一种提高竹材纤维素高浓酶水解产可发酵糖效率的方法

摘要

本发明公开了一种提高竹材纤维素高浓酶水解产可发酵糖效率的方法，其步骤为：原料切削和筛选；第一步无酸催化的高沸点醇预处理；第一步预处理所得固体基质的分散处理；第二步无酸催化醇/水预处理；第二步无酸催化醇/水预处理所得固体基质的超声处理；超声处理所得固体基质的洗涤；洗涤后固体基质的高浓酶水解。本发明耦合两步预处理和超声处理可高效移除竹材原料中的半纤维素和木素，同时确保纤维素降解率处在较低水平。当固体基质作为酶水解底物的质量浓度为20%时，进一步添加半纤维素酶后，竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率分别高达82.34%和75.38%。可避免废液中半纤维素糖的降解和木素的缩合。

说明书

技术领域

本发明涉及一种竹材资源转化利用的技术领域，具体地说，是涉及一种可有效提高竹材纤维素高浓酶水解产可发酵糖效率的综合处理方法。

背景技术

由于人类社会对化石能源的依赖程度不断增大以及我国逐步限制以粮食为原料来生产生物能源（如生物乙醇），利用木质纤维原料生产生物燃料（特别是燃料乙醇）已成为我国最重要的研究领域之一。纤维素燃料乙醇的生产过程主要包括预处理、酶水解、发酵、蒸馏等四个主要的单元操作，其中高效地将木质纤维原料中纤维素水解为可发酵糖（即酶水解）是其中最为关键环节。然而，天然进化过程使木质纤维原料结构非常致密，半纤维素和木质素显著阻碍了纤维素酶对纤维素的水解。为了克服这种阻碍作用，预处理已成为纤维素燃料乙醇生产过程中必不可少的工艺。

对于常见的木质纤维原料，如桉木、杨木、马尾松等，已开发出多种预处理方法（如酸法、碱法、蒸汽爆破、酸/碱催化的有机溶剂（如乙醇法）等）均可显著提高木质纤维原料中纤维素低浓（如2%）酶水解的转化率。然而，生产成本过高仍然是阻碍纤维素燃料乙醇工业化进程的最大障碍。其中，最为直接的便是乙醇的蒸馏成本，其约占整个木质生物乙醇投资成本的30%。而致使乙醇蒸馏成本过高的直接原因便是经发酵产生的乙醇浓度无法达到经济性蒸馏目标（4%,v/v），其蒸馏所需的能耗过高。很显然，如果采用高底物浓度并能进行有效酶水解，提高发酵液中供微生物发酵的可发酵糖浓度，经发酵提高最终发酵液中乙醇浓度就可从根本上解决上述发酵液中乙醇蒸馏能耗过高的问题。然而，现有的实践表明，在相同底物和除底物浓度外相同的酶水解条件下，酶水解转化率随木质纤维原料底物浓度的增加而不断下降。因此，高浓酶水解效率低下已成为木质纤维原料转化为乙醇过程中亟待解决的技术瓶颈问题。

经研究发现，残留在预处理所得固体基质中非纤维组分（半纤维素和木素）对纤维素酶可产生明显的无效吸附。当酶水解底物浓度较低时（如2%，w/w），固液体系中存在大量自由水，纤维素酶较易脱附于非纤维素组分，进而再次作用于底物中的纤维素，最终提高酶水解的效率；然而，当酶水解底物浓度较高时（如18%以上，w/w），固液体系中自由水较少，体系黏度较大，非纤维素组分的浓度（w/w）显著增大，无效吸附的纤维素酶难以脱附于非纤维素组分，单位时间内可作用于底物中纤维素的酶分子数量显著减少，导致高浓酶水解效率下降，过程生产成本依然较高。由此可见，导致纤维素燃料乙醇生产效率低下、造成最终生产成本过高的主要原因之一仍然是低效率的预处理方法或工艺。开发出一种可清洁高效分离半纤维素和木素的预处理方法或工艺将是解决上述技术瓶颈问题的根本途径，其对我国纤维素燃料乙醇早日实现工业化也将具有重要意义。

目前，已开发的典型预处理方法主要有热水、稀酸、稀碱、蒸汽爆破、酸性亚硫酸盐、酸催化的有机溶剂、离子液体等。但对于实现三大组分高效清洁分离以及提高木质纤维原料中纤维素高浓酶水解效率而言，这些预处理方法均或多或少地存在一定的缺陷。酸法预处理（如热水、稀酸和酸性亚硫酸盐）可使半纤维素显著溶出，但木素大量残留于固体基质中，其可使大量的纤维素酶发生无效吸附，固体基质中纤维素高浓酶解效率难以提高。稀碱预处理则可部分溶出木素，但半纤维素也显著阻碍固体基质中纤维素对酶的可及性。蒸汽爆破预处理虽然可显著破坏木质纤维原料细胞壁的组织结构，但非纤维素组分大量残留于固体基质中。尽管离子液体预处理可同步高效地溶出木素和半纤维素，最终固体基质中纤维素高浓酶解效率也得以明显提高，但离子液体价格昂贵，且其大量残留于固体基质中，如不得以洗脱，其将显著抑制纤维素酶和发酵微生物的作用效率，但洗净需消耗大量的水。酸催化的有机溶剂可实现类似于离子液体预处理作用，且溶剂易于洗涤和回收，但为使半纤维素和木素达到理想的溶出量，其需要提高酸催化剂的浓度或预处理温度，这使得纤维素发生明显的降解，即便固体基质中纤维素高浓酶水解转化率得以提高，最终葡萄糖回收率仍然较低，酶解液中可发酵葡萄糖浓度也较低。由此可见，现有预处理方法均难以同时达到“非纤维素组分溶出率高、纤维素降解率低、固体基质中纤维素高浓酶解效率高”等多重要求。

因此，部分中国专利采用预处理后酶解添加表面活性剂或者两步预处理的方法来实现提高固体基质中纤维素高浓酶水解的目标：

（1）一种木质纤维素酸碱耦合预处理方法，公开（公告）号：CN102153763A；

（2）一种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法，公开（公告）号：CN103184258A；

（3）一种蔗渣生物质组分高效分离的组合预处理方法，公开（公告）号：CN102180994A；

（4）一种木质纤维素生物质的综合利用方法，公开（公告）号：CN103045697A；

（5）一种木质纤维类生物质高效酶水解的方法，公开（公告）号：CN102174594A；

（6）一种提高同步糖化发酵木质纤维素乙醇得率的方法，公开（公告）号：CN103290067A；

（7）一种秸秆类木质纤维素高效糖化半酶解同步发酵产乙醇的方法，公开（公告）号：CN101899478A；

（8）高固体含量木质纤维素原料生产乙醇的生物反应器，公开（公告）号：CN102154381A；

专利文献（1）~（4）是耦合酸法和碱法两步预处理后进行酶水解的专利。专利文献（1）第一步预处理是低温酸法预处理（包括有机酸和无机酸），第二步是采用低温碱法预处理（包括氨水和NaOH等）；专利文献（2）第一步预处理是碱氧预处理（由NaOH和H₂O₂溶液组成），第二步是采用稀酸预处理（主要是无机酸）；专利文献（3）是由稀酸浸渍的蒸汽爆破和醇碱预处理组成。当纤维素酶用量在5~60FPU/g纤维素时，尽管专利文献（1）~（3）固体基质中纤维素酶水解转化率达80%以上，但底物浓度均低于10%(w/w)，这与本发明所侧重于高底物浓度酶水解(18%以上，w/w)有本质区别。专利文献（4）是由无机酸和稀碱预处理组成的两步预处理，当酶水解底物浓度提高至15%时，纤维素酶水解转化率低于80%，且耦合酸碱两步预处理所产生预处理废液难以处理。专利文献（5）采用一步高温液态水预处理，当底物浓度为30%时，尽管固体基质中纤维素酶水解转化率接近90%，但是预处理所用原料需粉碎至40~60目尺寸，对于木质生物质而言，原料机械粉碎至该尺寸需消耗较高的能耗；此外，酶解过程还需添加0.075~0.2ml/g固体基质的Tween80表面活性剂，这将使后续乙醇蒸馏后的废液难以处理。专利文献（6）和（7）是采用一步蒸汽或稀碱预处理后同步或半同步糖化和发酵产乙醇，专利文献（8）是开发高固体含量木质纤维素原料生产乙醇的生物反应器，这与本发明有本质区别。尽管木质纤维原料预处理提高纤维素酶水解的发明还有较多，但其所采用的预处理或酶水解方法与本发明存在较大区别，在此不再一一赘述。

发明内容

本发明的目的在于克服现有预处理方法应用于竹材纤维素高浓酶水解的缺陷，提供一种可有效提高竹材纤维素高浓酶水解产可发酵糖效率的综合处理方法。

为实现本发明的目的，采用的技术方案是：所述的一种提高竹材纤维素高浓酶水解产可发酵糖效率的方法，包括如下步骤：

（1）选取2~3年生竹材，经削片成竹片，如：三维尺寸为20×15×4mm的竹片，将其作为原料进行后续预处理；

（2）第一步高沸点醇预处理，其技术条件为：将步骤（1）制得的竹片原料放入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往小罐的罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中的固定支架上，盖上油浴反应器的盖子后进行预处理，预处理温度200~210℃，温度优选控制误差为±2℃，预处理时间35~45min，上述预处理所需的溶液为高沸点醇预处理液，所述高沸点醇预处理液由高沸点醇和去离子水组成，其中高沸点醇在高沸点醇预处理液中的体积比以ml:ml计为大于8%小于等于15%；高沸点醇预处理液和竹片原料质量的比值以ml:g计为5~7，油浴反应器支架的转动速度为3~5rpm，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却至室温，然后将小罐内的固液混合物在60目的尼龙网袋中过滤，固体和液体分离后得预处理液和固体基质；

（3）固体基质的分散处理，其技术条件为：将步骤（2）所得的固体基质在植物粉碎机中进行处理，以降低固体基质中纤维束的尺寸，每次取步骤（2）获得的固体基质20g，装入捣碎罐中，在8000~12000r/min的剪切搅拌速度下处理20~30s，处理完成后，获得较分散的、纤维状的固体基质；

（4）第二步醇/水预处理，将步骤（3）制得的含纤维状的固体基质再次装入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往小罐的罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中进行预处理，其技术条件为：预处理温度160~170℃，温度优选控制误差为±2℃，预处理时间60~90min，醇/水预处理液由高沸点或低沸点醇和去离子水组成，其中高沸点或低沸点醇在醇/水预处理液中的体积比以ml:ml计为大于等于50%小于等于70%，醇/水预处理液和固体基质绝干质量的比值以ml:g计为8~15，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却，然后将小罐内的固液混合物在垫有双层滤纸的布氏漏斗上过滤，将固体和液体分离，得经第二步预处理的固体基质；

（5）第二步无酸催化醇/水预处理所得固体基质的超声处理，其技术条件为：将步骤（4）预处理后获得的固体基质装入带有钻孔橡皮塞的三角瓶，往三角瓶中加入新鲜的醇/水混合溶液，其中醇在新配置的醇/水预处理液中的体积比以ml:ml计为大于等于50%小于等于70%，新配置的醇/水预处理液和绝干固体基质质量的比值以ml:g计为8~15，再将此三角瓶放入一个大烧杯中，往烧杯内和血清瓶外的区域加入冰水混合物，然后将超声探头通过钻孔橡皮塞放入到三角瓶中的液体液面2/3以下的位置处，开始进行超声处理，其技术条件为：超声处理的功率为500~700W，超声处理时间30~60min，超声处理完成后，立即将三角瓶取出，然后在垫有双层滤纸的布氏漏斗上过滤，将固体和液体分离，得经超声处理的固体基质；

（6）超声处理所得固体基质的洗涤，其技术条件为：将步骤（5）所得的固体基质置于一个大烧杯中，用去离子水对固体基质进行洗涤，所述去离子水与固体基质以体积和质量的比值ml:g计为6~10，磁力搅拌速度为300~600r/min，洗涤时间为30~60min，洗涤温度为室温，重复洗涤1次后，在垫有双层滤纸的布氏漏斗上将固体基质和洗涤液进行分离，得经洗涤处理的固体基质；

（7）洗涤后固体基质的高浓酶水解，其技术条件为：将步骤（6）制得的固体基质加入到水热釜的聚四氟乙烯内衬中，将此内衬装入水热釜内，拧紧水热釜的盖子，然后将密封的水热釜安装到空气浴均质反应器的支架上，关上均质反应器的门后开始进行固体基质的高浓酶水解，其技术条件为：固体基质作为底物的质量比浓度为18%~25%，所述%指质量百分比，g:g，空气浴均质反应器的空气温度为55~60℃，温度优选控制误差为±1℃，支架转动速度为200~250r/min，酶采用纤维素酶、纤维二糖酶和半纤维素酶，所述纤维素酶、纤维二糖酶和半纤维素酶用量分别为15~20FPU/g、22.5~30CBU/g和0.5~2.5mg蛋白质/g绝干纤维素，所述的纤维素含量是指固体基质中纯纤维素的绝干质量百分比，所采用的缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，缓冲液的浓度和pH值分别为45~50mmol/L和4.5~5.0，酶水解时间为72~96h，酶水解结束后，立即将水热釜从均质反应器中取出，然后用200ml、0.1mol/L的NaHCO₃溶液将水热釜聚四氟乙烯内衬中固液混合物洗涤到一个500ml烧杯中，待固液分层后，取上层清液2ml，然后将此清液迅速置于沸水浴中对纤维素酶、纤维二糖酶和半纤维素酶进行灭活处理，处理时间为15min，然后将样品冷却至室温，测定其葡萄糖浓度。

上述步骤（2）所述的第一步高沸点醇预处理过程中高沸点醇在高沸点醇预处理液中的体积比为8%~15%，即大于8%小于等于15%。

所述的醇为高沸点醇或低沸点醇，高沸点醇为25℃、1个大气压下沸点为210℃以上的醇，低沸点醇为25℃、1个大气压下沸点为100℃以下的醇。

所述的高沸点醇至少有一种选用1,4-丁二醇、丙三醇、1,3-丙二醇、1,4-戊二醇、1,3-戊二醇或1,5-戊二醇。

所述低沸点醇至少有一种选用甲醇、乙醇或正丙醇。

上述所述的预处理方法用于处理竹材纤维原料来提高其纤维素高浓酶水解的转化率和经酶水解获得可发酵葡萄糖的回收率。

本发明采用的更具体的技术方案是：

本发明所述的一种有效提高竹材纤维素高浓酶水解产可发酵糖效率的综合处理方法，包括如下步骤：

（1）选取2~3年生竹材，经削片和筛选后获得三维尺寸为20×15×4mm的竹片，将其作为原料进行后续预处理；

（2）第一步高沸点醇预处理，其技术条件为：将步骤（1）制得的竹片原料放入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中的固定支架上，盖上油浴反应器的盖子后进行预处理，预处理温度200~210℃，温度控制误差为±2℃，预处理时间35~45min，高沸点醇预处理液由高沸点醇和去离子水组成，高沸点醇在高沸点醇预处理液中的体积比以ml:ml计为大于8小于等于15%，高沸点醇预处理液和竹片原料质量的比值以ml:g计为5~7，油浴反应器支架的转动速度为3~5rpm，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却至室温，然后将小罐内的固液混合物在60目的尼龙网袋中过滤，待固体和液体分离后得预处理液和固体基质；

（3）固体基质的分散处理，其技术条件为：将步骤（2）所得的固体基质在植物粉碎机中进行处理，以降低固体基质中纤维束的尺寸，每次取含预处理液的固体基质20g，装入捣碎罐中，在8000~12000r/min的剪切搅拌速度下处理20~30s，处理完成后，获得较分散的、纤维状的固体基质；

（4）第二步醇/水预处理，将步骤（3）制得的纤维状的固体基质再次装入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中进行预处理，其技术条件为：预处理温度160~170℃，温度控制误差为±2℃，预处理时间60~90min，醇/水预处理液由高沸点或低沸点醇和去离子水组成，醇在醇/水预处理液中的体积比以ml:ml计为大于等于50小于等于70%，醇/水预处理液和固体基质绝干质量的比值以ml:g计为8~15，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却，然后将小罐内的固液混合物在垫有双层滤纸的布氏漏斗上过滤，将固体和液体分离，得经第二步预处理的固体基质；

（5）第二步无酸催化醇/水预处理所得固体基质的超声处理，其技术条件为：将步骤（4）预处理后的固体基质装入带有钻孔橡皮塞的三角瓶，往三角瓶中加入新鲜的醇/水混合溶液，醇在新配置的醇/水预处理液中的体积比以ml:ml计为大于等于50小于等于70%，新配置醇/水预处理液和绝干固体基质质量的比值以ml:g计为8~15，再将此三角瓶放入一个大烧杯中，往烧杯内和血清瓶外的区域加入冰水混合物，然后将超声探头通过钻孔橡皮塞放入到三角瓶中液体液面2/3以下的位置，开始进行超声处理，其技术条件为：超声处理的功率为500~700W，超声处理时间30~60min，超声处理完成后，立即将三角瓶取出，然后在垫有双层滤纸的布氏漏斗上过滤，将固体和液体分离，得经超声处理的固体基质；

（6）超声处理所得固体基质的洗涤，其技术条件为：将步骤（5）所得固体基质置于一个大烧杯中，用去离子水对固体基质进行洗涤，所述去离子水与固体基质以体积和质量的比值ml:g计为6~10，磁力搅拌速度为300~600r/min，洗涤时间为30~60min，洗涤温度为室温，重复洗涤1次后，在垫有双层滤纸的布氏漏斗上将固体基质和洗涤液进行分离，得经洗涤处理的固体基质；

（7）洗涤后固体基质的高浓酶水解，其技术条件为：将步骤（6）制得的固体基质加入到水热釜的聚四氟乙烯内衬中，将此内衬装入水热釜内，拧紧水热釜的盖子，然后将密封的水热釜安装到空气浴均质反应器的支架上，关上均质反应器的门后开始进行固体基质的高浓酶水解，其技术条件为：固体基质作为底物的质量比浓度为18~25%（%指质量百分比，g:g），空气浴均质反应器的空气温度为55~60℃，温度控制误差为±1℃，支架转动速度为200~250r/min，酶采用纤维素酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Celluclast1.5L^?）、纤维二糖酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Novozyme188^?）和半纤维素酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Hemicellulase），纤维素酶、纤维二糖酶和半纤维素酶用量分别为15~20FPU/g、22.5~30CBU/g和0.5~2.5mg蛋白质/g绝干纤维素，所述的纤维素含量是指固体基质中纯纤维素的绝干质量百分比，所采用的缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，缓冲液的浓度和pH值分别为45~50mmol/L和4.5~5.0，酶水解时间为72~96h，酶水解结束后，立即将水热釜从均质反应器中取出，然后用200ml、0.1mol/L的NaHCO₃溶液将水热釜聚四氟乙烯内衬中固液混合物洗出于一个500ml烧杯中，待固液分层后，取上层清液2ml，然后将此清液迅速置于沸水浴中对纤维素酶、纤维二糖酶和半纤维素酶进行灭活处理，处理时间为15min，然后将样品冷却至室温，测定其葡萄糖浓度。

为进一步实现本发明目的，所述第一步高沸点醇预处理过程中高沸点醇在预处理液（由醇和水组成）中的体积比为8~15%，即大于8小于等于15%。

所述第一步高沸点醇预处理温度为200~210℃，温度控制误差为±2℃。

所述第一步高沸点醇预处理时间为35~45min。

所述第一步高沸点醇预处理高沸点醇预处理液和竹片原料绝干质量的比值以ml:g计为5~7。

所述第一步高沸点醇预处理油浴反应器支架的转动速度为3~5rpm。

所述固体基质分散处理的剪切搅拌速度为8000~12000r/min。

所述固体基质分散处理的剪切搅拌时间为20~30s。

所述第二步醇/水预处理所用醇为高沸点或低沸点醇。

所述第二步醇/水预处理的预处理液中醇与去离子水的体积比以ml:ml计为大于等于50小于等于70%。

所述第二步醇/水预处理的预处理液和固体基质绝干质量的比值以ml:g计为8~15。

所述第二步醇/水预处理的预处理温度160~170℃，温度控制误差为±2℃。

所述第二步醇/水预处理的预处理时间60~90min。

所述超声处理所使用新配置的醇/水预处理液中醇与去离子的体积比以ml:ml计为大于等于50小于等于70%。

所述超声处理所使用新配置醇/水预处理液和绝干固体基质质量的比值以ml:g计为8~15。

所述超声处理的功率为500~700W。

所述超声处理的时间为30~60min。

所述固体基质洗涤所用去离子水与固体基质以体积和质量的比值ml:g计为6~10。

所述固体基质洗涤的磁力搅拌速度为300~600r/min。

所述固体基质洗涤的时间为30~60min。

所述固体基质高浓酶水解的底物浓度为大于18%（%指质量百分比，g:g）。

所述固体基质高浓酶水解过程中纤维素酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Celluclast1.5L^?）、纤维二糖酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Novozyme188^?）和半纤维素酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Hemicellulase）的用量分别为15~20FPU/g、22.5~30CBU/g和0.5~2.5mg蛋白质/g绝干纤维素（纤维素含量是指固体基质中纯纤维素的绝干质量百分比）。

所述固体基质高浓酶水解所用空气浴均质反应器支架的转动速度为200~250r/min。

所述固体基质高浓酶水解所用空气浴均质反应器的空气温度为55~60℃，温度控制误差为±1℃。

本发明所述的有效提高竹材纤维素高浓酶水解产可发酵糖效率的综合处理方法，由上述步骤构成。

相对于现有技术，本发明具有如下优点：

针对常规一步预处理和耦合酸碱两步预处理存在的缺点，本发明通过耦合两步预处理和超声处理的综合处理方法来提高竹材纤维素高浓酶水解效率。第一步无酸催化高沸点醇预处理控制高沸点醇在预处理液（由醇和水组成）中的体积比在8~15%，一方面，高温和较短预处理时间的条件下，该溶剂体系使半纤维素大量溶出到预处理液中；另一方面，半纤维素溶出的同时，该溶剂体系可溶解少量木素，防止预处理液中木素发生缩合后反沉积到固体基质表面，最终影响固体基质中木素在下一步预处理过程中的溶出效率。第二步无酸催化醇/水预处理控制醇在预处理液（由醇和水组成）中的体积比在50~70%，相对较低温度的条件下，木素在醇中有一定的溶解度，这可使固体基质中残留的大部分木素溶于预处理液中，达到三大组分初步分离、提高固体基质中纤维素对酶可及性的目的。

当第一步预处理控制高沸点醇在预处理液中的体积比较低、预处理温度较高时，尽管预处理液中水可发生电离产生一定量氢离子，但预处理时间较短，80%以上半纤维素发生水解的同时，纤维素降解和木素缩合的程度较低；第二步预处理时间虽然较长，但其预处理温度较低，且控制醇在预处理液中的体积比较高，预处理液中水的电离程度也较低，最终大部分木素的溶出属于物理溶解过程，纤维素降解程度也较低。第二步预处理后采用超声处理，可使固体基质内部孔洞和细胞腔中残留木素碎片进一步溶出，最大限度提高纤维素与酶接触的内比表面积。此外，由于半纤维素与纤维素紧密结合，在高浓酶水解过程中，除使用纤维素酶和纤维二糖酶外，添加少量半纤维素酶，可进一步降低残余少量半纤维素对固体基质中纤维素高浓酶水解的影响。因此，耦合两步预处理、超声和添加半纤维素酶而形成的综合处理方法可达到多重效果：（1）可使大部分半纤维素和木素溶于到液相中，保留绝大部分纤维素于固相的固体基质中，降低非纤维素组分对纤维素的包覆作用；（2）促使固体基质中木素和半纤维素碎片进一步溶出，最大限度提高纤维素对酶的可及性；（3）排除残余少量半纤维素的影响，最终不但提高纤维素高浓酶解的转化率，而且可获得较高的葡萄糖回收率。

除提高固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率外，第一步预处理无需添加无机或有机酸进行催化水解，半纤维素从固相溶出到液相后，其进一步降解为糠醛和小分子酸的程度较低；相对于一步酸法和热水预处理而言，本发明第一步预处理液中半纤维素得率也较高。第二步预处理是在第一步预处理溶出大量半纤维素的基础上进行的，其无需酸催化溶出半纤维素来提高木素的溶出效率，70%以上木素可直接物理溶出于预处理液中；相对于一步酸催化的有机溶剂预处理，本发明预处理液中不仅木素的得率较高，木素缩合的程度也较低，进一步高值化利用的反应活性也较高。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

一、下面结合实施例对本发明方法作进一步的详细说明。需要特别说明的是，本发明的保护范围应当包括但不限于本实施例所公开的技术内容。

如图1所示，本发明的竹片第一步在无酸催化下进行高沸点醇预处理，一方面获得固体基质1，另一方面获得预处理液1；所述的固体基质1进行第二步无酸催化醇/水预处理，获得固体基质2，并同时获得预处理液2；所述的固体基质2经高浓酶水解获得高浓葡萄糖溶液；所述的预处理液1与预处理液2得到混合溶液，然后此混合溶液经液化获得生物油。

对比例1

（1）选取3年生竹材，经削片和筛选后获得三维尺寸（指长宽高）为20×15×4mm的竹片，将其作为原料进行后续预处理；

（2）第一步高沸点醇预处理，其技术条件为：将步骤（1）制得的竹片原料放入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往小罐的罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中的固定支架（此设备为现有技术）上，盖上油浴反应器的盖子后进行预处理，预处理温度180℃，温度控制误差为±2℃，预处理时间25min，高沸点醇预处理液由高沸点醇和去离子水组成，高沸点醇在高沸点醇预处理液中的体积比以ml:ml计为10%，硫酸作为催化剂在高沸点醇预处理液中的浓度为50mmol/L，高沸点醇预处理液和竹片原料质量的比值以ml:g计为6，油浴反应器支架的转动速度为3rpm，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却至室温，然后将小罐内的固液混合物在60目的尼龙网袋中过滤，待固体和液体分离后得预处理液和固体基质（其中有少量附着在固体基质上的预处理液）；

（3）固体基质的分散处理，其技术条件为：将步骤（2）所得的固体基质在植物粉碎机（此设备为现有技术）中进行处理，以降低固体基质中纤维束的尺寸，每次取含预处理液（指少量附着在固体基质上的）的固体基质20g，装入捣碎罐（此设备为现有技术）中，在12000r/min的剪切搅拌速度下处理30s，处理完成后，获得较分散的、纤维状的固体基质；

（4）固体基质的洗涤，其技术条件为：将步骤（3）所得固体基质置于一个大烧杯中，用去离子水对固体基质进行洗涤，所述去离子水与固体基质以体积和质量的比值ml:g计为10，磁力搅拌速度为600r/min，洗涤时间为60min，洗涤温度为室温，重复洗涤1次后，在垫有双层滤纸的布氏漏斗上将固体基质和洗涤液进行分离，得经洗涤处理的固体基质；

（5）洗涤后固体基质的高浓酶水解，其技术条件为：将步骤（4）制得的固体基质加入到水热釜的聚四氟乙烯内衬中，将此内衬装入水热釜（此设备为现有技术）内，拧紧水热釜的盖子，然后将密封的水热釜安装到空气浴均质反应器的支架（此设备为现有技术）上，关上均质反应器的门后开始进行固体基质的高浓酶水解，其技术条件为：固体基质作为底物的质量比浓度为20%（%指质量百分比，g:g），空气浴均质反应器的空气温度为55℃，温度控制误差为±1℃，支架转动速度为250r/min，纤维素酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Celluclast1.5L^?）和纤维二糖酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Novozyme188^?）的用量分别为20FPU/g和30CBU/g绝干纤维素，所述的纤维素含量是指固体基质中纯纤维素的绝干质量百分比，醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度和pH值分别为50mmol/L和5.0，酶水解时间为96h，酶水解结束后，立即将水热釜从均质反应器中取出，然后用200ml、0.1mol/L的NaHCO₃溶液将水热釜聚四氟乙烯内衬中固液混合物洗出到一个500ml烧杯中，待固液分层后，取上层清液2ml，然后将此清液迅速置于沸水浴中对纤维素酶、纤维二糖酶和半纤维素酶进行灭活处理，处理时间为15min，然后将样品冷却至室温，测定其葡萄糖浓度。

实施例1

（1）选取3年生竹材，经削片和筛选后获得三维尺寸为20×15×4mm的竹片，将其作为原料进行后续预处理；

（2）第一步稀酸、稀碱、酸性亚硫酸盐、酸催化乙醇/水和酸催化高沸点醇预处理，将步骤（1）制得的竹片原料放入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往小罐的罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中的固定支架（此设备为现有技术）上，盖上油浴反应器的盖子后进行预处理，其技术条件为：硫酸作为催化剂在第一步稀酸预处理液中的体积比为0.45%，氢氧化钠溶于去离子水的溶液作为第一步稀碱预处理的预处理液，氢氧化钠与绝干竹片的质量比为10%，浓硫酸和亚硫酸氢钠溶于去离子水的溶液作为第一步酸性亚硫酸盐预处理的预处理液，硫酸在第一步酸性亚硫酸盐预处理液中的用量为0.45%（v/v）、亚硫酸氢钠与绝干竹片的质量比为8%，乙醇直接溶于去离子水作为第一步酸催化乙醇/水预处理的预处理液，95%的乙醇（w/w）在乙醇/水预处理液中的用量为10%（v/v），硫酸在第一步乙醇/水预处理液中的浓度为50mmol/L，除将乙醇替换为1,4-丁二醇外，第一步酸催化高沸点醇预处理的条件与第一步酸催化乙醇/水预处理条件完全相同，这五种预处理的预处理液体积和竹片原料质量的比值以ml:g计均为6，在预处理温度为180℃，预处理时间均为25min，油浴反应器支架的转动速度为3rpm，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却至室温，然后将小罐内的固液混合物在60目的尼龙网袋中过滤，待固体和液体分离后得预处理液和固体基质；

（3）第一步无酸催化高沸点醇预处理，其技术条件为：将步骤（1）制得的竹片原料放入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中的固定支架上，盖上油浴反应器的盖子后进行预处理，预处理温度为200℃，温度控制误差为±2℃，预处理时间35min，高沸点醇预处理液由高沸点醇和去离子水组成，高沸点醇在高沸点醇预处理液中的体积比以ml:ml计为10%，高沸点醇预处理液和竹片原料质量的比值以ml:g计为6，油浴反应器支架的转动速度为3rpm，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却至室温，然后将小罐内的固液混合物在60目的尼龙网袋中过滤，待固体和液体分离后得预处理液和固体基质；

（4）固体基质的分散处理，其技术条件为：将步骤（2）和（3）所得的固体基质在植物粉碎机中进行处理，以降低固体基质中纤维束的尺寸，每次取含预处理液的固体基质20g，装入捣碎罐中，在12000r/min的剪切搅拌速度下处理20s，处理完成后，获得较分散的、纤维状的固体基质；

（5）第二步稀酸、稀碱、酸性亚硫酸盐和酸催化高沸点醇预处理，将步骤（4）制得的纤维状的固体基质再次装入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中进行预处理，其技术条件为：硫酸作为催化剂在第二步稀酸预处理液中的体积比为0.05%，氢氧化钠溶于去离子水的溶液作为第二步稀碱预处理的预处理液，氢氧化钠与绝干竹片的质量比为1%，浓硫酸和亚硫酸氢钠溶于去离子水的溶液作为第二步酸性亚硫酸盐预处理的预处理液，硫酸在第二步酸性亚硫酸盐预处理液中的用量为0.05%（v/v）、亚硫酸氢钠与绝干竹片的质量比为2%，1,4-丁二醇直接溶于去离子水作为第二步酸催化高沸点醇预处理的预处理液，98%的1,4-丁二醇（w/w）在第二步酸催化高沸点醇/水预处理液中的用量为50%（v/v），硫酸在第二步酸催化高沸点醇/水预处理液中的浓度为5mmol/L，这四种预处理的预处理液体积和竹片原料质量的比值以ml:g计均为6，在预处理温度为160℃，预处理时间均为60min，油浴反应器支架的转动速度为3rpm，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却至室温，然后将小罐内的固液混合物在60目的尼龙网袋中过滤，待固体和液体分离后得预处理液和固体基质；

（6）第二步无酸催化乙醇/水和无酸催化高沸点醇/水预处理，将步骤（4）制得的纤维状的固体基质再次装入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中进行预处理，其技术条件为：第二步无酸催化乙醇/水和第二步无酸催化高沸点醇/水预处理的液处理液分别为乙醇直接溶于去离子水和1,4-丁二醇直接溶于去离子水所得的溶液，两种预处理的温度均为160℃，温度控制误差为±2℃，预处理时间均为60min，醇在两种无酸催化醇/水预处理液中的体积比以ml:ml计为50%，醇/水预处理液和固体基质绝干质量的比值以ml:g计为10，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却，然后将小罐内的固液混合物在垫有双层滤纸的布氏漏斗上过滤，将固体和液体分离，得经第二步预处理的固体基质；

（7）固体基质的洗涤，其技术条件为：将步骤（5）和（6）所得固体基质置于一个大烧杯中，用去离子水对固体基质进行洗涤，所述去离子水与固体基质以体积和质量的比值ml:g计为10，磁力搅拌速度为300r/min，洗涤时间为30min，洗涤温度为室温，重复洗涤1次后，在垫有双层滤纸的布氏漏斗上将固体基质和洗涤液进行分离，得经洗涤处理的固体基质；

（8）洗涤后固体基质的高浓酶水解，其技术条件为：将步骤（7）制得的固体基质加入到水热釜的聚四氟乙烯内衬（此设备为现有技术）中，将此内衬装入水热釜内，拧紧水热釜的盖子，然后将密封的水热釜安装到空气浴均质反应器的支架（此设备为现有技术）上，关上均质反应器的门后开始进行固体基质的高浓酶水解，其技术条件为：固体基质作为底物的质量比浓度为20%（%指质量百分比，g:g），空气浴均质反应器的空气温度为55℃，温度控制误差为±1℃，支架转动速度为200r/min，纤维素酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Celluclast1.5L^?）和纤维二糖酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Novozyme188^?）的用量分别为15~20FPU/g和22.5~30CBU/g绝干纤维素，所述的纤维素含量是指固体基质中纯纤维素的绝干质量百分比，醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度和pH值分别为50mmol/L和5.0，酶水解时间为72h，酶水解结束后，立即将水热釜从均质反应器中取出，然后用200ml、0.1mol/L的NaHCO₃溶液将水热釜聚四氟乙烯内衬中固液混合物洗出于一个500ml烧杯中，待固液分层后，取上层清液2ml，然后将此清液迅速置于沸水浴中对纤维素酶、纤维二糖酶和半纤维素酶进行灭活处理，处理时间为15min，然后将样品冷却至室温，测定其葡萄糖浓度。

实施例2

（1）选取2年生竹材，经削片和筛选后获得三维尺寸为20×15×4mm的竹片，将其作为原料进行后续预处理；

（2）第一步无酸催化高沸点醇预处理，其技术条件为：将步骤（1）制得的竹片原料放入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中的固定支架上，盖上油浴反应器的盖子后进行预处理，预处理温度200℃，温度控制误差为±2℃，预处理时间35min，高沸点醇预处理液由高沸点醇和去离子水组成，高沸点醇在高沸点醇预处理液中的体积比以ml:ml计为10%，高沸点醇预处理液和竹片原料质量的比值以ml:g计为6，油浴反应器支架的转动速度为3rpm，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却至室温，然后将小罐内的固液混合物在60目的尼龙网袋中过滤，待固体和液体分离后得预处理液和固体基质；

（3）固体基质的分散处理，其技术条件为：将步骤（2）所得的固体基质在植物粉碎机中进行处理，以降低固体基质中纤维束的尺寸，每次取含预处理液的固体基质20g，装入捣碎罐中，在8000r/min的剪切搅拌速度下处理20s，处理完成后，获得较分散的、纤维状的固体基质；

（4）第二步乙醇/水预处理，将步骤（3）制得的纤维状的固体基质再次装入密封后可耐高压的不锈钢小罐内，再往罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴反应器中进行预处理，其技术条件为：预处理温度数值见表3，预处理时间数值见表3，醇/水预处理液由乙醇和去离子水组成，乙醇在醇/水预处理液中的体积比（ml:ml）数值见表3，醇/水预处理液和固体基质绝干质量的比值以ml:g计为10，预处理完成后，立即将油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却，然后将小罐内的固液混合物在垫有双层滤纸的布氏漏斗上过滤，将固体和液体分离，得经第二步预处理的固体基质；

（5）固体基质的洗涤，其技术条件为与实施例1相同，在此不重复阐述；

（6）洗涤后固体基质的高浓酶水解，其技术条件与实施例1相同，在此不重复阐述。

实施例3

步骤如实施例2，只是在固体基质高浓酶水解过程中添加半纤维素酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Hemicellulase），该酶用量在5~25mg蛋白质/g绝干纤维素（纤维素含量是指固体基质中纯纤维素的绝干质量百分比）区间内选取0.5mg蛋白质/g绝干纤维素、1.0mg蛋白质/g绝干纤维素、1.5mg蛋白质/g绝干纤维素、2.0mg蛋白质/g绝干纤维素和2.5mg蛋白质/g绝干纤维素。

实施例4

步骤如实施例3，只是在固体基质高浓酶水解过程中设定半纤维素酶（购自中国上海Sigma-Aldrich公司，商品名为Hemicellulase）用量为15mg蛋白质/g绝干纤维素（纤维素含量是指固体基质中纯纤维素的绝干质量百分比）。

此外，在第二步无酸催化乙醇/水预处理后，对固体基质进行超声处理，其技术条件为：将第二步无酸催化乙醇/水预处理所得固体基质装入带有钻孔橡皮塞的三角瓶，往三角瓶中加入新鲜的醇/水混合溶液，醇在新配置的醇/水预处理液中的体积比以ml:ml计为50%，新配置醇/水预处理液和绝干固体基质质量的比值以ml:g计为10，再将此三角瓶放入一个大烧杯中，往烧杯内和血清瓶外的区域加入冰水混合物，然后将超声探头通过钻孔橡皮塞放入到三角瓶中液体液面2/3以下的位置，开始进行超声处理，超声处理的功率的数值见表5，超声处理时间的数值见表5，超声处理完成后，立即将三角瓶取出，然后在垫有双层滤纸的布氏漏斗上过滤，将固体和液体分离，得经超声处理的固体基质。

二、效果测试

1、一步酸催化髙沸点醇预处理所得固体基质在酶水解体系中的质量比浓度对竹材纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响

公开号为CN103266148A的中国发明专利《一种有效提高竹材纤维素酶水解产可发酵糖效率的预处理方法》采用一步酸催化髙沸点醇预处理显著地提高了竹材纤维素低浓（2%，w/w）酶水解的效率，为探明一步酸催化髙沸点醇预处理对竹材纤维素高浓酶水解效率是否具有显著的促进作用，以对比例1所得竹材固体基质作为酶水解的底物，考察底物浓度对固体基质中纤维素酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响，结果如表1所示。从表1可以看出，随着底物质量比浓度（2%、5%、10%、15%、20%、25%）的提高，固体基质中纤维素酶水解的转化率不断降低。如固定酶水解温度、时间、气浴反应器支架转速和酶用量不变，当固体基质在酶水解体系中的质量比浓度从2%提高到20%时，固体基质中纤维素酶水解转化率从89.32%降低到42.33%，葡萄糖回收率也从84.79%降低到40.09%。由此可见，一步酸催化髙沸点醇预处理无法显著提高竹材纤维素高浓酶水解的转化率和葡萄糖回收率。

表1一步酸催化髙沸点醇预处理所得固体基质在酶水解体系中的质量比浓度对竹材纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响

这主要是由于一步酸催化高沸点醇预处理可使竹材中大部分半纤维素溶于预处理液中，其在一定程度上提高了竹材中纤维素对酶的可及性；当以预处理后固体基质作为酶水解底物，且底物在酶水解体系中质量比浓度较低时，尽管固体基质中含有大量木素，纤维素酶和纤维二糖酶可与木素发生无效吸附，但由于底物浓度较低，酶水解体系中有大量自由水存在，纤维素酶和纤维二糖酶较易发生脱附，脱附后仍然可作用于固体基质中的纤维素，最终固体基质中纤维素的酶水解转化率和得率仍然可得以较高；但随着底物在酶水解体系中质量比浓度不断增大，酶水解体系中自由水的量不断降低，固液混合物粘度也不断增大，无效吸附于木素上的纤维素酶和纤维二糖酶也较难发生脱附，最终固体基质中纤维素酶水解转化率和葡萄糖回收率均随之下降。因此，在一步髙沸点醇预处理的基础上，可开发第二步预处理来进一步使木素从固体基质中溶出。但为了降低酸对设备的腐蚀以及对预处理液中糖的催化降解作用，开发两步无酸催化的预处理将显得更为重要。

2、不同的两步预处理组合对竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率产生影响的比较

基于对比例1的结果，以固体基质作为酶水解底物的质量比浓度为20%，考察不同的两步预处理组合对竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响，结果如表2所示。对于不同的预处理，第一步和第二步预处理的技术条件如实施例1所述。当第一步预处理为稀酸预处理或酸性亚硫酸盐预处理，第二步预处理为稀酸预处理或酸性亚硫酸盐预处理时，固体基质中纤维素的酶水解转化率均低于46%，葡萄糖回收率低于42%。这主要是由于第一步和第二步预处理均有利于半纤维素的水解溶出，不利于木素的溶出，其最终导致高浓酶水解体系中纤维素酶和纤维二糖酶与木素发生显著的无效吸附，固体基质中纤维素酶水解转化率较低。当第一步预处理为稀酸预处理或酸性亚硫酸盐预处理时，第二步预处理为无酸催化的乙醇/水预处理、或酸催化的高沸点醇预处理、或无酸催化的高沸点醇预处理时，固体基质中纤维素的酶水解转化率稍有提高，但均未超过57%。这是由于，尽管醇/水预处理可使部分木素溶出，但第一步稀酸预处理的预处理温度较高，酸性条件下木素较易发生缩合后反沉积于固体基质表面，导致后续固体基质内部木素难以溶出，最终固体基质中纤维素表面仍然包覆大量木素，其高浓酶水解转化率难以较大程度的提高。

当第一步预处理为稀碱预处理时，第二步预处理为稀碱、或无酸催化的乙醇/水预处理、或酸催化的高沸点醇预处理、或无酸催化的高沸点醇预处理时，固体基质中纤维素酶水解转化率未超过41%，葡萄糖回收率均小于39%。这主要是由于稀碱和醇/水预处理不利于半纤维素溶出，其显著降低了酶与纤维素接触的表面积。当第一步预处理为稀碱预处理，第二步预处理为稀酸预处理或酸性亚硫酸盐预处理时，相对于稀碱预处理与其它预处理的组合，固体基质中纤维素酶水解转化率稍有提高，但仍然低于50%。理论上分析，木素可在第一步预处理大量溶出，半纤维素可在第二步预处理发生大量的水解反应而溶于预处理液，但第二步预处理温度较低，半纤维素溶出程度较低，纤维素对酶的可及性仍然难以大幅度提高；提高第二步预处理的温度，尽管半纤维素水解反应而溶于预处理液的程度提高，但纤维素也随之降解，最终葡萄糖回收率仍然较低。

表2不同的两步预处理组合对竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率产生影响的比较

在提高固体基质中纤维素高浓酶水解转化率方面，虽然酸催化的乙醇/水预处理与稀酸预处理或酸性亚硫酸盐预处理组合比前两种酸法预处理组合（稀酸与稀酸预处理，稀酸与酸性亚硫酸盐预处理）稍有提高，但提高幅度较低，最终固体基质中纤维素高浓酶水解转化率仍然低于51%。这主要是由于酸催化的乙醇/水预处理在溶出半纤维素的同时，在水中添加少量醇可一定程度限制木素的缩合。但酸法与酸法的预处理组合使竹材中木素溶出率较低，高浓酶水解体系中酶被无效吸附于木素上，固体基质中纤维素酶水解转化率较低。当第一步预处理为酸催化的乙醇/水预处理，第二步预处理为稀碱、或无酸催化的乙醇/水预处理、或酸催化的高沸点醇预处理、或无酸催化的高沸点醇预处理时，尽管固体基质中纤维素高浓酶水解转化率提高到54~58%的范围，但仍然低于无酸催化的高沸点醇预处理与无酸催化的乙醇/水预处理或无酸催化的高沸点醇预处理的组合。相对于第一步预处理为酸催化或无酸催化的高沸点醇预处理时，酸催化乙醇/水预处理体系中乙醇沸点较低，当预处理液中乙醇体积较低时，高温易形成气液平衡，预处理液中醇浓度较低，但酸浓度稍有提高，此时木素可发生一定程度的缩合，且纤维素易于降解，进而阻碍和第二步预处理过程中木素的溶出以及最终固体基质中纤维素的高浓酶水解转化率。

当第一步预处理为酸催化或无酸催化的高沸点醇预处理，第二步预处理为酸催化的高沸点醇预处理时，固体基质中纤维素高浓酶水解的转化率最高，达到70.81%。这主要是由于第二步预处理不仅是大部分木素溶出，第一步预处理所得固体基质中残留的半纤维素也进一步溶出，纤维素度对酶的可及性得到显著地提高；但其葡萄糖回收率仅为54.11%，这是由于第二步高沸点醇预处理液中的酸催化剂可是纤维素发生部分水解，最终葡萄糖回收率无法随纤维素高浓酶水解转化率的提高而提高。

当第一步预处理为酸催化或无酸催化的高沸点醇预处理，第二步预处理为无酸催化高沸点醇或乙醇/水预处理时，尽管其固体基质中纤维素高浓酶水解转化率仅为66%左右，但其葡萄糖回收率达到60%左右，是所有两步预处理组合所获得最高的葡萄糖回收率。

3、第二步无酸催化乙醇/水预处理条件对竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响

以无酸催化乙醇/水预处理作为第二步预处理，考察预处理温度、预处理时间和乙醇在预处理液中的体积比对竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响，结果如表3所示。从中可以看出，当乙醇在预处理液中的体积比为50%，预处理温度从140℃升高到180℃时，固体基质中纤维素高浓酶水解转化率从47.15%提高到72.12%；但葡萄糖回收率则在预处理温度为160℃时取得最大值（61.30%），这主要是由于高温促使部分纤维素发生水解而溶于预处理液。

当固定第二步无酸催化乙醇/水预处理的预处理温度为160℃、乙醇在预处理液中的体积比为50%，预处理时间从40min增加到80min时，固体基质中纤维素高浓酶水解转化率从60.25%提高到70.34%；继续延长预处理时间到100min，固体基质中纤维素高浓酶水解转化率基本不变，但葡萄糖回收率则从64.24%降低到62.95%。由此可见，当乙醇在预处理液中的体积比为50%时，第二步无酸催化乙醇/水预处理较优的预处理温度和时间分别为160℃和80min。

表3第二步无酸催化乙醇/水预处理条件对竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响

第二步无酸催化乙醇/水预处理的预处理温度和时间分别为160℃和80min时，进一步优化乙醇在预处理液中的体积比，结果如表3所示。当乙醇在预处理液中的体积比从20%增加到70%时，固体基质中纤维素高浓酶水解转化率不断增加，但葡萄糖回收率则呈现先上升后下降的变化趋势，最大葡萄糖回收率为65.88%，此时乙醇在预处理液中的体积比为60%。

4、半纤维素酶添加量对第二步无酸催化乙醇/水预处理所得竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响

尽管第一步预处理可使大部分半纤维素溶于预处理液中，但第二步预处理对半纤维素产生的影响较小，最终所得固体基质中仍然残留一定量半纤维素。为减少半纤维素对固体基质中纤维素高浓酶水解的影响，在此考察半纤维素酶添加量对纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响，结果如表4所示。

从表4中可以看出，当半纤维素酶添加量从0.5mg/g绝干固体基质增加到2.0mg/g绝干固体基质时，固体基质中纤维素高浓酶水解转化率从70.28%增加到75.32%；继续增加半纤维素酶添加量到2.5mg/g绝干固体基质时，固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率增加的幅度较小。因此，基于绝干固体基质质量，较优化的半纤维素酶添加量2.0mg/g。

表4半纤维素酶添加量对第二步无酸催化乙醇/水预处理所得竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响

5、超声处理对第二步无酸催化乙醇/水预处理所得竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响

尽管耦合第一步无酸催化高沸点醇预处理和第二步无酸催化醇/水预处理可是大部分半纤维素和木素溶于预处理液，但少量木素和半纤维素碎片仍然残留于固体基质内部孔洞和细胞腔中，其可覆盖在固体基质中的纤维素上，降低纤维素对酶的可及性，最终使得固体基质中纤维素高浓酶水解转化率无法显著提高。

表5超声处理对第二步无酸催化乙醇/水预处理所得竹材固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率的影响

当设定超声处理时间为45min，超声功率从100W增加到500W的过程中，固体基质中纤维素高浓酶水解转化率从72.43%增加到82.34%；继续提高超声功率到700W时，固体基质中纤维素高浓酶水解转化率基本不变。因此，固定超声功率为500W，超声处理时间从15min增加到60min的过程中，从表5中可以看出，固体基质中纤维素高浓酶水解转化率呈现先升高后趋于不变的趋势。因超声处理不会使纤维素发生降解，葡萄糖回收率与固体基质中纤维素高浓酶水解转化率呈现线性关系。综合可知，较优化的超声处理功率和时间分别为500W和45min，此时固体基质中纤维素高浓酶水解转化率和葡萄糖回收率分别高达82.34%和75.38%。