细胞内汞离子检测与显像用二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针

摘要

本发明涉及精细化工领域中一类细胞内汞离子检测与显像用二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针，该探针通过2,5-二(4-[二(2-氯乙基)氨基]苯乙烯基)对苯二甲腈与巯基乙醇发生亲核取代反应而制备。810nm的激光激发可避免细胞的光致毒。在pH？4.5—13的范围内，探针对汞离子有很好的选择性，而钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰，可以检测微摩尔浓度的汞离子。探针分子络合汞离子后荧光强度下降，可以对汞离子含量进行双光子荧光检测。双光子荧光显微成像实验表明这类探针对成纤维细胞等细胞或组织渗透性好，本身对细胞没有毒副作用，特别适于细胞内汞离子浓度变化和汞离子分布的检测。

说明书

技术领域：

本发明属于精细化工领域中细胞内汞离子检测与显像用二苯乙烯基双氰基苯双光 子荧光探针。

背景技术：

汞是一种对人体有害的高毒性重金属元素,又是一种在工业上有多种用途的重要 金属。不同形态(chemicalspecies)的汞对生物的毒性大小和作用机理差异很大。金属汞 有高的扩散性和脂溶性,由于汞的蒸气压很低,因此易通过呼吸作用进入生物体,并通过 血脑屏障(bloodbrainbarrier)进入脑组织,在脑组织中被氧化成汞离子。汞离子由于较难 通过血液屏障,被蓄积在脑组织中,从而引起中枢神经系统的严重损害；而且由于汞与细 胞膜结合后会抑制糖穿过细胞膜的主动输送,使钾对细胞膜的透性增加,造成对脑细胞 的糖分供应不足而导致脑细胞能量缺乏；可溶性的无机汞化合物也有较高毒性,它们通 过消化道进入人体后,容易在肾脏和肝脏中蓄积；烷基汞很容易溶于有机物中,特别易溶 于细胞膜或脑组织的类脂里,其碳-汞共价键不易破坏,对生物体造成极大危害。所以对 于汞离子的检测以及生物过程研究已经成为近年来的研究热点。与其他检测方法相比， 荧光检测具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、检测快捷方便并可以进行实时区域离 子检测等优点，且双光子荧光探针使用800-1100nm的激光作为激发光源，可以避免单 光子荧光探针因使用350-560nm的激发光而导致的光致毒与光漂白。基于ICT原理的双 光子荧光汞离子探针络合汞离子后，双光子荧光强度降低，因此可以通过监测双光子 荧光强度的变化来确定汞离子含量的高低，此外，可以借助双光子荧光显微镜对活细 胞或生物组织进行汞离子生物成像，并对汞离子的生理作用与生物过程进行实时动态 三维跟踪研究。

目前有效的汞离子选择性荧光探针较少，并且适于细胞内汞离子检测与成像的双 光子荧光探针更少。已报道的对汞离子有选择性的荧光探针主要分两大类：一是单光 子荧光汞离子探针；二是双光子荧光汞离子探针。单光子荧光汞离子探针是一种氮硫 杂冠醚或开链冠醚[(1)S.Yoon,E.W.Miller,Q.He,P.H.Do,C.J.Chang.ABrightand SpecificFluorescentSensorforMercuryinWater,Cells,andTissue.Angew.Chem.Int. Ed.,2007,46,6658-6661；(2)E.M.Nolan,S.J.Lippard.A“Turn-On”Fluorescent SensorfortheSelectiveDetectionofMercuricIoninAqueousMedia.J.Am.Chem.Soc. 2003,125,14270-14271；(3)A.B.Descalzo,R.R.Radeglia,K. Rurack,Juan.SotoCouplingSelectivitywithSensitivityinanIntegrated ChemosensorFramework:DesignofaHg²⁺-ResponsiveProbe,Operatingabove500 nm.J.Am.Chem.Soc.2003,125,3418-3419]，激发波长在350-560nm,不但易使生物 本体产生自发荧光干扰，而且短的激发波长还会对细胞产生光致毒，因此这种探针的 应用受到了一定的限制。

双光子荧光汞离子探针是近年来发展的一类探针，这类探针具有近红外激发、暗 场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物 组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等优点。代表性报道为氮硫杂冠醚或开链冠醚 双光子荧光汞离子探针[(1)F.Liu,C.Ding,M.Jin,Y.Tian.Ahighlyselective two-photonfluorescentprobeforthedeterminationofmercuryions.Analyst, 2015,140,3285-3289；(2)C.S.Lim,D.W.Kang,Y.S.Tian,J.H.Han,H.L.Hwang, B.R.Cho.Detectionofmercuryinfishorganswithatwo-photonfluorescentprobe. Chem.Commun.,2010,46,2388-2390；(3)C.Huang,J.Fan,X.Peng,Z.Lin,B.Guo, A.Ren,J.Cui,S.Sun,Highlyselectiveandsensitivetwin–cyano–stilbene–based two–photonfluorescentprobeformercury(ii)inaqueoussolutionwithlarge two–photonabsorptioncross–section,J.Photochem.Photobio.A:Chem.,2008,199 (2–3):144–149]，文献(1)报道的探针不能用于细胞成像，文献(2)虽说能实现成 像，但检测灵敏度不是很理想，文献(3)正是专利申请人开发的同类探针，可惜未曾 用于细胞成像实验。

发明内容

本发明改进现有的汞离子单、双光子荧光探针结构和性能上的不足，设计合成出 适用于活细胞内汞离子检测、性能优良的基于二苯乙烯基双氰基苯类荧光染料的探针 分子作为研究目标。

本发明使用二苯乙烯基双氰基苯类荧光染料，用叔氮原子连接染料母体和识别受 体，使整个分子的吸收和发射红移，染料波长增长。

本发明的细胞内汞离子检测用二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针具有下列结构 通式(I)：

本发明代表性的化合物的合成方法，是让(E)-2,5-二{4-[二(2-(2-羟基乙基硫基)乙 基)氨基]苯乙烯基}对苯二甲腈(Ⅱ)，与2-巯基乙醇(Ⅲ)反应，经过柱分离得到探 针纯品。在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和分析检测方法。

本发明的二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针使用方法没有特殊的限制。通常， 可以将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或由乙腈、丙酮、二甲基亚砜等水溶性有机 溶剂，然后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。

本发明的二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针的具体特征如下：

探针分子单光子与双光子激发分别在467nm与810nm，本身发射在588nm，并且 化学-光稳定性好；探针分子络合汞离子前荧光量子产率较高，络合汞离子后荧光量子 产率降低，可以对汞离子进行单、双光子荧光检测。探针分子对汞离子有很好的选择 性，钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰；探针分子对pH变化不敏感， 在pH4.5—13的范围内，pH变化对荧光发射没有影响；探针分子与汞离子之间的解 离常数在微摩尔级范围内，可以检测微摩尔浓度的细胞汞离子；探针分子细胞渗透性 好，对细胞本身没有毒副作用，适于细胞内汞离子浓度变化的检测。可共聚焦激光显 微镜得到各类活细胞或组织内汞离子的分布荧光图像或假彩比例荧光图像。

附图说明

图1是本发明的荧光探针分子I对汞离子的紫外-可见光滴定。紫外-可见光滴定中 的荧光探针分子I的浓度为箭头表示吸收强度与单光子发射强度随汞离 子浓度的增加而变化的趋势。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。

图2是本发明的荧光探针分子I对汞离子的单光子荧光滴定。单光子荧光滴定中 的荧光探针分子I的浓度为箭头表示吸收强度与单光子发射强度随汞离子 浓度的增加而变化的趋势。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。

图3是本发明的荧光探针分子I对汞离子的双光子荧光滴定。双光子荧光滴定中 的荧光探针分子I的浓度为箭头表示双光子发射强度随汞离子浓度的增加 而变化的趋势。横坐标为波长(nm)，纵坐标为双光子荧光强度。

图4是本发明的荧光探针分子I在不同介质中的双光子激发谱。从上至下三条曲 线分别表示荧光探针分子I在H₂O、toluene和Hg²⁺+H₂O中的双光子吸收截面随双光 子激发波长的变化关系。横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸收截面(GM,1GM≡1×10^-50cm⁴sphoton^-1molecule^-1)。

图5是本发明的荧光探针分子I的双光子荧光滴定中的络合常数拟合曲线图。数 据点表示对应于不同汞离子浓度的相对双光子荧光强度，对这些数据点进行Sigmoidal 拟合得到一条曲线，所得拟合参数即为荧光探针分子I的络合常数，以pk表示。横坐 标为汞离子浓度(mol/L)，纵坐标为相对双光子荧光强度。

图6是本发明的荧光探针分子I对金属离子的单光子选择性示意图。横坐标表示 荧光强度百分淬灭率，纵坐标为不同的离子。

图7是本发明的荧光探针分子I的荧光强度与pH的变化关系。横坐标为pH，纵 坐标为相对单光子荧光强度。荧光探针分子I的浓度为

图8是用本发明的荧光探针分子I研究themousefibroblast细胞内汞离子的共聚 焦双光子荧光显微照片，激发波长为810nm，收集550-650nm通道的荧光。图8a是 白光下的fibroblast细胞；图8b是在fibroblast细胞培养基中加入的荧光探 针分子I，在37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时后，继续加入Hg²⁺，在37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时。所用仪器是共聚焦激光扫 描显微镜，10倍目镜。型号：Zeiss510LSM。

研究探针对汞离子选择性的方法是将探针分子I(探针浓度为)分别加到 不同金属离子(离子浓度为20mmol/L)的缓冲液中，未加金属离子的探针分子溶液的 单光子荧光强度与不同离子溶液的单光子荧光强度的差值对前者的比值即为离子对探 针分子荧光强度的百分淬灭率，作为判断探针分子对该离子的选择性。

研究探针对pH响应的方法是将探针分子(探针浓度为)分别加入离子 离子浓度为20mmol/L和0的水溶液中，调节pH2.0左右，测定荧光强度后，加入碱 液，缓慢增大pH，记录相应的荧光强度变化，以荧光强度变化对pH作图。

探针在细胞内探测汞离子性能的实验方法是将含有探针分子的中性缓冲液加入 到培养好的细胞中，在37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中孵育0.5小时，用上述缓冲 溶液或培养液充分洗涤后，用双光子荧光显微镜成像得到空白图像。向上述含探针的 细胞培养液中加入Hg(NO₃)₂溶液(最终浓度为)于37℃、含5％CO₂的细 胞培养箱中孵育0.5小时，用培养液冲洗后，再进行双光子荧光显微成像得到细胞内 汞离子的分布图像，由此得到汞离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。

探针的应用方法是将溶解于有机溶剂或有机/水混合溶剂中的这类探针加入到被 测的含汞离子的细胞的培养液中，使探针浓度在被测细胞与探针在10-40 ℃和含1-10％CO₂气氛的细胞培养箱中孵育0.1-10.0小时后，探针透过细胞膜，与细 胞内汞离子络合发生荧光变化，用不含探针和汞离子的水溶液或培养液充分洗涤后， 细胞在双光子荧光显微镜下得到汞离子分布的荧光图像。由此得到汞离子的存在、细 胞内的区域分布和浓度信息。最佳孵育条件为：温度为37℃，含5％CO₂的细胞培 养箱中孵育0.5-1.0小时。

本发明涉及的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该系列探针分子对pH 变化不敏感，响应时间极短，检测灵敏度较高，细胞渗透性良好，对细胞的毒副作用 小，使得这类探针作为测定生物体内的汞离子浓度快速变化的试剂是极其有用的。这 类探针具有如下特点：

第一，本发明双光子荧光探针分子激发和发射光谱在可见光区，荧光量子产率高， 双光子吸收截面大，分子体积小，并且化学/光稳定性好。

第二，本发明荧光探针分子的设计基于分子内光诱导电荷转移(ICT)原理，探 针分子络合汞离子前后荧光强度发生显著的变化，可以检测汞离子含量。双光子荧光 探针分子对汞离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰。 另外双光子荧光探针分子对pH变化不敏感，在pH4.5—13的范围内，pH变化对荧光 发射没有影响。

第三，本发明双光子荧光探针分子与汞离子之间的络合常数在微摩尔级范围内， 可以检测微摩尔浓度的细胞内汞离子。

第四，探针分子细胞渗透性好，对细胞本身毒副作用小，适于细胞内汞离子浓度变 化的检测。

具体实施方式

实施例1

探针I的合成：

(a)POCl₃/DMF,90℃,2h(95％)；(b)Br₂/CH₂Cl₂,nolight,20℃,24h(90％)；(c)CuCN/DMF,150℃,48h (78％)；(d)NBS/CCl₄,6h(15％)；(e)P(OEt)₃/toluene,120℃,5h(96％)；(f)NaH(2equiv)/THF,12h(65％)； (g)K₂CO₃/MeCN,HS(CH₂)₂OH,40℃,12h(86％).)

(1)中间体2的合成

除水DMF(30.0g，411mmol)加到带干燥管的100mL单口圆底烧瓶中，搅拌冰水浴 冷却到0℃，撤掉干燥管，插上装有POCl3(27.6g，181.5mmol)的恒压加料器，于 0℃下搅拌逐滴滴加POCl3，滴加完后于0℃继续反应45min，再于0℃下一次性加入 N,N-二羟乙基苯胺(10.0g，55mmol)的DMF(10.0g，137mmol)溶液，然后慢慢升 至110℃再继续反应2h，冷却后倒入0.5L冰水中，搅拌滴加1MNaOH溶液调pH至 7附近，过滤水洗(3×100mL)，将固体粗品用乙醇(2×300mL)重结晶，得白色针 状晶体。产率96％(12.9g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:9.774(s,CHO,1H)，7.767 (d,J＝9.2Hz,2H),6.745(d,J＝8.8Hz,2H),3.843(t,J1＝J2＝6.8Hz,2CH2Cl,4H), 3.684(t,J1＝J2＝6.8Hz,N(CH2)2,4H)。13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:190.296， 151.089,132.385,126.760,111.389,53.319,40.157。MS,m/z:C11H13Cl2NO(M+)的计 算值(实测值)：245.0374(245.0371)。

(2)中间体4的合成

用量筒量取二氯甲烷(50mL)，置于150mL双口圆底烧瓶中，用移液管准确量取对二甲 苯(16.96g，0.16mol，19.8mL)滴入到二氯甲烷中，称取单质碘(0.1g，0.8mmol)加到 混合液中，在烧瓶的其中一个开口装上空气冷凝管并接上尾气回收装置，烧瓶的另一 个开口装上恒压加料器，并用移液管准确量取液溴(18mL)转移到恒压加料器中，并于 液溴顶面加一层水(约0.3～0.5cm)以防液溴挥发，再于恒压加料器的顶口加盖塞子。 将反应体系的温度控制在12℃，在强烈搅拌和避光的条件下，将液溴逐滴滴加到混合 液中(滴加时间40～50min)，注意不要把上部的水层滴入反应液中。反应18h。待反应 完毕后，加入40mLw(KOH)＝25％的水溶液,再强烈搅拌30min。将反应混合液转入到 分液漏斗中，分出下层有机相,并用水洗涤(2×50mL)，加入无水CaCl₂干燥，过滤， 减压脱除溶剂，残余物用乙醇(2×300mL)重结晶，得白色针状晶体，产率96.5％(40.44 g)，熔点73.5～75℃，与文献值近似。¹HNMR(400MHz,DMSO-d⁶)，δ:7.581(s,2H), 2.293(s,6H)。MS,m/z:C₈H₈Br₂(M⁺)的计算值(实测值)：261.8993(261.9214)。

(3)中间体5的合成

2，5－二溴对二甲苯(30mmol)与CuCN(8.1g，90mmol)于100mLDMF中在155℃下 回流反应48h，冷却后将混合物倒入500mLw(NH₃·H₂O)＝15％的氨水中，过滤收集沉 淀并分别用500mLw(NH₃·H₂O)＝15％的氨水、500mL水洗涤，固体于真空烘箱中干 燥后溶于100mL氯仿中，再通过一根短的硅胶柱用氯仿洗脱，脱除溶剂得固体粗品， 再用300mL乙醇重结晶，得白色针状晶体，产率87.4％(4.09g)，熔点210～212℃。 ¹HNMR(400MHz，DMSO-d⁶)，δ:7.900(s，2H),2.474(s,6H)。MS,m/z:C₁₀H₈N₂(M⁺) 的计算值(实测值)：156.0687(156.0723)。

(4)中间体6的合成

用分析天平准确称取2，5－二甲基对苯二甲腈(1.560g，10.0mmol)、偶氮二异丁腈 (0.082g，0.5mmol)与NBS(3.916g，22.0mmol)置于干燥的250mL单口圆底烧瓶中， 再用量筒量取100mL四氯化碳倒入烧瓶中，装上回流冷凝管，抽真空并用氩气保护， 将烧瓶置于事先加热到80℃以上的油浴中，强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速 回流，至快速回流后再将反应体系温度调至80℃反应16h。反应完毕后，将反应混合 物冷却到室温再过滤，并用CCl₄(3×20mL)洗涤，减压浓缩滤液成棕红色黏滞油状物， 加入乙醇(20mL)稍加热使之溶解，转入到烧杯(100mL)中,并用乙醇(3×10mL)洗涤烧 瓶，将洗液一并倒入到烧杯中，室温搁置至总体积达10mL或更少时，再抽滤得白色 粉末状产品。粗品经硅胶柱色谱分离〔洗脱液:v(正己烷):v(乙酸乙酯)＝12:1〕，得 白色粉末，产率31.6％(0.98g)，熔点163.5～165℃。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)， δ:7.865(s,2H),4.614(s，4H)。MS,m/z:C₁₀H₆Br₂N₂(M⁺)的计算值(实测值):311.8898 (311.8898)。

(5)中间体7的合成

2,5-二溴甲基对苯二甲腈(314mg,1.0mmol)和亚磷酸三乙酯(500mg,3.0mmol)加热 到165℃反应18h，减压除去过量的亚磷酸三乙酯，残余物用v(正己烷):v(乙酸乙 酯)＝1:1重结晶，得白色晶体，产率65％(280mg)。

(6)中间体8的合成

将N，N-二(2-氯乙基)苯甲醛(2)(1.25g,5.1mmol)置于25mL圆底单口烧瓶中，再加 入3mLTHF和NaH(130mg，5.4mmol)，抽真空充氩气保护，于冰水浴下边搅拌边滴 加1,4-二氰基-2,5-二(二乙基磷酰基甲基)苯(7)(1.07g，2.5mmol)的THF(9mL)溶液。 滴加完后再于冰水浴下反应1h，撤去冰水浴于室温下反应12h。并于室温下继续反应一 夜。旋干，用CH₂Cl₂(4×10mL)洗提，CH₂Cl₂洗提液用H₂O(2×10mL)洗涤后加无水 Na₂SO₄干燥，过滤旋干并用硅胶柱层析[洗脱液：v(CH₂Cl₂):v(石油醚)＝4:1]分离，得 黄色粉末，产率65％(0.995g)。IR(KBr)cm^-1:2223(C≡N)and1594～1348(C＝C).HRMS(EI) m/z:610.1225(calcdforC₃₂H₃₀Cl₄N₄:610.1225).¹HNMR(DMSO-d⁶,400MHz)ppm:8.446(s, 2H,Ph),7.620(d,2H,J＝16.4Hz,CH＝CH),7.498(d,4H,J＝8.4Hz,Ph),7.054(d,2H,J＝16.4 Hz,CH＝CH),6.844(d,4H,J＝8.8Hz,Ph),3.772(t,8H,J₁＝J₂＝4.4Hz,NCH₂),3.712(t,8H,J₁＝ J₂＝2Hz,CH₂Cl).Elementalanalysis:calculatedforC₃₂H₃₀Cl₄N₄(MW612.42)C62.76,H4.94, Cl23.16,N9.15％；FoundC62.80,H,4.98,Cl23.13,N9.10％.

(6)探针I的合成

在50mL圆底烧瓶中加入2,5-二(4-[二(2-氯乙基)氨基]苯乙烯基)对苯二甲腈(8)(612 mg,1mmol)、巯基乙醇(195mg,2.5mmol)、无水碳酸钾(414mg,3mmol)和丙酮(25 mL)，氮气保护下搅拌回流反应24h(薄板跟踪)。反应完后，过滤脱除溶剂，残余物用 硅胶柱色谱[洗脱液：V(CH₂Cl₂):V(acetone)＝2:1]分离，所得粗品用甲醇重结晶，得红 棕色毛针状固体，产率58％(451mg)。IR(KBr)cm^-1:3422(OH),2922(CH),2220(C≡N) and1631～1349(C＝C).HRMS(EI)m/z:778.2715(calcdforC₄₀H₅₀N₄O₄S₄:778.2715).¹H NMR(CHCl₃-d,400MHz)ppm:8.442(s,2H,Ph),7.620(d,2H,J＝16.0Hz,CH＝CH), 7.513(d,4H,J＝8.8Hz,Ph),7.055(d,2H,J＝16.0Hz,CH＝CH),6.789(d,4H,J＝8.4Hz, Ph),4.918(t,8H,J＝4.8Hz,4×OCH₂),3.633(t,8H,J₁＝J₂＝6.0Hz,4×NCH₂),2.791(t, 8H,J₁＝6.8Hz,J₂＝7.6Hz,4×SCH₂),2.728(t,8H,J₁＝6.8Hz,J₂＝6.4Hz,4×SCH₂), 2.564(s,4H,4×OH).¹³CNMR(CHCl₃-d,100MHz)ppm:147.68,138.02,134.96,129.36, 128.88,123.48,117.03,116.12,113.15,111.64,61.23,50.69,34.11,28.69.Elemental analysis:calculatedforC₄₀H₅₀N₄O₄S₄(MW779.11)C61.66,H6.47,N7.19,O8.21,S 16.46％；FoundC61.71,H6.54,N7.16,O8.17,S16.42％.

实施例2

探针I对汞离子选择性：

使用上述合成的化合物I评价对汞离子的选择性。将探针分子I(探针浓度为)分别加到不同金属离子(离子浓度为20mmol/L)的缓冲液中，未加金属离 子的探针分子溶液的单光子荧光强度与不同离子溶液的单光子荧光强度的差值对前者 的比值即为离子对探针分子荧光强度的百分淬灭率，作为判断探针分子对该离子的选 择性。探针单、双光子激发波长分别为467nm与810nm，发射波长为588nm，测试结 果显示于图6中。从图中可以看到，探针I对汞离子具有很高的选择性，汞离子的加入 产生很大的荧光淬灭，另外钠、钾、钙、镁、锰等金属离子对检测没有干扰。

实施例3

探针I对pH的不敏感性：

使用上述合成的化合物I评价对pH的响应，将探针分子(探针浓度为) 分别加入离子离子浓度为20mmol/L和0的水溶液中，调节pH2.0左右， 测定荧光强度后，加入碱液，缓慢增大pH，记录相应的荧光强度变化，以荧光强度变 化对pH作图，测试结果显示于图7中。从图中可以看出在pH4.5—13的范围内，pH 变化对荧光发射基本没有影响。因此探针I可用于大pH范围内的细胞内汞离子的检测。

实施例4

细胞培养：

成纤维细胞由DEME(Invitrogen)培养液培养，成像的前一天，细胞放于平底表 面皿中，成像时细胞放于含有5％CO₂和的探针I缓冲液于37℃、含5％ CO₂的细胞培养箱中孵育0.5-1.0小时，用中性缓冲溶液或培养液充分洗涤后(洗涤三 遍以上)，用双光子荧光显微镜成像得到空白图像(图8a)。向上述含探针的细胞培养 液中加入Hg(NO₃)₂溶液(最终浓度为)在37℃、含5％CO₂的细胞培养箱 中孵化0.5小时，用培养液冲洗三遍后，再进行双光子荧光显微成像得到细胞内汞离 子的分布图像(图8b)。其中图8a是在DC细胞培养基中加入的荧光探针 分子I孵育1小时后(未加入汞离子)；图8b是在DC细胞培养基中加入荧光探针分 子I孵育0.5小时后，继续加入Hg(NO₃)₂孵育0.5小时。所用仪器是共聚焦 双光子激光扫描显微镜，10倍目镜，型号：Zeiss510LSM。