一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法

摘要

本发明涉及一种重组酶复合物，该重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec同源重组酶，包括RecE、RecT和Gamma蛋白。本发明还提供了一种体外同源重组无缝克隆的方法，只需将两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在该重组酶复合物的催化下，高效率地将目标DNA定向克隆到任意载体的任意位点，克隆阳性率可高达95％以上。本发明的方法尤其适用于DNA大片段的克隆。本发明弥补了传统克隆方法操作繁琐、费时、失败率较高等缺陷，可以为DNA体外重组提供一种快速便捷高效的克隆方法，在细胞学基础研究和工农业生产、医药保健等方面奠定重要的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及的是分子生物学中的DNA重组技术，具体涉及的是一种体外同源重组的核酸分子克隆方法及一种重组酶复合物。

背景技术

现代生物学研究在很大程度上要依赖于重组DNA技术。细胞内发生的DNA重组现象，称为体内重组。由于新技术的发展，现在可以由人工操作在细胞外进行DNA重组，称为体外重组。

通过DNA的重组获得基因的克隆是研究基因的结构、功能及演化的基础。基因克隆技术，又被称为分子克隆技术、重组DNA技术、基因工程、基因操作或基因的无性繁殖等。在整个基因克隆的过程中，DNA的重新组合是一个十分关键的步骤，它直接决定着整个克隆的成功与否。随着时间的推移，研究的深入，越来越多的DNA重组方法被应用到生产和科研当中。

传统的酶切-连接经典克隆方法产生于20世纪70年代初，是最早应用的基因克隆方法，是比较通用且常用的方法，一直沿用至今。但是在实际的实验过程中，这种方法的步骤显得较为繁琐费时，需要根据克隆基因序列选择不同的内切酶使用，成本较高。且部分富含特殊回文序列的基因克隆常因无合适内切酶位点而失败。

因此开发一种操作简便高效快速的体外重组克隆技术以替代传统的酶切连接方法具有重要意义。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供了一种重组酶复合物，该重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec同源重组酶，包括RecE、RecT和Gamma蛋白，其中Gamma蛋白的NCBIGeneID:8183641。

进一步地，RecE、RecT和Gamma蛋白三种重组酶的含量比例为1:1:2。

本发明还提供了一种体外同源重组无缝克隆的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一：制备线性化克隆载体；

步骤二：制备插入片段PCR产物，通过在引物5’端引入该线性化克隆载体的末端同源序列，使得该插入片段PCR产物的5’端和3’端分别带有和该线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列；

步骤三：将步骤一中获得的线性化克隆载体与步骤二中获得的插入片段PCR产物在该重组酶复合物的作用下进行重组反应；

步骤四：将步骤三中获得的重组产物进行细胞转化，获得转化细胞；

步骤五：将步骤四中获得的转化细胞进行培养，并进行克隆鉴定，得到经克隆鉴定为阳性的重组DNA分子。

进一步地，步骤一中，该线性化克隆载体通过限制性内切酶酶切或反向PCR扩增获得。

进一步地，限制性内切酶酶切是单酶切或双酶切。

进一步地，采用反向PCR扩增的方法时，使用高保真聚合酶对预线性化的克隆载体进行扩增。

进一步地，步骤二中，引物的设计方式如下：

正向扩增引物设计方式：

5’—上游载体末端同源序列+基因特异性正向扩增序列—3’；

反向扩增引物设计方式：

3’—基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列—5’。

进一步地，引物中同源序列的长度为15bp～20bp。bp意为碱基对，用于表示DNA分子的长度。

进一步地，步骤三中，当插入片段PCR产物大于等于5kb时，线性化克隆载体与插入片段PCR产物摩尔比为1:10。kb意为千碱基对，用于表示DNA分子的长度。

进一步地，步骤三中，当插入片段PCR产物小于等于2kb时，线性化克隆载体与插入片段PCR产物摩尔比为1:2。

根据上述步骤，经过PCR阳性菌落培养后提取的质粒鉴定，证实本发明中目标DNA在该重组酶复合物的催化下，在体外能简捷高效地定向克隆到所需载体中。所谓简捷高效是指在重组酶复合物的催化下，仅需反应30分钟即可进行转化，完成定向克隆，克隆阳性率可达95％以上。本发明中的重组酶复合物首先根据大量文献支持来确定完成重组实验需要具备的功能活性，再筛选实验相应功能的活性酶，再通过大量功能验证来确定从功能以及表达成本上都符合长远开发的活性酶。重组酶复合物中酶的比例是通过各种酶实现各自功能的基本用量，并在此基础上通过大量的相近比例平行实验，来确定最优化体系。本发明弥补了传统克隆方法操作繁琐、费时、失败率较高等缺陷。本发明的意义在于可以为DNA体外重组提供一种快速便捷高效的克隆方法，在细胞学基础研究和工农业生产、医药保健等方面奠定重要的基础。

附图说明

图1是本发明中体外同源重组无缝克隆的方法的流程示意图；

图2是本发明一个较优实施例中进行菌落PCR验证的DNA电泳图结果。

具体实施方式

本发明中的体外同源重组无缝克隆的方法包括以下步骤：

步骤一：制备线性化克隆载体

步骤二：制备插入片段PCR产物

步骤三：重组反应

步骤四：重组产物转化

步骤五：克隆鉴定

步骤一中的线性化载体可通过限制性内切酶酶切包括单酶切或双酶切，或反向PCR扩增获得。

1.酶切制备线性化克隆载体

使用双酶切，线性化完全，转化背景即假阳性克隆低。

2.反向PCR扩增制备线性化克隆载体

当待克隆序列存在大量重复序列而无法通过PCR制备，可以通过高保真聚合酶对预线性化的质粒载体进行扩增，两端添加待克隆序列同源片段，若PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。

克隆载体酶切产物或PCR扩增产物DNA纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段例如大于等于5kb的克隆时，推荐使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高DNA纯度并去除一部分未线性化的环状载体(其电泳位置不同于线性化克隆载体)。不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表1。

表1：线性化克隆载体的使用方式

步骤二中插入片段PCR产物的制备包括引物设计和PCR扩增。

1.设计扩增引物

引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列，其长度为15bp～20bp。

正向扩增引物设计方式：

5’—上游载体末端同源序列+基因特异性正向扩增序列—3’

反向扩增引物设计方式：

3’—基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列—5’

基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；

上游/下游载体末端同源序列为线性化克隆载体最末端序列(用于同源重组)。

2.插入片段PCR扩增

插入片段推荐使用高保真聚合酶进行扩增，以减少扩增突变的引入。无需考虑产物末端有无A尾，重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现。

PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。

PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行大于等于5kb的较大片段的克隆实验时，推荐使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表2。

表2：扩增产物推荐使用方式

步骤三中包括配制反应体系和重组反应。

1.于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

重组反应体系中使用的重组酶复合物RecE、RecT和Gamma蛋白之比为1:1:2(命名为HieffCloneEnzyme)；最适克隆载体使用量为0.03pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)

最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)

2.重组反应

1)体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡，勿剧烈震荡或者涡旋混匀。

2)置于37℃反应30min。

3)待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

4)反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

步骤四中重组产物的转化和涂板包括以下四步

1)取10μl冷却反应液，加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。

2)42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2min。

3)加入450μlSOC或LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。

4)取100μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。

步骤五中克隆鉴定的最方便快捷的方法是菌落PCR。

用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20～50μlLB培养基中混匀，直接取1μl作为PCR模板。推荐至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。

将PCR阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜，提取质粒做后续的鉴定。

根据上述步骤，经过PCR阳性菌落培养后提取的质粒鉴定，证实本发明中目标DNA在添加有独特重组增强因子的重组酶复合物的催化下，在体外能简捷高效地定向克隆到所需载体中。

以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例：效应蛋白BepC真核表达质粒构建

BepC蛋白的核酸序列为：

ATGTTAGAGCATAATTATTTTTATAAAAACAGCGCAACACTGAAGAATAAACATGGCATAAAAAACCCGCGAAAACTGTATGAACGCTGTGCTCATGAGACAGCCAGAGAGGCTGTAAATTTTCGCCTTGAACCGCCACCAGGGAAATTTGATGCCGCTTATCTAAGGACAATTCACTGGTGCCTTTTCCATAAAACTTTTGAATGGGCCGGTGTTACCCGAGATCAGCCCTTTACATTTGAAGATGGCAGCACTGCATGTATGCCAGCTATGCGACCAAAAGGTTATAAGGTTCCTTTTGCTGTCGGTTCACAAATTCAAAGAGAGCTTAAAAAATTAGAACAAAGACTAACCGCGAAGAATAATTTACAAGGCTTATCGCGCCAAGAATTTGCTGCAAATGCTGCTGAAGTTTTTACAGCTCTCGACCACGCGCATCCTTTCAGAAAAGGCAATGGGCGCACACAACGAATGTTTATGGAAAAACTCGGACAAGCGGCAGGCTATAAGATTGATTTTTCTTTGATCACAAAAGAACGCATGACATATGCCAGCATTGAAGCAATGCAACATAACAATCCAGAACCCATGAAAGATCTTTTTGAGGATATCACTCACCCTCAAAAATCCCTTCTTTTAAAGGAATTTATCTCTCAGATGAGAAGCGCTAGACTTGATGAAATTAACAATCATATTGTTTTGGCAGCAAAAGAAGGTGTGACCTATGATGGCATTTATAAAGGTTCTTCAGCTGAAGGTTTTGTTATAGAAGTAGAAGGTGGCACTTTCATCGTCGGGCACAAAGATGATCTTAAGCCAGAGCAAGTGAAAATATTACAGAATGGTGATTTCATCTCCTTTCAGAAAAACAATGTTCAAAACATGAGAGAAACACTTATCCCAAGCGAGATATTAGCGCCTCTCACCAATGAGATCCTTGCCGAAAGGCTCGTAAACCATTGTGGGGTTGAATCATACCGCCATGAAGTCGAGTGTTTATCAAAAATTGTTTATGGCAACACACAAGCATTAAGCCAAATGATTGAGACAATCAACATAGATCCAAGTTTAGGCGAACAGTTTGTCGATCACATTATCCAAAATCCTAAATCAGTTGGTAAGCTTGCCGGGAAAAAAATCCTGGGTCTAAGAAGCCCAGCGCGCAAACGTGCGGAAGAAACTGTTTCACAGCTTAGTGACACACTTAAAAGTTATGCCGATATAGCACATCAGACCATGGCTGACATCATAGAGCAACACTCAAAAGAACAAAGACGCACAGCGCGCTCTGTCGAAAATCCCGGGAAAGACTTGCAAAACCTTTTTGCCTTGTTCCCAGAACAACAAAGAGAAGCCTTGTCTCATTCCCCTACGCTGCAACAACAACTCCATCGTTTTTCGCGTCAATTGCAAAATCGTTTATCATCAGAGGAGCGTCGAGCCATACAAGAAAACGATTGCACAAGACTTTCTTGTCTGCTTGGTGTATCGGCAAGCAAAGCAAAAGACATTGCTCAAATTGTGAAGCATACCAAAGAGGCACAATGTCAGATGCGTACCCTTAAAGTCTGCCGCTCCGCATCGATGGCTCTGACCAGCTAA

表达质粒为pCDNA4.0/TO-Strep，其多克隆位点经BamH1与Xho1双酶切后序列为：

GCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG*********CGCCCAAATTTGCCCGGGAGCT其中*********代表质粒骨架序列。

根据同源克隆技术设计的PCR引物为：(下划线部分代表同源重叠区)

上游：5’AACCATGGCTCGAGCGGATCCATGTTAGAGCATAATTATT3’

下游：5’GGGTTTAAACGGGCCCTCGAGGCTGGTCAGAGCCATCGATGC3’

PCR条件：95℃预变性5分钟，随后32循环：95℃30秒，56℃40秒，72℃30秒，最后延伸5分钟。产物经切胶回收后定量，将PCR产物与线性化载体按照摩尔比2：1进行混合。在20ul总体积中加入4μl缓冲液及2μl重组酶，37度孵育30分钟，随后将10μl反应液加入100μl感受态细胞中，进行化学转化。16小时后随机挑取10个克隆进行菌落PCR验证，引物同上，结果如图2所示：挑取的10个克隆均成功插入了待克隆片段。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。