一种促进磷脂酶水解浓缩磷脂的方法

摘要

本发明一种促进磷脂酶水解浓缩磷脂的方法，涉及磷脂改性技术领域。具体涉及一种超声波促进固定化磷脂酶水解浓缩磷脂的方法。此方法中实现了超声波对磷脂的乳化作用和固定化酶水解反应在空间上的隔离，克服了超声波对酶的破坏作用，具有乳化效果好，酶促反应速度快，反应体系中酶易分离和重复利用的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及磷脂改性技术领域，特别是指一种用超声波促进磷脂酶水解浓缩磷脂的方法。

背景技术

磷脂（Phospholipid，PL），是指含有磷酸的脂类，分为甘油磷脂与鞘磷脂两大类，是组成生物膜的主要成分。磷脂是植物油工业化炼制过程中重要的副产品，作为良好的乳化剂，广泛应用于食品、医药、化工和饲料等领域。商品的浓缩磷脂主要自于大豆，是丙酮不溶物含量大于62%的磷脂和植物油的混合物。未经改性的浓缩磷脂的亲水亲油平衡值（HLB）为4左右，常用于油包水型（W／O型）乳化剂。但是许多食品体系需要水包油型（O／W型）乳状液体系，这就使得其应用受到了限制。提高磷脂亲水性的方法包括物理、化学和酶改性等手段。乙醇分级提取可以得到亲水性很好的富含磷脂酰胆碱（PC）的磷脂；羟基化和酰基化也可以提高磷脂的亲水性；磷脂酶可以裂解磷脂分子中的脂肪酸基团来提高其对水溶解性。用于催化磷脂水解的酶主要有磷脂酶A_l、A₂、C和D，其中磷脂酶A₂水解磷脂的2位的脂肪酸基团，生成溶血磷脂和脂肪酸。酶改性方法由于条件温和、产品安全性高和对环境友好等特点正成为很有竞争力的改性方法。

用磷脂酶A₂对磷脂改性研究大致可以分为有机相反应和水相反应两类。有机相反应是在反应过程中添加有机溶剂改善反应体系的粘度加速反应进行。水相反应则是不添加有机溶剂，反应工艺路线短，无须溶剂的回收等工序，有着更好的工业化前景。磷脂酶的水解反应是一个界面反应，反应要经过一个过渡期。浓缩磷脂是一种W／O型乳化剂，属于助界面活性剂，在过渡期内，随着体系内界面活性更强的磷脂水解产物增加，体系中与水形成乳化的磷脂底物开始增加，同时酶反应界面也开始增加，促进了反应速率增大。通常条件下，酶水解反应过程需要较长的反应时间和有效的分散手段，需要持续7小时以上才能达到需要的反应效果。

很多实验表明，超声波可以明显促进磷脂酶水解反应进行，缩短反应时间。超声波过程中形成的瞬态空化泡可以产生高温和空压，导致自由基形成及产生强大冲击波和射流，降低胶体溶液的表面张力和黏度，促进了乳化作用。超声乳化可以起到机械乳化无法实现的乳化效果，在合适的超声条件下形成的乳液平均尺寸小至0.2～2μm，接近微乳液特征，可以增加水解所需的酶反应界面，同时超声振荡加速了底物与酶的接触和产物的释放，即加强了传质，这些因素大大促进了反应的进行。

然而酶反应时所采用的超声波声功率不宜过大，否则会造成酶失活。但是低功率的超声波对较高浓度的磷脂起到乳化效果不理想，限制了酶解反应速率的提升。这些缺陷大大限制了超声波在促进磷脂酶水解浓缩磷脂上的应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服已有技术存在的问题，提供一种有效的超声波辅助磷脂酶水解浓缩磷脂工艺。

为了实现上述发明目的，其具体的技术方案如下：

1、磷脂酶A₂的固定化

（1）将海藻酸钠在35~40℃水浴中保温溶解，

（2）同时将壳聚糖在5%（v/v）的醋酸溶液于35~40℃水浴中保温溶解，完全溶解后，加入CaCl₂溶液，充分混匀。

（3）将稀释磷脂酶加入海藻酸钠溶液中，搅拌均匀，静止一段时间。

（4）缓慢将磷脂酶溶液滴加入到壳聚糖醋酸-CaCl₂混合溶液中，快速搅拌，形成光滑的微胶囊球。

（5）再加入戊二醛溶液，同时快速搅拌，将其置于4℃固定化一定时间。

（6）将微胶囊以pH8.0NaHCO₃、0.1mol/LNaCl、0.1mol/LpH5.5NaAc、pH8.0Tris-HCl顺序洗涤后，进行冷冻干燥，备用。

2、将超声探头置于杯型超声腔中，超声腔进出口通过两条管道与固定化酶杯连接，物料的定向循环流动由安装在进口管道上的蠕动泵完成，固定化酶杯的温度由恒温器控制。

3、在固定化酶杯中加入固定化酶，在反应体系中加入含有10~20%磷脂的缓冲溶液（0.5mol/LTris，CaCl₂0.2mol/L，pH值5.5~7.5），调整恒温器使反应温度为50~55℃，打开逆流超声设备的超声波发生器（功率400~800W），打开蠕动泵，使物料在杯型超声腔和固定化酶杯中循环流动，定时取样测定释放脂肪酸量。

本发明的优点：通过在超声促进磷脂酶解过程中使用固定化酶技术，使得超声乳化作用和酶解反应在空间上分离，一方面避免了常规方法中高功率超声下酶失活的问题，可以大幅度提高反应速率（20min脂肪酸的释放量增加了32.9~81.1%），缩短反应时间，另一方面固定化酶可以重复使用，大大降低酶的使用成本，同时避免了后续产物中酶残留的问题提高了产品的质量。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为逆流超声设备结构示意图

1为超声波控制器，2为聚能式超声波探头，3为超声杯型腔，4为蠕动泵，5为固定化酶杯，6恒温器。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是，对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例和对照中采用标准滴定法测定游离脂肪酸释放量。

取1mL0.5mol/LTris-HCl缓冲液，加水稀释，分别加入0、10、20、30、40和50μL的亚油酸标准样，震荡摇匀。转入小烧杯中，加水至30mL，用已标定的NaOH滴定至pH=9.5。以耗碱量为x轴和亚油酸含量为y轴绘制标准曲线。取反应20min时的反应液加水稀释至30mL，用已标定的NaOH滴定至pH=9.5，读取消耗碱的体积数，根据标准曲线算出反应液中游离脂肪酸量。

对照：

在反应体系中加入含有20%的磷脂的缓冲溶液（0.5mol/LTris，CaCl₂0.2mol/L，pH值6），调整恒温水浴器使反应温度为50℃（对照1）或55℃（对照2），加入磷脂酶A₂，机械搅拌。

实施例1~6：

1、固定化酶的制备

称取海藻酸钠在40℃水浴中保温溶解（m/v为2.5%），同时称取壳聚糖在5%（v/v）的醋酸溶液于40℃水浴中保温溶解（m/v为2.5%），再向完全溶解的壳聚糖醋酸溶液中加入0.25mol/LCaCl₂溶液，充分混匀。用移液枪准确移取1mL酶液于10mL海藻酸钠溶液中，搅拌均匀，静止一段时间后，用灭菌后的10mL注射器以约5滴/s的速度将其注入10mL壳聚糖醋酸-CaCl₂混合溶液中，以转速180r/min搅拌，形成光滑的微胶囊球，再加入0.4%（v/v）戊二醛，同时快速搅拌，将其置于4℃环境固定化2~3小时。将微胶囊以pH8.0NaHCO₃、0.1mol/LNaCl、0.1mol/LpH5.5NaAc、pH8.0Tris-HCl顺序洗涤后，进行冷冻干燥，备用。

2、安装设备（主要由聚能式超声探头、杯型超声腔、蠕动泵、固定化酶杯和恒温器等组成），将超声探头置于杯型超声腔中，超声腔进出口通过两条管道与固定化酶杯连接，物料的定向循环流动由安装在进口管道上的蠕动泵完成，固定化酶杯的温度由恒温器控制（如附图1所示）。图1为逆流超声设备结构示意图，1为超声波控制器，2为聚能式超声波探头，3为超声杯型腔，4为蠕动泵，5为固定化酶杯，6恒温器。

3、在固定化酶杯加入固定化酶（酶活与对照组一致），在反应体系中加入含有磷脂的缓冲溶液，调整恒温器恒定反应温度，打开逆流超声设备的超声波发生器，打开蠕动泵，使物料在杯型超声腔和固定化酶杯之间循环流动，20min取样测定释放脂肪酸量。

其中超声辅助固定化磷脂酶A₂水解磷脂的工艺参数如下：

采用超声设备为逆流式的超声设备，超声功率为400~800W，反应温度为50~55℃，蠕动泵转速为200r/min，磷脂的浓度为20%，缓冲溶液为pH为（0.5mol/LTris，CaCl₂0.2mol/L，pH值6.0）。

实施例1~6的超声处理参数及结果如下所示：

反应温度℃超声功率W脂肪酸量μmol/gPL增幅对照15028.9实施例15040038.432.9%实施例25060041.543.6%实施例35080046.661.2%对照25534.4实施例45540046.836.0%实施例55560053.655.8%实施例65580062.381.1%