脂多糖结合蛋白在制备类风湿关节炎相关药物中的应用

摘要

本申请通过质谱分析技术共发现26多种蛋白质在RA患者及正常对照者血清中的免疫复合物中有差异性表达，其中脂多糖结合蛋白(LBP)被证明在RA循环免疫复合物中升高，进一步研究发现，LBP是RA的特异性血清标志物，并可以对RA疾病活动度的评估和诊断有重要作用。本发明目是对于应用酶联免疫吸附法检测LBP水平，并应用于RA的诊断和疾病活动度评估。

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组工程，特别是涉及脂多糖结合蛋白的用途。具体而言，本发明涉及 利用ELISA检测RA患者血清及关节液中的LBP，从而制备相应的类风湿关节炎相关试剂盒， 提供脂多糖结合蛋白的一种新的制药用途。

背景技术

脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharidebindingprotein，LBP)，是主要由肝细胞(肾近 曲小管上皮细胞、肺泡壁II型细胞也可少量合成)产生的一种介导内毒素与靶细胞受体结合 的急性期应激反应蛋白，它能显著促进脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)与单核/巨噬细胞 膜表面的CD14(mCD14)结合，形成LPS-LBP-CD14复合物，经单核/巨噬细胞膜上的 Toll-LikeReceptor4(TLR4)-MyeloidDifferentiationProtein2(MD-2)-MYD88识别复合物 转导，再经多显性转录核因子(nuclearfactorkappaB，NF-kappaB)向胞核内传递信号， 激活单核-巨噬细胞，促进炎性因子的分泌及炎症的发生、发展，导致肝、肺、肾等重要脏器 发生严重损害。

人脂多糖结合蛋白(LBP)基因全长28.5Kb，位于人染色体20q11.23-q12上，含有14个外 显子，编码与脂多糖结合部位的基因位于第3、4外显子(即成熟完整LBP的N端区)，基因5 ′端含有急性期反应蛋白所共有的启动子急性期反应元件/信号传导转录活化 3(APRE/STAT-3)，启动子与外显子之间还含有促炎症转录因子活化蛋白1(AP-1)和C/EBP转 录因子，3′端为富含AATAAA的非编码区，因此LBP基因能在急性期被激活、分泌表达。成 熟完整脂多糖结合蛋白的相对分子量(Mr)60kDa，其家族包括人脂多糖结合蛋白、杀菌通透性 增强蛋白(BactericidalPermeability-Increasingprotein，BPI)、血浆胆固醇脂转移蛋白 (PlasmaCholesterylEsterTransferProtein，CETP)、磷脂转移蛋白 (phospholipidtransferprotein，PLTP)等。脂多糖结合蛋白的N端在空间上形成两个无极 性的脂性结合位点，为人脂多糖结合蛋白与脂多糖的结合点，人脂多糖结合蛋白与CD14的结 合部位则位于脂多糖结合蛋白的C-末端。

脂多糖结合蛋白能显著的促进脂多糖与mCD14结合，Nanbo等人发现人脂多糖结合蛋白可 将机体对脂多糖识别的敏感度提高1000倍，在炎症急性反应早期，当血清脂多糖浓度相对较 低时，就已有微量脂多糖结合蛋白参与，并且只有在脂多糖结合蛋白存在情况下机体才能对 小剂量的脂多糖或细菌产生反应，从而增强机体抗感染作用，但在急性炎症反应中后期，当 血清脂多糖结合蛋白含量升高时，脂多糖结合蛋白会导致单核/巨噬细胞过度活化，大量分泌 白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子，这些因子又强烈地加速 脂多糖结合蛋白基因的转录和脂多糖结合蛋白多肽的合成，进而导致机体严重损害，出现感 染性休克、弥漫性毛细血管内凝血(DIC)、多脏器衰竭(MOF)(见EurJBiochem1999，260(1)： 183-191)等，因此如何抑制过度的炎症反应和防止弥漫性毛细血管内凝血、多脏器衰竭的发 生已成为当今临床工作中的一个重要研究方向。

类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一种以慢性、进行性、侵袭性关节炎为 主要表现的全身性自身免疫病。该病在我国患病人数较多，且具有高致残率，为社会经济带 来巨大负担。目前临床上，CRP和ESR是最常用于RA病情评估的血清学指标，新的炎症因子 和自身抗体亟待被发现，从而使RA的血清学诊断与病情评估正在向更全面、更准确方向发展。

现有技术认为患者血液中脂多糖结合蛋白浓度可作为判断损伤、预后的一个重要参考指 标，但LBP与免疫系统疾病，尤其是LBP与类风湿关节炎之间的相互关系并没有人进行研究， 也并没有相关的实验结果证实两者之间具有相关性。

发明内容

我们通过质谱分析技术共发现26多种蛋白质在RA患者及正常对照者血清中的免疫复合 物中有差异性表达，其中脂多糖结合蛋白(LBP)被证明在RA循环免疫复合物中升高，进一 步研究发现，LBP是RA的特异性血清标志物，并可以对RA疾病活动度的评估和诊断有重要 作用。本发明目是对于应用酶联免疫吸附法检测LBP水平，并应用于RA的诊断和疾病活动度 评估。

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种脂多糖结合蛋白；

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种抗脂多糖结合蛋白的检测方法；

本发明所要解决的技术问题之三在于提供一种抗脂多糖结合蛋白与类风湿关节炎疾病相 关性；

本发明所要解决的技术问题之四在于提供一种脂多糖结合蛋白的检测试剂盒；

本发明所要解决的技术问题之五在于提供一种抗脂多糖结合蛋白的制药用途。

为实现本发明目的而提供的一种脂多糖结合蛋白氨基端片段，编码所述脂多糖结合蛋白的 氨基酸序列为：

1mgalaralpsillallltstpealganpglvaritdkglqyaaqegllalqsellritlp

61dftgdlriphvgrgryefhslkihscellhsalrpvpgqglslsisdssirvqgrwkvrk

121sffklqgffdvsvkgisisvnlllgsessgrptvtasscssdiadvevdmsgdlgwllnl

181fhnqieskfqkvlesricemiqksvssdlqpylqtlpvtteidsfadidyslveaprata

241qmlevmfkgeifhrnhsspvtllaavmslpeehnkmvyfaisdyvfntaslvyheegyln

301fsitddmippdsnirlttksfrpfvprlarlypnmnlelqgsvpsapllnfspgnlsvdp

361ymeidafvhlpssskepvfrlsvatnvsatltfntskitgflkpgkvkvelkeskvglfn

421aelleallnyyilntfypkfndklaegfplpllkrvqlydlglqihkdflflganvqymr

481v(SEQIDNO.1)

或被上述序列所包涵的任何氨基酸序列片段。

本发明的有益效果是：本发明通过从人脂多糖结合蛋白入手，我们通过质谱分析技术共 发现26多种蛋白质在RA患者及正常对照者血清中的免疫复合物中有差异性表达，其中脂多 糖结合蛋白(LBP)被证明在RA循环免疫复合物中升高，进一步研究发现，LBP是RA的特异 性血清标志物，并可以对RA疾病活动度的评估和诊断有重要作用。

附图说明

图1RA患者及对照组血清中LBP浓度测定：RA患者血清中LBP浓度显著高于健康 人群及疾病对照(p＜0.0001)。图中用虚线标出RA诊断的cutoff值(52.95μg/ml，敏感性43.3％， 特异性96.5％，AUC0.82)：

图2LBP与RA临床及实验室指标相关性分析；

图3不同疾病活动度RA患者血清中的LBP水平分析。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下例实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于 解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明的具体条件的实验方法为所属领域熟知的 常规方法和常规条件，或按照试剂盒及仪器制造商所建议的条件。

实施例：脂多糖结合蛋白在类风湿关节炎诊断及疾病活动度中的作用研究

一、病例及对照样本入选标准

120例RA患者均为2013年～2014年期间在北京大学人民医院风湿免疫科住院患者，符合 1987年美国风湿病学会(ACR)制定的RA分类标准，其中，女性92例，男性28例，年龄29～89 岁，平均60.27±10.59岁，病程1～５1年，平均12.16±8.69年。选取32例骨关节炎 (Osteoarthritis，OA)患者，30例系统性红斑狼疮(Systemiclupuserythematosus，SLE) 患者，30例原发性干燥综合征(Primarysyndrome，pSS)患者作为疾病对照组， 51例健康志愿者作为健康对照组(HC)。各组血清均来源于临床检验的剩余标本。RA患者的 临床资料采集如下：

(1)临床资料：包括性别、年龄、病程、治疗、合并感染及代谢病情况、皮下结节、肺部损 害、血液系统损害、肾脏损害、眼部病变和疾病活动性评分。

①感染的定义：临床上依据患者症状、体征、辅助检查，确定诊断各系统或全身感染。

②代谢病包括：高血压病、糖尿病、冠心病、高脂血症、高尿酸血症、周围动脉粥样硬 化症等一系列由于代谢紊乱所致的心脑血管疾病。

③DAS28评分：观察双侧肩、肘、腕、膝、掌指及近端指间关节等共28个关节的压痛 及肿胀情况，并结合血沉进行计算打分，以反映RA患者病情活动程度。可通过DAS28Calclator 1.1-β软件进行计算：DAS28＝0.56×压痛关节数+0.128×肿胀关节数+0.7×ln (ESR)×1.08+0.16)。

(2)实验室指标：

①血沉(ESR)：魏式法检测，正常值≤20mm/h；

②C反应蛋白(CRP)：免疫比浊法检测，＞8mg/L认为异常；

③IgM类风湿因子(RF)：免疫比浊法检测，＞20IU/mL认为异常；

④抗CCP抗体：采用第二代ELISA试剂盒(德国欧蒙)定量法检测；

⑤AKA和APF：间接免疫荧光法检测，滴度＞1∶10判定为阳性，分别记录阳性和阴性患 者例数；

⑥免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)：采用美国贝克曼公司蛋白分析仪测定。

二、实验方案

ELISA方法检测LBP的水平

本研究采用HycultBiotech公司生产的HK315，HumanLBPELISAkit试剂盒进行RA血清或关 节液中LBP的测定，具体步骤如下：

1、清洗样本孔，将0.5μL血清或关节液稀释2000倍，设置标准孔及样本孔，各加不同样 本100μL，室温孵育1小时；

2、清洗样本孔，除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入生物素化标记的抗抗体 100μL，室温孵育1小时；

3、清洗样本孔，除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)100μL 结合，室温孵育1小时；

4、清洗样本孔，加入100μLTMB，室温避光孵育30分钟；

5、每孔加入终止液100μL，30分钟内，在450nm波长处测定各孔的OD值；

6、绘制标准曲线，按照曲线方程计算样本的浓度。

三、实验数据分析：

应用SPSS17.0软件进行数据处理，计量资料采用独立样本t检验或非参数检验，两个以 上变量相互比较采用单因素ANOVA。计数资料采用X²检验或Fisher’s精确检验。多因素回 归分析应用二元Logistic回归分析，两变量相关性分析采用Spearman相关性分析。以p＜0.05 为差异有统计学意义。

四、实验结果：

RA患者及对照组血清中LBP水平比较

应用ELISA对120名RA患者与健康和疾病对照血清中的LBP进行检测，探究LBP在RA 诊断中的意义。如图1所示，图中用虚线标出RA诊断的cutoff值(52.95μg/ml，敏感性 43.3％，特异性96.5％，AUC0.82)，LBP在RA血清中的浓度为51.67±25.66μg/ml，显著 高于健康对照(21.11±28.96μg/ml，p＜0.0001)、OA患者(24.99±13.94μg/ml，p＜0.0001)、 pSS患者(23.70±10.95μg/ml，p＜0.0001)和SLE患者(30.30±18.23μg/ml，p＜0.0001)。 可见，RA患者血清中LBP浓度显著高于健康人群及疾病对照(p＜0.0001)

健康人血清中LBP浓度的均值+2倍标准偏差为52.95μg/ml，以此作为阳性阈值对LBP 在RA诊断中的价值进行分析。120名RA患者中，有52名LBP阳性患者。对照组143人中， 仅有5人LBP阳性，其中3例为SLE患者，2例为健康对照，在OA及pSS患者中均无LBP阳 性。综上，LBP在RA诊断中的敏感性为43.3％，特异性为96.5％，AUC为0.82。在抗CCP抗 体阳性及阴性患者中，LBP的阳性率相似，分别为42.7％和43.8％，结果如表1所示。

表1LBP在不同疾病中的阳性率

LBP与RA患者临床及实验室指标的相关性

通过回顾分析120例RA患者的临床资料，分析LBP水平与年龄、病程、RA活动度相关指 标、自身抗体等的相关性。同时由于LBP在感染及代谢病中的作用，我们将高密度脂蛋白胆 固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯和总胆固醇等脂代谢相关指标，及白细胞计 数、中性粒细胞计数等补充纳入了相关性研究。结果发现，LBP与ESR、CRP、D-dimer、IgM、 触痛关节数、肿胀关节数及DAS28评分显著正相关，与HDL-c水平负相关(p＜0.05)。图2显 示了触痛关节数、肿胀关节数等有显著意义临床指标与血清LBP水平的线性关系。可见，RA 患者中，LBP与ESR、CRP、D-dimer、IgM、肿胀关节数、触痛关节数和DAS28评分呈正相关。 在与血脂指标的相关性分析中，LBP与HDL-c呈负相关。

根据之前得出的cutoff值，将RA患者分为LBP阳性(n＝52)及阴性(n＝68)2组，比 较两组的危险因素及系统受累情况。结果发现，RA患者LBP阳性组中高疾病活动度 (DAS28＞5.1)患者明显多于阴性组(p＝0.000)，多因素回归分析后高疾病活动度仍与LBP阳 性显著相关(p＝0.000)。而性别、吸烟史、感染、代谢病、系统受累及抗CCP抗体等自身抗 体与LBP阳性均未见明显相关性(表2)。

表2LBP阳性与阴性RA患者临床指标比较分析

注：^*p＜0.05；^**p＜0.01；^***p＜0.001。根据前述cut-off值，将RA患者分为LBP阳性(n＝52)及阴性(n＝68)2组，比较两 组的危险因素及系统受累情况。卡方检验及多因素回归分析均提示LBP阳性组中高疾病活动度(DAS28＞5.1)者显著多于阴 性组(p＝0.000)。

LBP对RA疾病活动度的提示作用分析

对LBP与临床指标相关性的初步分析显示了LBP与肿胀、触痛关节数，DAS28评分以及 ESR、CRP等活动度指标有显著相关性。基于前期结果，LBP对疾病活动度的预测价值被进一 步分析。

1、不同疾病活动度RA血清中LBP的比较

根据DAS28评分，我们将RA患者分为高疾病活动度(DAS28＞5.1)、中疾病活动度 (3.2＜DAS28≤5.1)、低疾病活动度(DAS28≤3.2)3组。统计显示，低疾病活动度组的LBP 水平为39.47±19.03μg/ml，中疾病活动度组为42.78±22.88μg/ml，而高疾病活动度组为 62.14±25.50μg/ml，均值依次递增。为了了解3组患者血清中LBP的浓度有无显著性差异， 我们进一步进行了单因素ANOVA分析，结果显示，高疾病活动度组LBP显著高于其他两组 (p＜0.01)，而低、中疾病活动度组之间血清LBP水平无显著差异，见图3，高疾病活动度 组RA患者LBP显著高于其他两组(p＜0.01)。

2、LBP与其他活动度指标的比较

绘制LBP及其他临床常用活动度指标(包括CRP、ESR、RF、抗CCP抗体等)对高疾病活 动度提示作用的ROC曲线，LBP、CRP、ESR和RF均为反映高疾病活动度的良好指标(p＜0.05)， LBP反映高疾病活动度的价值(敏感性58.6％，特异性85.2％，AUC0.739)与CRP(敏感性 53.4％，特异性91.8％，AUC0.754)和ESR(敏感性67.2％，特异性79.0％，AUC0.769)相 似，敏感性和特异性均高于RF(敏感性35.7％，特异性88.5％，AUC0.620)。然而，抗CCP 抗体对高疾病活动度的预测作用较差(p＝0.379)。

为了更准确地比较各指标对高疾病活动度的预测价值，我们利用非参数检验比较了各指 标的曲线下面积(AUC)，分析发现，LBP的AUC值与CRP、ESR、RF无显著差异，且显著大 于抗CCP抗体(p＜0.0001)，见表3。

表3各指标对高疾病活动度诊断的ROC曲线下面积比较

3、CRP/ESR阴性RA患者中LBP水平及与临床指标相关性

为了研究LBP在常用活动度指标阴性的患者中的表现，我们对CRP、ESR阴性患者的资料 进行了分析。120名RA患者中，有40名患者ESR和/或CRP为阴性，这些患者DAS28评分的 中位数和平均数均在4以上，中度以上活动的患者占77.5％。在这群患者中，CRP和ESR的水 平与患者的肿胀关节数、触痛关节数、DAS28评分、免疫球蛋白等指标的水平均无明显相关 性(p＞0.05)。提示在一部分患者中CRP和ESR已经不能很好地提示疾病活动。

这些患者中，仍有52.5％的患者LBP为阳性。为了检验LBP在CRP/ESR阴性RA患者中是 否仍具有提示病情活动的作用，我们分析了40名CRP/ESR阴性患者的临床资料与LBP的相关 性。结果发现，LBP与肿胀关节数仍显著相关(r＝0.48，p＝0.02)。这一结果提示，LBP 的检测可以补充现有疾病活动度指标CRP与ESR的不足，改善对RA疾病活动度的检测效率。