7cm大小，PBS液洗涤三次，0.1%新洁尔灭去脂30分钟，再用PBS液洗涤3次；

(2)分离表皮和真皮

将步骤(1)得到的断层皮片用0.2%（质量体积比g/100ml）的胰蛋白酶的PBS液在20℃下，浸泡16h，然后用PBS洗涤3次，然后再用纯化水洗涤24次，隔1小时换液；

(3)脱细胞处理

将骤(2)处理后的材料用0.3%（质量体积比g/100ml）SDS水溶液洗涤4小时，用纯化水洗涤12次，每隔1小时换液，最后PBS液洗涤24次，每隔两小时换液；

(4)交联

将步骤(3)处理后的材料用0.05mol/L的交联液交联，按每片脱细胞猪皮干重对应215ml交联液反应，于25℃条件下交联4小时，80转/分；反应结束后，用0.1mol/L磷酸氢二钠震荡洗涤，120转/分，洗涤4次，每隔30分钟换液，然后纯化水洗涤4次，120转/分，每隔30分钟换液；

(5)病毒灭活

将步骤(4)处理后的材料在4℃条件下，1mol/L氢氧化钠浸泡60分钟，纯化水洗涤至中性；

（6）Co-60辐照灭菌

用双层铝箔袋包装将步骤(5)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌，即得成品。

对比例2

(1)制备断层皮片

取0.6mm厚的动物断层皮片，裁成5*7cm大小，PBS液洗涤三次，0.1%新洁尔灭去脂30分钟，再用PBS液洗涤3次；

(2)分离表皮和真皮

将步骤(1)得到的断层皮片用0.2%（质量体积比g/100ml）的胰蛋白酶的PBS液在20℃下，浸泡16h，70%乙醇洗涤8小时，3%双氧水洗涤15分钟，然后用PBS洗涤，3次，然后再用纯化水洗涤24次，隔1小时换液；

(3)脱细胞处理

将骤(2)处理后的材料用0.3%（质量体积比g/100ml）SDS水溶液洗涤4小时，4%乙醇洗涤4小时，继续用纯化水洗涤12次，每隔1小时换液，最后PBS液洗涤24次，每隔两小时换液；

(4)交联

将步骤(3)处理后的材料，按4ml/cm²比例用0.25%戊二醛—PBS溶液交联，于25℃条件下静止交联24小时，然后纯化水洗涤7天，120转/分，每隔30分钟换液；

(5)病毒灭活

将步骤(4)处理后的材料在4℃条件下，1mol/L氢氧化钠浸泡30分钟，纯化水洗涤至中性；

(6)精制

将步骤(5)处理后的材料先用40%的乙醇洗涤12次，每次间隔一小时，然后用纯化水充分洗涤；

（7）Co-60辐照灭菌

用双层铝箔袋包装将步骤(6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌，即得成品。

对比例3

(1)制备断层皮片

取0.6mm厚的动物断层皮片，裁成5*7cm大小，PBS液洗涤三次，0.1%新洁尔灭去脂30分钟，再用PBS液洗涤3次；

(2)分离表皮和真皮

将步骤(1)得到的断层皮片用0.2%（质量体积比g/100ml）的胰蛋白酶的PBS液在20℃下，浸泡16h，然后用PBS洗涤，3次，然后再用纯化水洗涤24次，隔1小时换液；

(3)脱细胞处理

将骤(2)处理后的材料用0.3%（质量体积比g/100ml）SDS水溶液洗涤4小时，最后PBS液洗涤24次，每隔两小时换液；

(4)交联

将步骤(3)处理后的材料用0.05mol/L交联液交联，按每片脱细胞猪皮干重（经实验证明，0.6mm厚5*7cm大小的皮片干重约为0.47g）对应215ml交联液反应，于25℃条件下交联4小时，80转/分；反应结束后，用0.1mol/L磷酸氢二钠震荡洗涤，120转/分，洗涤4次，每隔30分钟换液，然后纯化水洗涤4次，120转/分，每隔30分钟换液；

所述的交联液的配制方法如下：以浓度为0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES)水溶液101ml为交联液溶剂，先向其中加入EDC.HCL0.9681g，然后再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.242g，所述EDC.HCL和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量比为4：1。

(5)病毒灭活

将步骤(4)处理后的材料在4℃条件下，1mol/L氢氧化钠浸泡30分钟，纯化水洗涤至中性；

(6)精制

将步骤(5)处理后的材料先用40%的乙醇洗涤12次，每次间隔一小时，然后用纯化水充分洗涤；

（7）Co-60辐照灭菌

用双层铝箔袋包装将步骤(6)处理后的材料密封在生理盐水中，经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌，即得成品。

效果例

对实施例1-3和对比例1-3所得到的成品进行效果比较，具体见下表：

通过上表说明随着加入乙醇量增多，细胞毒性趋向良好，但力学强度下降；加入戊二醛交联剂，能提高其力学强度，但细胞毒性不能保证所有产品均在级以上。

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。