与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白LT-α

摘要

本发明公开了一种与庚型肝炎病毒相互作用的人类蛋白LT-α，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示，编码人类蛋白LT-α的基因的核苷酸序列SEQ？ID？NO：2所示；其是利用第四代酵母双杂交的方法通过庚型肝炎病毒E2蛋白对人类T淋巴细胞cDNA文库进行筛选，获得与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白，并通过免疫共沉淀的方法对互作蛋白进行阳性验证；本发明可为研究庚型肝炎病毒与HIV-1病毒之间的作用机制提供一定的理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及庚型肝炎病毒对HIV-1抑制作用中相互作用蛋白的研究方法和基因工程领域，具体地说，涉及一种与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白LT-α。

背景技术

鉴于庚型肝炎病毒(GBVirusC,GBV-C)本身无致病性，但与HIV-1共感染有益于延缓HIV-1患者病程的特点，阐明GBV-C抑制HIV-1的作用机理将是GBV-C应用于HIV-1疾病治疗中亟待解决的关键科学问题。综合国内外研究进展，GBV-C对HIV-1的抑制作用主要包括以下几方面：（1）GBV-C的包膜糖蛋白E2通过与HIV-1Gp41的结合阻碍HIV的入胞。（2）GBV-CNS5A区的短肽可能通过抑制T细胞中HIV-1辅助受体CCR5和CXCR4的表达，阻碍HIV-1入胞。（3）GBV-C通过降低T细胞中FAs蛋白的表达，影响了FAs诱导的细胞凋亡途径，提高了CD4⁺T淋巴细胞数，延缓了HIV-1患者的病程。（4）GBV-C通过增强T细胞中Th1型细胞因子IL-2和IL-12的表达，进而抑制了Th2型细胞因子IL-4、IL-13和IL-10的表达，最终阻碍了HIV--1复制。（5）GBV-C通过降低T细胞信号传导途径中LCK蛋白的表达，降低T细胞的活性，导致CD38、CD69、CD25和CCR5分子的表达明显下降，影响HIV-1的复制。（6）目前，研究发现GBV-CE2蛋白还可通过阻碍HIV-1GAG蛋白组装和释放来抑制HIV-1的复制。以上研究为阐明GBV-C与HIV-1的相互作用机理奠定了基础。然而，目前这些研究都具有一定的片面性。因此，GBV-C抑制HIV-1的作用机理仍无明确的定论。

确定病毒与共用宿主间直接作用的蛋白及其功能是研究两病毒间相互作用机理的关键环节。目前GBV-C抑制HIV-1增殖的作用机理研究主要集中在GBV-C阻碍了HIV-1入胞过程和改变了T细胞活性两大方面，尽管已有文献报道GBV-C的包膜糖蛋白E2和NS5A短肽可以抑制HIV-1复制，但究竟GBV-CE2蛋白与其共用宿主上的哪些靶蛋白直接相互作用，从而阻碍了HIV-1入胞、影响了T细胞活性等效应的产生，这些靶蛋白的功能又如何，目前仍不明确。因此，展开这些靶蛋白的相关研究对揭示GBV-C与HIV-1互作机制有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白LT-α。

为了实现本发明目的，本发明提供一种与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白LT-α，所述人类蛋白LT-α的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

所述蛋白LT-α为淋巴毒素α，也被称为肿瘤坏死因子β（TNF-β)，与肿瘤坏死因子A(TNF-α)及淋巴毒素β(LT-β)同属于肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor，TNF)家族。人LT-α基因定位于第6号染色体，LT-α分子由205个氨基酸残基组成，含34个信号肽，成熟型LT-α分子为171个氨基酸残基，相对分子质量为25000。LT-α属于肿瘤坏死因子家族，是细胞活素类物质，可以调节炎症免疫反应，从而影响细胞凋亡分化。LT-α在HIV-1感染的CD4⁺细胞中能够活化或诱导NF-κB，NF-κB结合于HIV-1的长末端重复序列（LTR）的增强子部位，进而活化HIV-1基因，可能与HIV-1的发病有关。

本发明另一目的是提供编码上述人类蛋白LT-α的基因，其核酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明还提供含有上述人类蛋白LT-α基因的载体。

本发明还提供含有上述人类蛋白LT-α基因的工程菌。

本发明进一步提供筛选与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白LT-α的方法：利用第四代酵母双杂交的方法通过庚型肝炎病毒E2蛋白对人T淋巴细胞cDNA文库进行筛选，获得与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白，并通过免疫共沉淀的方法对互作进行阳性验证，从而筛选得到与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白LT-α，所述人类蛋白LT-α的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，包括以下步骤：

（1）编码庚型肝炎病毒蛋白E2基因的克隆与鉴定：从7型庚型肝炎病毒株中提取RNA，获得RNA后，再用逆转录的方法得到cDNA，再通过普通PCR、琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析鉴定目的片段；

（2）含有庚型肝炎病毒E2蛋白目的片段的诱饵质粒载体的构建：回收目的片段，酶切后与pGBKT7连接，并转化入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，即构建得到可表达BD-Bait融合蛋白的质粒；

（3）人T淋巴细胞cDNA文库的构建；

（4）可表达AD-Library/prey融合蛋白的质粒：构建于pGADT7的人T淋巴细胞cDNA文库，购自Clontech公司；

（5）用第四代酵母双杂交的方法筛选人T淋巴细胞cDNA文库中与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的候选蛋白；

（6）用免疫共沉淀的方法进一步验证阳性互作蛋白，从而筛选得到与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白LT-α。

其中，步骤（6）具体为：将步骤（5）中获得的候选蛋白与庚型肝炎病毒的E2蛋白分别构建到pflag-cmv2和pcDNA3.1/myc-His(-)A上，与不同tag标签形成融合蛋白，然后用X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent脂质体转染法共转染人胚胎肾细胞HEK239，48-72h后裂解细胞，与ANTI-FLAGM2AffinityGel孵育沉淀，最后通过Westernblot检测分析阳性互作的结果。

具体地，本发明的一种筛选与庚型肝炎病毒相互作用的人类蛋白LT-α的方法，包括以下步骤：

1、庚型肝炎病毒E2基因的克隆与鉴定

所述庚型肝炎病毒E2蛋白从7型庚型肝炎病毒株中提取RNA，获得RNA后，再用RT-PCR的方法得到cDNA，再通过普通PCR、琼脂糖凝胶电泳及序列测定，序列比对分析鉴定目的片段；

2、庚型肝炎病毒E2蛋白构建诱饵融合蛋白

将上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离进行回收，对PCR产物和质粒载体进行双酶切，并回收纯化线性酶切产物；将载体和目的片段按1:4的摩尔比进行连接，16℃过夜。连接产物转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，与抗性培养基上鉴定阳性克隆；挑取单克隆培养基中扩大培养后，提取重组质粒，经过PCR、双酶切和测序鉴定后，确定为庚型肝炎病毒E2基因构建的BD-bait融合蛋白质粒，最后转化酵母鉴定庚型肝炎病毒E2蛋白重组子的自激活和毒性，即可用于后续的实验；

3、从ClonTeCh公司购买的人T淋巴细胞cDNA文库，构建与pGADT7载体上；

4、分别将诱饵和文库转到酵母双杂交系统的两种酵母中，然后再杂交进行文库筛选；诱饵转化使用的酵母为Y2HGold酵母株，文库转化使用的酵母为Y187酵母株，报告基因系统为：-His、-Ade、AUR1-C、MEL1；

（1）制备酵母感受态细胞

A、取小部分冻存的酵母细胞在YPDA琼脂平皿上划线培养(若划线前已解冻，涡旋，以保证酵母细胞均匀分布)，倒置平皿，30℃温育至菌落出现(约3d)；

B、挑取单菌落(≤4w，2-3mm)，接种5mLYPDA液体培养基于15mL无菌离心管中，30℃振荡培养12h；

C、取100μl培养物于含有50mLYPDA的250mL烧瓶中，30℃，250rpm振荡培养4-6h，OD600应达到0.6；

D、3000rpm室温离心5-10min，弃上清，加入30mL无菌去离子水重悬细胞沉淀；

E、3000rpm室温离心5-10min，弃上清，加入1.5mL1.l×TE/LiAC溶液重悬细胞，高速离心12000rpm，15s；

F、弃上清，600μL1.1×TE/LiAC溶液重悬细胞，即为感受态细胞；

（2）转化baiT和prey于感受态细胞

A、分别取0.1μgbaitT和prey质粒DNA，5μL(0.lmg)CarrierDNA至无菌的1.5mLEP管中，混匀，加入50μL酵母感受态细胞，涡旋混匀；

B、加入0.5mL无菌1×PEG/LiAC混匀，30℃温育30min，每10min混匀一次；

C、加入20μLDMSO，轻轻颠倒混匀，42℃水浴热激15min每5min摇一次；

D、高速离心12000rpm、15s，弃上清；加入1mLYPDA，30℃，250rpm振荡培养1-2h；

E、高速离心12000rpm，15s，用0.9%的NaCl重悬细胞，取300μL涂于相应营养缺陷型的SD平皿。

（3）阳性克隆的筛选

实验所用酵母双杂交系统共有四个报告基因，即-His、-Ade、AUR1-C、MEL1，因此筛选的最终结果最终确定阳性克隆应该可以同时将这四个报告基因的表达激活，文库筛选过程首先将分别转化了baiT和prey质粒DNA再进行杂交后的菌液在加有α半乳糖苷酶（α-Galactosidase)显色底物X-α-Gal和抗真菌金担子素Aba的双缺培养基上初筛，这一步筛选所得到的克隆时既可以生长也可以变蓝的菌落，理论上认为是由于蛋白质之间的相互作用而激活了两个报告基因AUR1-C、MEL1的表达；经过第一轮的筛选得到的阳性克隆继续划线培养在含X-α-Gal和Aba的四缺培养基(既SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu)上。在四缺培养基上仍能很好生长的菌落被认为激活了-His、-Ade基因的表达，这些菌落被认为是初步筛选得到的阳性结果。

（4）阳性克隆插入片段的测序分析

提取所有阳性克隆酵母菌株的质粒，电击法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化后菌液涂布到LB+Amp的平板，以筛选文库AD质粒，由于表达诱饵蛋白的质粒是kana抗性，而表达猎物蛋白的质粒是Amp抗性，就可以筛除诱饵质粒，而只保留猎物质粒。每个板上至少挑出10个单克隆，菌落PCR检测去除重复后提取质粒，测序并进行序列分析；

（5）阳性克隆结果的验证

将上述序列分析得到的阳性蛋白分别与庚型肝炎病毒E2蛋白一对一共转化到Y2HGold酵母菌株中，进行酵母双杂交以确认其相互作用；

（6）阳性互作蛋白通过免疫共沉淀实验的进一步验证

将获得的阳性蛋白与庚型肝炎病毒E2蛋白分别构建到pflag-cmv2和pcDNA3.1/myc-His(-)A上，与不同tag标签形成融合蛋白，然后用X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent脂质体转染法共转染人胚胎肾细胞HEK239，48-72h后裂解细胞，与ANTI-FLAGM2AffinityGel孵育沉淀，最后通过Westernblot检测分析阳性互作的结果。

本发明提供一种与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人体蛋白，为研究庚型肝炎病毒与T淋巴细胞间的相互作用机制提供了一种新的研究方法，为研究庚型肝炎病毒与艾滋病毒之间的作用机制奠定了基础。本发明具有以下优点：

1、确定性：针对传统研究庚型肝炎病毒与T淋巴细胞之间的相互作用，以及庚型肝炎病毒与HIV之间的作用机制中存在最大的问题，即由因果之间各通路链条的“黑盒子”而导致的不确定性，本发明直接从现象产生的最根本原因入手，获得一定的结论；

2、高效性：通过酵母双杂交进行的文库筛选和验证即可获得一些阳性互作蛋白，结果明确且易于分析；

3、实用性：酵母双杂交的方法对比于比较分析法和组学技术更为成熟和简单，更易于操作；

4、广泛适用性：本发明方法可以用于任何病毒与宿主蛋白间的相互作用研究。

附图说明

图1为本发明验证目的蛋白是否能使用此酵母双杂交筛选体系及自激活结果，即pGBKT7空载体及pGBKT7-E2质粒分别转化到酵母在SD/-Trp及SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu平板上生长结果；图中A为pGBKT7空载转化到酵母在SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu平板上未长出菌落，B为pGBKT7空载体转化到酵母在SD/-Trp平板上长出菌落，C为pGBKT7-E2空载转化到酵母在SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu平板上未长出菌落，D为pGBKT7-E2空载体转化到酵母在SD/-Trp平板上长出菌落；

图2为本发明通过酵母双杂交验证文库筛选的阳性蛋白结果，图中BD-P53/AD-T为阳性对照；BD-Lam/AD-T为阴性对照；BD/AD-LTα为pGBKT7空载体与pGAD-LTα共同转化酵母菌落图；BD-E2/AD-LTα为pGBK-E2与pGAD-LTα共同转化酵母菌落图；SD/-2为SD/-Trp/-Leu两种营养缺陷型培养基；SD/-4为SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu四种营养缺陷型培养基；SD/-4/X-gal为SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu四种营养缺陷型培养基加入抗真菌金担子素Aba及X-α-gal；

图3为本发明实施例中通过免疫共沉淀实验验证庚型肝炎病毒E2蛋白与人的LT-α蛋白的体内相互作用；其中A图为全细胞裂解液（input）对照组，B图为蛋白LT-α与E2蛋白实验组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1：筛选与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白

1、庚型肝炎病毒E2基因的克隆鉴定

分析目的基因片段序列和连接载体的多克隆位点信息，设计引物：5’端引物pGBKT7-E25’-CCGGAATTCGGCGCCCCGGCCTCGGTGCTAG，下划线部分为EcoRⅠ酶切位点；

3’端引物pGBKT7-E23’-ACGCGTCGACCCTGCCCGAGGAGAGCCATGCGAAC，下划线部分为SalⅠ酶切位点；

对庚型肝炎7型病毒株cDNA进行PCR扩增获得基因片段，50μlPCR体系：上游引物1μl、下游引物1μl、rTaq混合液25μl、ddH₂O21μl、模板2μl；PCR条件：94℃预变性5min，35个循环；94℃30s，50℃30s，72℃2min，最终延伸72℃7min；将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。

2、诱饵质粒载体的构建

将上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳跑胶后回收，用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切同时分别消化目的片段和质粒载体pGBKT7，并回收纯化线性酶切产物。将载体和目的基因按照1:4的摩尔比进行连接反应，16℃过夜。连接产物转化如大肠杆菌JM109感受态细胞，连接产物转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，与抗性培养基上鉴定阳性克隆。挑取单克隆培养基中扩大培养后，提取重组质粒，经过PCR、双酶切和测序鉴定后，确定为庚型肝炎病毒E2基因构建的BD-bait融合蛋白质粒，最后转化酵母鉴定庚型肝炎病毒E2蛋白重组子的自激活和毒性，即可用于后续的实验。

3、文库筛选

用酵母双杂交的方法筛选人T淋巴细胞cDNA文库中与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的候选蛋白；本发明中以E2蛋白作为Bait连接到载体pGBKT7上构成BD-Bait，而文库蛋白则作为prey构建AD-prey/Library。分别转化到酵母菌株Y2HGold酵母株和Y187酵母株，报告基因系统为：-His、-Ade、AUR1-C和MEL1。

（1）制备酵母感受态细胞

A、取小部分冻存的酵母细胞，在YPDA琼脂平皿上划线培养(若划线前已解冻，涡旋，以保证酵母细胞均匀分布)。倒置平皿，30℃培养至菌落出现(约3d)；

B、挑取单菌落(≤4w，2-3mm)，接种5mLYPDA液体培养基于15mL无菌离心管中，30℃振荡培养12h；

C、取100μl培养物于含有50mLYPDA的250mL烧瓶中，30℃，250rpm振荡培养4-6h，OD600应达到0.6；

D、3000rpm室温离心5-10min，弃上清，加入30mL无菌去离子水重悬细胞沉淀；

E、3000rpm室温离心5-10min，弃上清，加入1.5mL1.l×TE/LiAC溶液重悬细胞，高速离心12000rpm，15s；

F、弃上清，600μL1.1×TE/LiAC溶液重悬细胞，即为感受态细胞；

（2）转化baiT和prey于感受态细胞

A、分别取0.1μgbaitT和prey质粒DNA，5μL(0.lmg)CarrierDNA至无菌的1.5mLEP管中，混匀，加入50μL酵母感受态细胞，涡旋混匀；

B、加入0.5mL无菌1×PEG/LiAC混匀，30℃温育30min，每10min混匀一次；

C、加入20μLDMSO，轻轻颠倒混匀，42℃水浴热激15min每5min摇一次；

D、高速离心12000rpm、15s，弃上清；加入1mLYPDA，30℃，250rpm振荡培养1-2h；

E、高速离心12000rpm，15s，用0.9%的NaCl重悬细胞，取300μL涂于相应营养缺陷型的SD平皿。

（3）阳性克隆的筛选

实验所用酵母双杂交系统共有四个报告基因，即-His、-Ade、AUR1-C、MEL1，因此筛选的最终结果最终确定阳性克隆应该可以同时将这四个报告基因的表达激活。文库筛选过程首先将分别转化了bait和prey质粒DNA再进行杂交后的菌液在加有α半乳糖苷酶（α-Galactosidase)显色底物X-α-Gal和抗真菌金担子素Aba的双缺培养基上初筛，这一步筛选所得到的克隆时既可以生长也可以变蓝的菌落，理论上认为是由于蛋白质之间的相互作用而激活了两个报告基因AUR1-C、MEL1的表达。经过第一轮的筛选得到的阳性克隆继续划线培养在含X-α-Gal和Aba的四缺培养基(既SD/-His/-Ade/-Trp/-Leu)上。在四缺培养基上仍能很好生长的菌落被认为激活了-His、-Ade基因的表达，这些菌落被认为是初步筛选得到的阳性结果。四缺培养基上筛选的阳性结果见图1、2，图1中A、B为pGBKT7空载体及pGBKT7-E2质粒分别转化到酵母；图2中为PGBKT7-E2和pGBKT7空质粒分别和阳性蛋白的AD共转到酵母菌株中，pGBKT7-LAM和pGBKT7-P53分别和pGADT7-T共转到酵母中分别作阴性和阳性对照，pGBKT7空载体和pGBKT7-E2质粒在SD/-Trp平板上均能生长，说明载体都已转入菌体中，而pGBKT7-E2质粒在SD/-Trp/X-α-Gal平板上均不能生长，说明pGBKT7空载体和pGBKT7-E2质粒均无自激活。

图2的实验结果，AD--LT-α+BD-E2两个融合蛋白载体共转化到酵母菌后再双缺培养基和四缺培养基上都能生长，且在加了X-α-Gal和Aba的四缺培养基上仍可以生长而且菌斑变蓝，同时用pGBKT7空质粒分别和AD--LT-α共转实验表明我们筛选出的蛋白没有自激活。

酵母双杂交结果表明LT-α蛋白和庚型肝炎病毒E2蛋白具有相互作用，并通过这一相互作用结合在一起，从而引起后续的一些效应。以上结果表明蛋白LT-α蛋白和庚型肝炎病毒E2蛋白产生相互作用。

（4）阳性克隆插入片段的测序分析

提取所有阳性克隆酵母菌株的质粒，电击法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化后菌液涂布到LB+Amp的平板，以筛选文库AD质粒。由于表达诱饵蛋白的质粒是kana抗性，而表达猎物蛋白的质粒是Amp抗性，就可以筛除诱饵质粒，而只保留猎物质粒。每个板上至少挑出10个单克隆，菌落PCR检测去除重复后提取质粒，测序并进行序列分析。

（5）阳性克隆结果的验证

将上述序列分析得到的阳性蛋白分别与庚型肝炎病毒E2蛋白一对一共转化到Y2HGold酵母菌株中，进行酵母双杂交以确认其相互作用。最终筛选得到与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的蛋白：人淋巴毒素α，也被称为肿瘤坏死因子β（TNF-β)，与肿瘤坏死因子A(TNF-α)及淋巴毒素β(LT-β)同属于肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor，TNF)家族。人LT-α基因定位于第6号染色体，LT-α分子由205个氨基酸残基组成，含34个信号肽，成熟型LT-α分子为171个氨基酸残基，相对分子质量为25000。LT-α属于肿瘤坏死因子家族，是细胞活素类物质，可以调节炎症免疫反应，从而影响细胞凋亡分化。LT-α在HIV感染的CD4+细胞中能够活化或诱导NF-κB，NF-κB结合于HIV的长末端重复序列（LTR）的增强子部位，进而活化HIV基因，可能与艾滋病发病有关。

（6）阳性互作蛋白通过免疫共沉淀实验的进一步验证

HEK293细胞培养于10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，在5%二氧化碳培养箱中37℃下培养。将细胞接种于10cm培养皿中，18-24h后长至1×10⁶后可用于转染。将获得的阳性蛋白与庚型肝炎病毒E2蛋白分别构建到pflag-cmv2和pcDNA3.1/myc-His(-)A上，与不同tag标签形成融合蛋白，然后用X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent脂质体转染法共转染人胚胎肾细胞HEK239，48-72h后用1mL裂解液裂解细胞于4℃或冰浴裂解细胞30min，14000rpm离心10min，上清液用来做免疫共沉淀和免疫印迹分析。

免疫共沉淀：将上一步收集的上清蛋白液与ANTI-FLAGM2AffinityGel4℃孵育过夜，5000g离心30sec回收柱子，用清洗液洗三次后加入0.1MglycineHCl，pH3.5室温振荡5min，5000g离心30sec取上清，加入10μL0.5MTris-HCl（pH7.4,加入1.5MNaCl）获得共沉淀蛋白样品。

Westernblot检测:将上一步中获得的蛋白样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（胶浓度12%），转膜，封闭（5%小牛血清），免疫印迹用anti-FlAG和anti-myc的兔源抗体4℃孵育过夜，TBST洗涤后与二抗（兔源抗体）室温孵育1h后显影检测，结果表明蛋白LT-α与E2蛋白具有明显的相互作用（图3）。在图3中，A图为全细胞裂解液（input）对照组，B图为蛋白LT-α与E2蛋白实验组；IP检测结果时，使用LT-α融合入标签FlAG与FlAGBeeds孵育，洗脱后免疫印迹，Western使用E2蛋白融合标签myc显影，结果表明LT-α-FlAG可以免疫沉淀E2-myc蛋白，两者具有相互作用。

最终筛选得到与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的蛋白：人淋巴毒素α，也被称为肿瘤坏死因子β（TNF-β)，与肿瘤坏死因子α(TNF-α)及淋巴毒素β(LT-β)同属于肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor，TNF)家族。人LT-α基因定位于第6号染色体，LT-α分子由205个氨基酸残基组成，含34个信号肽，成熟型LT-α分子为171个氨基酸残基，相对分子质量为25000。LT-α属于肿瘤坏死因子家族，是细胞活素类物质，可以调节炎症免疫反应，从而影响细胞凋亡分化。LT-α在HIV感染的CD4+细胞中能够活化或诱导NF-κB，NF-κB结合于HIV的长末端重复序列（LTR）的增强子部位，进而活化HIV-1基因，可能与艾滋病发病有关，这可以为后续庚型肝炎病毒与艾滋病间作用机制的研究打下了基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改和改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>与庚型肝炎病毒E2蛋白相互作用的人类蛋白LT-α

<160>4

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>205

<212>PRT

<213>人T淋巴细胞cDNA文库

<400>1

MetThrProProGluArgLeuPheLeuPheArgValCysGlyThrThrLeuHis

110

LeuLeuLeuLeuGlyLeuLeuLeuValLeuLeuProGlyAlaGlnGlyLeuPro

2030

GlyValGlyLeuThrProSerAlaAlaGlnThrAlaArgGlnHisProLysMet

4050

HisLeuAlaHisSerThrLeuLysProAlaAlaHisLeuIleGlyAspProSer

6070

LysGlnAsnSerLeuLeuTrpArgAlaAsnThrAspArgAlaPheLeuGlnAsp

8090

GlyPheSerLeuSerAsnAsnSerLeuLeuValProThrSerGlyIleTyrPhe

100

ValTyrSerGlnValValPheSerGlyLysAlaTyrSerProLysAlaThrSer

110120

SerProLeuTyrLeuAlaHisGluValGlnLeuPheSerSerGlnTyrProPhe

130140

HisValProLeuLeuSerSerGlnLysMetValTyrPheGlyLeuGlnGluPro

150160

TrpLeuHisSerMetTyrHisGlyAlaAlaPheGlnLeuThrGlnGlyAspGln

170180

LeuSerThrHisThrAspGlyIleProHisLeuValLeuSerProSerThrVal

190

PhePheGlyAlaPheAlaLeu

200205

<210>2

<211>618

<212>DNA

<213>人T淋巴细胞cDNA文库

<400>2

atgacaccacctgaacgtctcttcctcccaagggtgtgtggcaccaccctacacctcctc60

cttctggggctgctgctggttctgctgcctggggcccaggggctccctggtgttggcctc120

acaccttcagctgcccagactgcccgtcagcaccccaagatgcatcttgcccacagcacc180

ctcaaacctgctgctcacctcattggagaccccagcaagcagaactcactgctctggaga240

gcaaacacggaccgtgccttcctccaggatggtttctccttgagcaacaattctctcctg300

gtccccaccagtggcatctacttcgtctactcccaggtggtcttctctgggaaagcctac360

tctcccaaggccacctcctccccactctacctggcccatgaggtccagctcttctcctcc420

cagtaccccttccatgtgcctctcctcagctcccagaagatggtgtatccagggctgcag480

gaaccctggctgcactcgatgtaccacggggctgcgttccagctcacccagggagaccag540

ctatccacccacacagatggcatcccccacctagtcctcagccctagtactgtcttcttt600

ggagccttcgctctgtag618

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ccggaattcggcgccccggcctcggtgctag31

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

acgcgtcgaccctgcccgaggagagccatgcgaac35