煤焦化废水COD降解用菌种驯化试剂盒及驯化方法

摘要

一种煤焦化废水COD降解用菌种驯化试剂盒及驯化方法，试剂盒包括富集管、驯化预制管A、驯化预制管B，驯化方法包括缺氧和好氧驯化。该试剂盒是通过在全国大量采集煤焦化废水样品，对废水成分进行分析，并通过实验配制出了一种可以模拟真实污水的驯化培养基，并以此为基础形成了试剂盒。该驯化培养基具有较强的适应性，通过其驯化后的菌种投入到多个煤焦化污水样品后，其COD降解能力均有所提高，大大缩短污水处理启动时间。该试剂盒可模拟缺氧、好氧生物法工艺，可应用于煤焦化污水处理菌剂的产品优化，以及污水厂在运行前对污泥进行快速驯化。

说明书

技术领域：

本发明属于一种菌种驯化试剂盒及驯化方法，特别涉及一种用于降解煤焦化废水COD用菌种驯化试剂盒及驯化方法。

背景技术：

煤焦化又称煤炭高温干馏。以煤为原料，在隔绝空气条件下，加热到950℃左右，经高温干馏生产焦炭，同时获得煤气、煤焦油并回收其它化工产品的一种煤转化工艺。

煤焦化行业造成的水污染相当严重。我国煤炭储量大，煤焦化废水排放量大，其废水的成分相当复杂，排出的废水中含有大量难以降解的有机污染物，据相关统计显示，煤焦化废水含有高达300多种污染物质，不论是对环境还是对人类本身都有着较大的影响。

煤焦化企业排放废水含有大量有毒、有害物质。综合废水中COD一般在5000mg/L左右，废水所含有机污染物包括酚类、多环芳香族化合物及含氮、氧、硫的杂环化合物等。废水中的易降解有机物主要是酚类化合物和苯类化合物；可降解类有机物有砒咯、萘、呋喃、咪唑；难降解的有机物主要有吡啶、咔唑、联苯、三联苯等。

目前国内处理煤焦化废水的主要工艺路线基本遵行“预处理+生化处理+深度处理”，其中生化处理是污水处理工艺的重要阶段。通过对国内多个煤焦化企业的实地走访，目前对于预处理后的煤焦化废水，一般采用缺氧、好氧生物法处理(A/O工艺)。微生物是废水生物处理过程的核心，制约着污水处理的效果。在污水厂启动初期或运行受到冲击需要重新恢复运行时，国内普遍采用的方法是向污水处理设施中投加污泥和营养物质，或者投加市场上现有的专用微生物菌剂，达到污水处理设施正常运行的目的。对于煤焦化废水的处理，投加污泥和菌剂的效果受到以下几方面问题的制约：一、煤焦化废水中含有多种对微生物有毒害作用的物质，投加到污水中的污泥或菌种中的部分微生物容易被废水中的毒性物质所抑制，为解决此问题往往需要对污泥或菌种在投加前进行长时间的驯化；二、煤焦化废水中有大量难降解有机物，这些物质很难被微生物利用并降解，解决这个问题通常需要工艺的合理设计与污泥或菌剂的驯化共同解决；三、与普通污水相比，煤焦化废水处理设施的启动时间更长，需要更长时间的驯化。

发明内容：

本发明的目的在于解决以上问题，提供一种煤焦化废水COD降解用菌种驯化试剂盒及驯化方法，经本试剂盒驯化后的菌种投放到煤焦化废水中，可以大大缩短污水处理启动时间，提高COD降解效率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种煤焦化废水COD降解用菌种驯化试剂盒，其特征在于：它是由富集管、驯化预制管A、驯化预制管B组成；其中：

(一)、富集管：

富集管的制备：

(1)、取牛肉膏1-2g，蛋白胨1-2g，磷酸二氢钾640-780mg，磷酸氢二钠0.75-1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至7.00-7.50，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基20ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础富集管制备完成；

(2)、取苯酚18-22mg，萘酚3-7mg，2-甲基苯酚3-7mg，3-甲基苯酚3-7mg，喹啉1-2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌；过滤除菌完成后，取2ml经过过滤除菌的溶液，在无菌条件下加入到步骤(1)中的基础富集管中，至此富集管制备完成；

(二)、驯化预制管A：

驯化预制管A的制备：

(1)、取牛肉膏0.8-1.2g，蛋白胨0.8-1.2g，丙三醇0.2-0.4ml，磷酸二氢钾640-780mg，磷酸氢二钠0.75-1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基30ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管A制备完成；

(2)、取苯酚23-27mg，萘酚8-12mg，2-甲基苯酚8-12mg，3-甲基苯酚8-12mg，喹啉2-4mg，苯胺4-6mg，吡啶0.4-0.6mg，间甲苯胺4-6mg，辛基十二烷醇0.1-0.2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物A；

(3)、取萘130-170mg，吲哚230-270mg，甲苯3-7mg，邻苯二甲酸二丁酯2-3mg，苯并咪唑2-3mg，用100ml75％乙醇溶解，此溶液为醇添加物A；

(4)、分别取水添加物A3ml，醇添加物A0.012ml，在无菌条件下装到步骤(1)中的基础驯化预制管A中，至此驯化预制管A制备完成；

(三)、驯化预制管B：

驯化预制管B的制备：

(1)、取牛肉膏0.5-0.7g，蛋白胨0.5-0.7g，丙三醇0.6-0.8ml，磷酸二氢钾640-780mg，磷酸氢二钠0.75-1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基30ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管B制备完成；

(2)、取苯酚150-200mg，萘酚20-25mg，2-甲基苯酚40-50mg，3-甲基苯酚40-50mg，喹啉8-10mg，苯胺10-15mg，吡啶0.8-0.9mg，间甲苯胺10-15mg，辛基十二烷醇0.3-0.4mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物B；

(3)、取萘740-760mg，吲哚1200-1300mg，甲苯20-25mg，邻苯二甲酸二丁酯10-14mg，苯并咪唑10-14mg，用100ml75％乙醇溶解，此溶液为醇添加物B；

(4)、分别取水添加物B3ml，醇添加物B0.012ml，在无菌条件下装到步骤(1)中的基础驯化预制管B中，至此驯化预制管B制备完成。

一种采用煤焦化废水COD降解用菌种驯化试剂盒驯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(一)、缺氧阶段驯化：

(1)、将待驯化样品取1-3ml接种到第1富集管中，将第1富集管的管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；

(2)、取经第1富集管培养的样品5ml，接种到第1驯化预制管A中，将第1富集管连同管内剩余样品放入4℃冷藏；

(3)、将第1驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，取上清液A130ml放入100ml经过灭菌的第1三角瓶中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第2驯化预制管A中继续培养；

(4)将第2驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，取上清液A230ml放入100ml经过灭菌的第2三角瓶中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第3驯化预制管A中继续培养；

(5)将第3驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，取上清液A330ml放入100ml经过灭菌的第3三角瓶中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第1驯化预制管B中继续培养；

(6)、将第1驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm震荡培养48-72h；培养完成后静置30-60min，取上清液B130ml放入100ml经过灭菌的第4三角瓶中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第2驯化预制管B中继续培养；

(7)、将第2驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm震荡培养48-72h；培养完成后静置30-60min，取上清液B230ml放入100ml经过灭菌的第5三角瓶中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第3驯化预制管B中继续培养；

(8)、将第3驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm震荡培养48-72h；培养完成后静置30-60min，取上清液B330ml放入100ml经过灭菌的第6三角瓶中，然后放入4℃留存；取沉淀1ml，接种到第2富集管中，将第2富集管的管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；培养后将第2富集管放入4℃保存，或加入4ml无菌甘油，混匀后分装到冻存管冻存；此驯化后菌种为缺氧驯化菌种；

(二)、好氧阶段驯化：

(9)、当样品经过步骤(5)的第3驯化预制管A培养完成后，将步骤(2)冷藏的第1富集管取出并恢复室温；待恢复室温6-10h后，取5ml接种到上清液A3中；将接种后的上清液A3放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液A2中继续培养；

(10)将接种后的上清液A2放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液A1中继续培养；

(11)将接种后的上清液A1放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液B3中；

(12)、将接种后的上清液B3入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液B2中继续培养；

(13)、将接种后的上清液B2入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液B1中继续培养；

(14)、将接种后的上清液B1入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72小时，培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀1ml，接种到第3富集管中；

(15)、将第3富集管的管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；培养后将第3富集管放入4℃保存，或加入4ml无菌甘油，混匀后分装到冻存管冻存；此驯化后菌种为好氧驯化菌种。

本发明的优点和有益效果是：

该试剂盒是通过本实验室在全国大量采集煤焦化废水样品，对废水成分进行分析，并通过实验配制出了一种可以模拟真实污水的驯化培养基，并以此为基础形成了试剂盒。该驯化培养基具有较广的适用性，通过其驯化后的菌种投入到多个煤焦化污水样品后，可以作为高效煤焦化废水COD处理菌剂或污泥，提高菌种在废水中的适应能力，其COD降解能力均有所提高，缩短污水处理启动时间。该试剂盒可以模拟缺氧、好氧生物法工艺，可以应用于煤焦化污水处理菌剂的产品优化，以及污水厂在运行前对污泥进行快速驯化。

附图说明：

图1为本发明的驯化流程图。

其中：

1-样品，2-第1富集管，3-第1驯化预制管A，4-第2驯化预制管A，5-第3驯化预制管A，6-第1驯化预制管B，7-第2驯化预制管B，8-第3驯化预制管B，9-第1三角瓶，10-第2三角瓶，11-第3三角瓶，12-第4三角瓶，13-第5三角瓶，14-第6三角瓶，15-第2富集管，16-第3富集管。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是：操作前应确保操作环境及相关器具已灭菌。本发明所述的原料如无特殊说明均为市售产品。特别指出，以下以50ml预制管规格为例说明，但不限于50ml规格。

实施例1：

实施例1所用试剂盒及制备方法如下：

一、富集管：

富集管的制备：

1、取牛肉膏2g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾780mg，磷酸氢二钠1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至7.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基20ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础富集管制备完成；

2、取苯酚22mg，萘酚7mg，2-甲基苯酚7mg，3-甲基苯酚7mg，喹啉2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌；过滤除菌完成后，取2ml经过过滤除菌的溶液，在无菌条件下加入到步骤1中的基础富集管中，至此富集管制备完成；

二、驯化预制管A：

驯化预制管A的制备：

1、取牛肉膏1.2g，蛋白胨1.2g，丙三醇0.4ml，磷酸二氢钾780mg，磷酸氢二钠1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至7.50，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基0ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管A制备完成；

2、取苯酚27mg，萘酚12mg，2-甲基苯酚12mg，3-甲基苯酚12mg，喹啉4mg，苯胺6mg，吡啶0.6mg，间甲苯胺6mg，辛基十二烷醇0.2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物A；

3、取萘170mg，吲哚270mg，甲苯7mg，邻苯二甲酸二丁酯3mg，苯并咪唑3mg，用100ml75％乙醇溶解，此溶液为醇添加物A；

4、分别取水添加物A3ml，醇添加物A0.012ml，在无菌条件下装到步骤1中的基础驯化预制管A中，至此驯化预制管A制备完成；

三、驯化预制管B：

驯化预制管B的制备：

1、取牛肉膏0.7g，蛋白胨0.7g，丙三醇0.8ml，磷酸二氢钾780mg，磷酸氢二钠1.25g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至7.50，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基30ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管B制备完成；

2、取苯酚200mg，萘酚25mg，2-甲基苯酚50mg，3-甲基苯酚50mg，喹啉10mg，苯胺15mg，吡啶0.9mg，间甲苯胺15mg，辛基十二烷醇0.4mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物B；

3、取萘760mg，吲哚1300mg，甲苯25mg，邻苯二甲酸二丁酯14mg，苯并咪唑14mg，用100ml75％乙醇溶解，此溶液为醇添加物B；

4、分别取水添加物B3ml，醇添加物B0.012ml，在无菌条件下装到步骤1中的基础驯化预制管B中，至此驯化预制管B制备完成。

采用本试剂盒对菌种驯化的方法，见图1。其中，样品来源为本实验室研制的用于处理有机化工废水的污水处理液体菌剂，菌剂主要组成包括假单胞菌属、不动杆菌属、节杆菌属、芽孢菌属等。详细方法如下：

一、缺氧阶段驯化：

步骤1、将待驯化样品1取1ml接种到第1富集管2中，将第1富集管2的管盖拧紧，平放入摇床35℃、200rpm震荡培养24小时；

步骤2、取经步骤1第1富集管2培养的样品5ml，接种到第1驯化预制管A3中，将第1富集管2连同管内剩余样品放入4℃冷藏；

步骤3、将步骤2的第1驯化预制管A3的管盖拧紧，平放入摇床28℃、150rpm震荡培养24小时；培养完成后静置60min，取上清液A130ml放入100ml经过灭菌的第1三角瓶9中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第2驯化预制管A4中继续培养；

步骤4、将步骤3的第2驯化预制管A4的管盖拧紧，平放入摇床28℃、150rpm震荡培养24小时；培养完成后静置60min，取上清液A230ml放入100ml经过灭菌的第2三角瓶10中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第3驯化预制管A5中继续培养；

步骤5、将步骤4的第3驯化预制管A5的管盖拧紧，平放入摇床28℃、150rpm震荡培养24小时；培养完成后静置60min，取上清液A330ml放入100ml经过灭菌的第3三角瓶11中，然后放入4℃留存；当样品经过第3驯化预制管A5培养后，取沉淀5ml，接种到第1驯化预制管B6中；

步骤6、将步骤5的第1驯化预制管B6的管盖拧紧，平放入摇床28℃、150rpm震荡培养48h；培养完成后静置60min，取上清液B130ml放入100ml经过灭菌的第4三角瓶12中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第2驯化预制管B7中继续培养；

步骤7、将步骤6的第2驯化预制管B7的管盖拧紧，平放入摇床28℃、150rpm震荡培养48h；培养完成后静置60min，取上清液B230ml放入100ml经过灭菌的第5三角瓶13中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第3驯化预制管B8中继续培养；

步骤8、将步骤7的第3驯化预制管B8的管盖拧紧，平放入摇床28℃、150rpm震荡培养48h；培养完成后静置60min，取上清液B330ml放入100ml经过灭菌的第6三角瓶14中，然后放入4℃留存；当样品经过第3驯化预制管B8培养后，取沉淀1ml，接种到第2富集管15中，将第2富集管15盖拧紧，平放入摇床35℃、200rpm震荡培养24小时；培养后向第2富集管15中加入4ml无菌甘油，混匀后分装到冻存管冻存，此驯化后菌种为缺氧驯化菌种；

二、好氧阶段驯化：

步骤9、当步骤5样品经过第3驯化预制管A5培养完成后，将冷藏的第1富集管2取出并恢复室温；待恢复室温6h后，取5ml接种到上清液A3中；

步骤10、将步骤9接种后的上清液A3入摇床28℃、200rpm震荡培养24小时；培养完成后静置60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液A2中继续培养；

步骤11、将步骤10接种后的上清液A2入摇床28℃、200rpm震荡培养24小时；培养完成后静置60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液A1中继续培养；

步骤12、将步骤11接种后的上清液A1入摇床28℃、200rpm震荡培养24小时；培养完成后静置60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液B3中；

步骤13、将接种后的上清液B3放入摇床28℃、200rpm震荡培养48小时；培养完成后静置60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液B2中继续培养；

步骤14、将接种后的上清液B2放入摇床28℃、200rpm震荡培养48小时；培养完成后静置60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液B1中继续培养；

步骤15、将接种后的上清液B1放入摇床28℃、200rpm震荡培养48小时；培养完成后静置60min，弃掉30ml上清液，当样品经过步骤14的上清液B1驯化培养后，取沉淀1ml，接种到第3富集管16中，将第3富集管16和管盖拧紧，平放入摇床35℃、200rpm震荡培养24小时；培养后向第3富集管16中加入4ml无菌甘油，混匀后分装到冻存管后冻存；此驯化后菌种为好氧驯化菌种。

经过驯化的菌种通过以下实验进行驯化效果对比：

污水来源为陕西一煤焦化企业调节池出水，COD为3948mg/L。各取污水40ml分装入2个50ml无菌螺口管中待用。待验证样品为经过驯化的菌种和未经驯化的菌种。验证方法为：1、缺氧效果验证：将未经驯化的菌种和经过缺氧驯化的菌种按2％的接种量分别接种到装有污水的螺口管中，平放入摇床28℃、100rpm震荡培养，每天测一次COD，连续观察5天。2、好氧效果验证：将以上经过缺氧验证的污水分别转入2个灭过菌的三角瓶中，将未经驯化的菌种和经过好氧驯化的菌种按2％的接种量分别接种到2个三角瓶中，放入摇床28℃、200rpm震荡培养，每天测一次COD，连续观察5天。观察结果如下。

表1：驯化前后菌种效果对比

通过对比试验可以看出，经过试剂盒驯化的菌种具有更快的启动速度和更好的降解效率。

实施例2：

实施例2所用试剂盒及制备方法如下：

富集管：

一、富集管的制备：

1、取牛肉膏1g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾640mg，磷酸氢二钠0.70g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至7.50，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基20ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础富集管制备完成；

2、取苯酚18mg，萘酚3mg，2-甲基苯酚3mg，3-甲基苯酚3mg，喹啉1mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌；过滤除菌完成后，取2ml经过过滤除菌的溶液，在无菌条件下加入到步骤1中的基础富集管中，至此富集管制备完成；

二、驯化预制管A：

驯化预制管A的制备：

1、取牛肉膏0.8g，蛋白胨0.8g，丙三醇0.2ml，磷酸二氢钾640mg，磷酸氢二钠0.75g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基30ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管A制备完成；

2、取苯酚23mg，萘酚8mg，2-甲基苯酚8mg，3-甲基苯酚8mg，喹啉2mg，苯胺4mg，吡啶0.4mg，间甲苯胺4mg，辛基十二烷醇0.1mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物A；

3、取萘130mg，吲哚230mg，甲苯3mg，邻苯二甲酸二丁酯2mg，苯并咪唑2mg，用100ml75％乙醇溶解，此溶液为醇添加物A；

4、分别取水添加物A3ml，醇添加物A0.012ml，在无菌条件下装到步骤1中的基础驯化预制管A中，至此驯化预制管A制备完成；

三、驯化预制管B：

驯化预制管B的制备：

1、取牛肉膏0.5g，蛋白胨0.5g，丙三醇0.6ml，磷酸二氢钾640mg，磷酸氢二钠0.75g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基30ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管B制备完成；

2、取苯酚150mg，萘酚20mg，2-甲基苯酚40mg，3-甲基苯酚40mg，喹啉8mg，苯胺10mg，吡啶0.8mg，间甲苯胺10mg，辛基十二烷醇0.3mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物B；

3、取萘740mg，吲哚1200mg，甲苯20mg，邻苯二甲酸二丁酯10mg，苯并咪唑10mg，用100ml75％乙醇溶解，此溶液为醇添加物B；

4、分别取水添加物B3ml，醇添加物B0.012ml，在无菌条件下装到步骤1中的基础驯化预制管B中，至此驯化预制管B制备完成。

采用本试剂盒进行菌种驯化的方法，见图1。其中样品来源为本实验室从山东一化工工业园区污水处理厂采集的活性污泥样品。详细操作方法如下：

一、缺氧阶段驯化：

步骤1、将待驯化样品取3ml接种到第1富集管2中，将第1富集管2的管盖拧紧，平放入摇床28℃、150rpm震荡培养48小时；

步骤2、取经步骤1第1富集管2培养的样品5ml，接种到第1驯化预制管A3中，将第1富集管2连同管内剩余样品放入4℃冷藏；

步骤3、将步骤2的第1驯化预制管A3的管盖拧紧，平放入摇床25℃、100rpm震荡培养48小时；培养完成后静置30min，取上清液A130ml放入100ml经过灭菌的第1三角瓶9中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第2驯化预制管A4中继续培养；

步骤4、将步骤3的第2驯化预制管A4的管盖拧紧，平放入摇床25℃、100rpm震荡培养48小时；培养完成后静置30min，取上清液A230ml放入100ml经过灭菌的第2三角瓶10中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第3驯化预制管A5中继续培养；

步骤5、将步骤4的第3驯化预制管A5的管盖拧紧，平放入摇床25℃、100rpm震荡培养48小时；培养完成后静置30min，取上清液A330ml放入100ml经过灭菌的第3三角瓶11中，然后放入4℃留存；当样品经过第3驯化预制管A5培养后，取沉淀5ml，接种到第1驯化预制管B6中；

步骤6、将步骤5的第1驯化预制管B6的管盖拧紧，平放入摇床25℃、100rpm震荡培养72h；培养完成后静置30min，取上清液B130ml放入100ml经过灭菌的第4三角瓶12中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第2驯化预制管B7中继续培养；

步骤7、将步骤6的第2驯化预制管B7的管盖拧紧，平放入摇床25℃、100rpm震荡培养72h；培养完成后静置30min，取上清液B230ml放入100ml经过灭菌的第5三角瓶13中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第3驯化预制管B8中继续培养；

步骤8、将步骤8的第3驯化预制管B8的管盖拧紧，平放入摇床25℃、100rpm震荡培养72h；培养完成后静置30min，取上清液B330ml放入100ml经过灭菌的第6三角瓶14中，然后放入4℃留存；当样品经过第3驯化预制管B8培养后，取沉淀1ml，接种到第2富集管15中，将第2富集管15的管盖拧紧，平放入摇床28℃、150rpm震荡培养48小时；培养后将第2富集管15放入4℃保存；此驯化后菌种为缺氧驯化菌种；

二、好氧阶段驯化：

步骤9、当步骤5样品经过第3驯化预制管A5培养完成后，将冷藏的第1富集管2取出并恢复室温；待恢复室温10h后，取5ml接种到上清液A3中；

步骤10、将接种后的上清液A3入摇床25℃、150rpm震荡培养48小时；培养完成后静置30min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液A2中继续培养；

步骤11、将接种后的上清液A2入摇床25℃、150rpm震荡培养48小时；培养完成后静置30min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液A1中继续培养；

步骤12、将接种后的上清液A1入摇床25℃、150rpm震荡培养48小时；培养完成后静置30min，弃掉30ml上清液，当样品经过上清液A1驯化培养后，取沉淀5ml，接种到上清液B3中；

步骤13、将步骤12接种后的上清液B3放入摇床25℃、150rpm震荡培养72小时；培养完成后静置30min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液B2中继续培养；

步骤14、将步骤13接种后的上清液B2放入摇床25℃、150rpm震荡培养72小时；培养完成后静置30min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液B1中继续培养；

步骤15、将步骤15接种后的上清液B1放入摇床25℃、150rpm震荡培养72小时；培养完成后静置30min，弃掉30ml上清液，当样品经过上清液B1驯化培养后，取沉淀1ml，接种到第3富集管16中，将第3富集管16的管盖拧紧，平放入摇床28℃、150rpm震荡培养48小时；培养后将第3富集管16放入4℃保存；此驯化后菌种为好氧驯化菌种。

经过驯化的菌种通过以下实验进行驯化效果对比：

污水来源为陕西一煤焦化企业调节池出水，COD为3782mg/L。各取污水40ml分装入2个50ml无菌螺口管中待用。待验证样品为经过驯化的菌种和未经驯化的菌种。验证方法为：1、缺氧效果验证：将未经驯化的菌种和经过缺氧驯化的菌种按2％的接种量分别接种到装有污水的螺口管中，平放入摇床28℃、100rpm震荡培养，每天测一次COD，连续观察5天。2、好氧效果验证：将以上经过缺氧验证的污水分别转入2个灭过菌的三角瓶中，将未经驯化的菌种和经过好氧驯化的菌种按2％的接种量分别接种到2个三角瓶中，放入摇床28℃、200rpm震荡培养，每天测一次COD，连续观察5天。观察结果如下。

表2：驯化前后菌种效果对比

通过对比试验可以看出，经过试剂盒驯化的菌种具有更快的启动速度和更好的降解效率。