通过尖孢镰刀菌发酵改性小百部富集红苋甾酮的新方法

摘要

本发明公开了一种通过微生物发酵改性中药材的手段大量富集红苋甾酮的方法。即：中药材小百部经尖孢镰刀菌发酵改性，经过合适的溶剂超声提取，过滤，浓缩后，结合TLC薄层层析法以及高效液相色谱法，可检测到大量的红苋甾酮的产生。到目前为止，该方法是一种高效的，创新性的，反应条件温和的，绿色无污染的，易扩大化生产的，操作设备简单的大量富集红苋甾酮的方法，不仅满足了现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期红苋甾酮的进一步研究和开发奠定了坚实的基础。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物改性植物化学成分领域，具体来说是建立了一种通过植物病原真菌尖孢镰刀菌改性小百部来大量富集红苋甾酮的方法。

背景技术

小百部又名滇百部，为百合科（Liliaceae）天门冬属（Asparagus）植物羊齿天门冬AsparagusfilicinusBuch.-Ham.exD.Don的块根，主产于云南和四川，为云南彝族和傣族的习用药物。其味甘苦，性平，民间多用于治疗气管炎，肺炎和咳嗽，在云南省的一些地区，也作为中药百部的代用品。现代药理学研究表明小百部具有较强的抗肿瘤作用，超过了同属植物抗癌保健药芦笋，同时还具有显著的抗二氧化硫毒气、抑菌以及镇咳等药理活性，是一种具有良好开发前景的天然药物。有关该属植物化学成分研究表明，甾体皂苷为该属植物主要成分。迄今为止，已经发现了12个甾体皂苷、5个蜕皮甾酮类化合物、2个木脂素类化合物和1个苯丙素类化合物。其中蜕皮甾酮、20-羟基蜕皮甾酮、stachysteroneC、20,22-异丙亚二氧基蜕皮甾酮这四种化合物含有相同的母核结构。

红苋甾酮（Rubrosterone）是一种含有19个碳的植物甾酮类化合物，它于1963年首次从牛膝中分离得到。前期研究表明红苋甾酮具有较强的抗糖尿病活性，在离体条件下诱导果蝇器官芽外翻，并且高效的刺激小鼠肝脏蛋白质的合成。毫无疑问，红苋甾酮还可能具有更多的其它生物活性以及应用开发价值。但是，到目前为止，能够分离得到红苋甾酮的生物种类有限，分离过程也比较繁杂。而红苋甾酮的合成过程也相当复杂，根据目前的报道，可以以dehydroepiandrosterone或3α,5α-cycloandrostane-6,17-dione为底物分别通过20步或7步合成得到。

然而，合成过程也需要用到复杂的生产设备，对生产环境也有相当高的要求，并且转化率较低。因此，我们更需要一种简便易行的，绿色无污染的，高效的产生红苋甾酮的方法。

近年来，因为微生物生长周期短、避免了因条件剧烈而产生不必要的副反应的特点以及微生物转化反应条件温和、副产物少、立体选择性强等优点，利用微生物（真菌、细菌以及藻类）发酵改性的方法越来越受到人们的重视。在实际生产中，已经有大量的应用实例通过微生物的发酵来生产一些新颖的、活性较高的以及对人体健康有益的食品或药物等。

发明内容

本发明旨在通过植物病原真菌尖孢镰刀菌发酵改性传统中药材小百部，从而达到高效富集红苋甾酮的目的，本发明克服了红苋甾酮在常规中药材中含量少，合成成本高，合成过程复杂，转化率低等缺点，提供了一种转化率高，设备要求低，简便易操作，绿色无污染，适合产业化生产的富集红苋甾酮的方法。

本发明另一个目的在于利用植物病原真菌尖孢镰刀菌来发酵改性小百部，从而达到了高效富集红苋甾酮的效果。此种方法简便易行，对设备要求低，绿色无污染，是一种非常适用于工业化生产的方法。

本发明的目的是通过以下具体技术方案实现的：

尖孢镰刀菌的活化：

本发明所用的尖孢镰刀菌首先进行活化，即将尖孢镰刀菌接种到经过121°C高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养1-7d后置于4°C冰箱中。

药材前处理：

取干燥的小百部药材粉碎后，取适量的药材粉末置于锥形瓶中，加入自来水浸润后，观察药材的湿润度。将装有药材的锥形瓶加塞包装后置于121°C高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将药材冷却。

药材接菌：

将活化好的尖孢镰刀菌菌丝在无菌环境下接种到经过前处理的小百部上，加塞包装后置于培养箱中培养5-20d后取出。

提取、分离、纯化：

微生物发酵后的小百部经过甲醇溶液超声提取，过滤，浓缩得到粗提物。经TLC（薄层层析法）薄层层析法检测，分别与原药材和空白发酵组进行对照。然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇（此二元溶剂的体积比由90:1逐渐变动为3:1），再将这部分用石油醚：丙酮（此二元溶剂的体积比由6:1逐渐变动为2:1）洗脱，然后经分离得到的化合物上凝胶柱纯化，通过¹H-NMR（核磁共振氢谱），¹³C-NMR（核磁共振碳谱）以及HR-ESI-MS（电喷雾高分辨率质谱）鉴定得到化合物结构。

分离得到的红苋甾酮（Rubrosterone）和前体化合物20-羟基蜕皮甾酮（20-hydroxyecdysone）的结构式如下：

其中所述浸润小百部的自来水量要刚好使药材保持湿润状态。

用于提取的甲醇溶液为体积比为40%-90%的水溶液。

采用本发明微生物发酵小百部富集红苋甾酮的方法，与现有技术相比，本发明的制备方法优点在于：

（1）选用小百部为原料，一步催化反应即可转化生成红苋甾酮；

（2）选用微生物酶为催化剂，其本质是蛋白质，具有强的区域选择性，立体选择性和高度的专一性，而且催化反应条件温和，不需要化学试剂的参与以及化学反应的高温高压等条件。

综上所述，该发明方法采用的原料便宜易得，反应条件温和、容易控制，环境无污染，设备要求简单，适宜扩大化生产的富集红苋甾酮的工艺方法。

附图说明：

图1为本发明中目标化合物的¹H-NMR；

图2为本发明中目标化合物的¹³C-NMR；

图3为本发明中目标化合物的HR-ESI-MS；

图4为本发明中原药材粗提物、空白发酵粗提物、尖孢镰刀菌发酵粗提物、20-羟基蜕皮甾酮以及红苋甾酮的分析色谱图；其中(a)是20-羟基蜕皮甾酮的分析色谱图、（b）是原药材粗提物的分析色谱图、(c)是空白发酵粗提物的分析色谱图、（d）是红苋甾酮的分析色谱图、(e)是尖孢镰刀菌发酵粗提物的分析色谱图。

具体实施方式：

下面结合实施例进一步阐述本发明，但本发明不局限于该具体实施例，本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。

实施例1

1.菌种和药材：

植物病原真菌尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）是由云南省微生物研究所提供，小百部于2013年11月购自于昆明药材市场。

2.菌种活化：

植物病原真菌尖孢镰刀菌首先必须在培养基上进行活化，即将尖孢镰刀菌接种到121°C高温灭菌处理的PDA斜面培养基上，在培养箱中培养1-7d后取出放在4°C冰箱中，备用。

3.药材前处理：

称取药材粉末于锥形瓶中，用适量自来水润湿，加塞包装后置于121°C高温灭菌箱中灭菌30min。

4.药材接菌：

尖孢镰刀菌菌丝在无菌环境下接种到经过前处理的小百部上，加塞包装后置于25-37°C的培养箱中培养5-20d后取出。

5.提取：

微生物发酵后的小百部经过甲醇溶液超声提取，过滤，浓缩得到粗提物。

6.空白发酵组、原药材组的处理过程：

空白发酵组不经过接菌处理，其他处理过程和尖孢镰刀菌发酵组一致。原药材组只用自来水浸润，其他处理过程和尖孢镰刀菌发酵组一致。

7.原药材组、空白发酵组、尖孢镰刀菌发酵组粗提物TLC检测：

分别将原药材组、空白发酵组、尖孢镰刀菌发酵组粗提物用适量的溶剂溶解后，TLC薄层板分析。

8.原药材组、空白发酵组、尖孢镰刀菌发酵组化合物成分及含量的检测：

采用HPLC检测各实验组化合物成分及含量的变化，具体检测方法如下：

（1）试剂

甲醇（HPLC级）购自于FisherChemicals(NJ,USA)，实验用水通过纯水系统得到（成都，中国），甲醇等所有试剂为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

（2）溶液制备

A标准溶液的制备

分别称取5.0mg20-羟基蜕皮甾酮和红苋甾酮，配制成1.00mg/mL的标准贮备液，取标准贮备液将其稀释成0.20mg/mL的标准溶液，备用。

B供试品溶液的制备

分别称取10.0mg原药材、空白发酵、尖孢镰刀菌发酵的小百部的粗提物，配制成5.00mg/mL的样品溶液，备用。

（3）检测方法的考察

20-羟基蜕皮甾酮和红苋甾酮均在0.002mg/ml-0.2mg/ml范围内线性关系良好；同一样品分别重复测定6次，计算RSD分别0.23%和0.18%，精密度良好；分别取0.002mg/ml、0.02mg/ml、0.2mg/ml的20-羟基蜕皮甾酮和红苋甾酮溶液进行HPLC分析，外标法计算实测值，与真实值比较，回收率为97.5-103.9%，准确度好。以上结果表明，该方法适用于20-羟基蜕皮甾酮和红苋甾酮的检测。

（4）样品的测定

以上配好的溶液经0.45μm的过滤膜后注入HPLC系统，流动相由A液(水)、B液（甲醇）和C液（乙腈）组成，洗脱程序如下：0~5min，5-10%（v/v）B，5-10%C；5~10min，10-30%B，10-20%C；10~20min，30-48%B，20-32%C；20~40min，48%B，32%C；40~43min，48-40%B，32-60%C；43~50min，40-5%B，60-5%C；流速为1.0mL/min，柱温为25°C，UV检测波长为245nm，进样量为原药材组、空白发酵组20μl，尖孢镰刀菌发酵组10μl，标准加入法用来定性，外标法计算相应结果，实验结果如下：

表1：20-羟基蜕皮甾酮在原药材、空白发酵小百部中的含量以及红苋甾酮在尖孢镰刀菌发酵小百部中的含量^a,b

样品20-羟基蜕皮甾酮红苋甾酮原药材组3.3144±0.0368–空白发酵组3.3381±0.0022–尖孢镰刀菌发酵组3.5563±0.0189

^a每组测量结果均用mean±SD（n=3）表示；

^b测量的含量值用μg化合物/mg小百部表示。

表1的结果表明：小百部药材经过尖孢镰刀菌发酵后，其化合物的成分确实发生了变化。其中大量含有的20-羟基蜕皮甾酮，在尖孢镰刀菌的作用下，转变为了在植物界中含量较少的红苋甾酮。而且根据化合物含量的计算，我们可以看出，20-羟基蜕皮甾酮和红苋甾酮基本实现了1:1的转化，这个结果在之前的研究中是没有发现的。因此，其完全可以作为一种高效的、绿色污染的、对设备要求低的生产红苋甾酮的方法，对于我们以后对红苋甾酮的进一步研究提供了有利的条件。

本实验室先前的研究表明利用植物病原真菌发酵的方法可以有效地提高白及和小白及的总酚含量和抗氧化活性，为传统中药材的炮制提供了一种新的思路。此外，微生物发酵可高效的修饰一些化学成分，例如甾体、生物碱、皂苷、酚类化合物等，不仅节省了合成过程中的生产成本，而且避免了化学试剂的使用，不失为一种符合现代绿色化学和可持续发展化学的高效，简便的生产方式。

本发明转化率高的，绿色无污染，简便易行，反应条件温和的高转化率富集红苋甾酮表现在：红苋甾酮和前体化合物实现等量转化，转化率接近100%。