一种具有抗炎镇痛活性的塞隆骨提取物、制备方法及中药制剂

摘要

本发明公开了一种塞隆骨提取物的制备方法，包括以下步骤：（1）粉碎；（2）提取骨脂溶性提取部位；（3）萃取：先用石油醚萃取，水相再用乙酸乙酯进行萃取，浓缩至干得到乙酸乙酯部分；（4）柱分离：在硅胶柱中以乙酸乙酯:甲醇=1:1的溶剂作为洗脱液进行洗脱，干燥即得塞隆骨提取物。本发明还公开由上述的制备方法制备的塞隆骨提取物及其在制备抗炎镇痛药物中的应用和具有抗炎镇痛活性的中药制剂。本发明所获得的塞隆骨提取物具有抗炎镇痛活性，可以制备抗炎镇痛药物，尤其是中药制剂。该中药制剂中的塞隆骨提取物可占制剂总质量的20-90%，其余可添加药物学常用的辅料和药学可接受的载体。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物提取物，具体地说，涉及一种具有抗炎镇痛活性的塞隆骨提取物、制备方法及中药制剂。

背景技术

塞隆骨为仓鼠科动物高原鼢鼠(MyospalaxbaileyiThomas)去脑的干燥全架骨骼。夏、秋两季器械捕捉，猎获后立即处死，剥去皮、肉、去脑，剔净残留筋肉，及时阴干或低湿烘干。用时打碎，水煎或泡酒服。具有祛风散寒除湿、通络止痛、补益肝肾的功效，可用于风寒湿痹引起的肢体关节疼痛、肿胀、屈伸不利，肌肤麻木，腰膝酸软。研究表明(海平.塞隆骨抗炎作用(Ⅱ).高原医学杂志,2002,12(1)；8-10；海平.塞隆骨镇痛作用和对脑内单胺类神经递质的影响.山东中医杂志,2001,20(4)；232-234)塞隆骨具有一定的抗炎和镇痛作用，但现有技术中采用的都是用塞隆骨泡水或泡酒服用，其成分复杂，效果不明显，因此十分有必要制备分离塞隆骨的活性部位。

中国专利文献CN201410472564.5，公开日2015.01.14，公开了一种从塞隆骨中提取7-β-羟基胆固醇的方法，包括以下步骤：用1-15％乙醇-正己烷溶解塞隆骨至50-200mg/mL；一维液相色谱：A相正己烷，B相乙醇，洗脱方式为B相1％等度12min、5％等度10min、8％等度10min、15％等度10min、30％等度25min、50％等度15min、70％等度15min、100％等度15min，根据紫外吸收光谱收集目的组分；用2-15％乙醇-正己烷溶解至50-100mg/mL；二维液相色谱：A相正己烷，B相乙醇，5％B相等度30min洗脱，根据紫外吸收光谱收集目的组分，即得到目的提取物。该方法得到的7-β-羟基胆固醇纯度可达到99％以上。

然而，目前还未见从塞隆骨中分离纯化获得具有显著抗炎镇痛活性成分的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种具有抗炎镇痛活性的塞隆骨提取物。

本发明的再一的目的是提供所述的塞隆骨提取物的制备方法。

本发明的另一的目的是提供供所述的塞隆骨提取物的用途。

本发明的第四个目的是提供一种具有抗炎镇痛活性的中药制剂。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种塞隆骨提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)粉碎；

(2)提取：减压蒸馏提取塞隆骨脂溶性提取部位；

(3)萃取：将步骤(2)所得脂溶性提取部位用去离子水溶解，先用石油醚萃取，水相再用乙酸乙酯进行萃取，浓缩至干得到乙酸乙酯部分；

(4)柱分离：

干法拌样：在乙酸乙酯部分中加入甲醇充分溶解，再加入硅胶进行拌样，研碎至粉末状；

干法装柱：在柱子中装入硅胶和拌好的样品，以乙酸乙酯:甲醇＝1:1的溶剂作为洗脱液进行洗脱，洗脱液干燥即得塞隆骨提取物。

优选的，所述步骤(2)为在70摄氏度下用体积比为95％乙醇减压蒸馏提取，提取液浓缩至干，得到塞隆骨脂溶性提取部位。

优选的，所述步骤(4)中装入柱子的硅胶为200-300目。

优选的，所述步骤(4)中装入柱子的硅胶为拌后的样品体积的40-60倍。

优选的，所述步骤(4)中洗脱时依次以石油醚:乙酸乙酯＝4:1、2:1和1:1进行梯度洗脱。

优选的，所述步骤(4)中通过TLC的位置和显色确定馏分是否一致，收集馏分一致的部分进行干燥得塞隆骨提取物。

为实现上述第一个目的，本发明公开了由上述的制备方法制备的塞隆骨提取物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：上述塞隆骨提取物在制备抗炎镇痛药物中的应用。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：一种具有抗炎镇痛活性的中药制剂，其由上述塞隆骨提取物或者添加药物学常用的辅料和药学可接受的载体制成。

优选的，所述塞隆骨提取物的质量分数20-90％。

其中经检测，具有明显抗炎镇痛活性的部位是：石油醚:乙酸乙酯＝1:1洗脱部分(得到白色粉末状和针状晶体混合物)。

本发明优点在于：本发明所获得的塞隆骨提取物具有抗炎镇痛活性，可以制备抗炎镇痛药物，尤其是中药制剂。该中药制剂中的塞隆骨提取物可占制剂总质量的20-90％，其余可添加药物学常用的辅料和药学可接受的载体。

具体实施方式

实施例1本发明的塞隆骨提取物的制备

一、方法步骤

(1)取塞隆骨风干品进行粉碎，可以为粉碎后过120目筛。

(2)提取：在旋转蒸发仪70摄氏度下用体积比为95％乙醇提取4次，2h/次，再将这4次的提取液合并，减压浓缩至干，得到塞隆骨脂溶性提取部位。(高浓度乙醇提取可避免大极性物质被同时提出，减少分离过程中的物质干扰)。

(3)脂溶性部分的萃取：去离子水溶解，分别用石油醚和用乙酸乙酯进行萃取，每次萃取静置半小时，萃取4—6次，合并萃取液分别浓缩至干得到石油醚部分和乙酸乙酯部分。具体是：先用石油醚进行萃取，目的是减少乙酸乙酯部分中的小极性杂质。石油醚萃取的水相再用乙酸乙酯萃取，有机相即萃取液。

(4)柱分离：乙酸乙酯部分

干法拌样：在5g的乙酸乙酯部分中加入15ml纯甲醇溶液充分溶解，再加入约15g200-300目硅胶进行拌样，研碎至粉末状；

干法装柱：装柱硅胶为200-300目，约干法拌样所得粉末状样品的50倍

必须保证柱子平、实、正三个原则；将拌好的样品均匀的倒入柱子里，放一团棉花，防止冲柱时把样品冲起来；则以石油醚:乙酸乙酯＝4:1(v/v)的溶剂开始冲柱，至淡黄色色带无色为止，换石油醚:乙酸乙酯＝2:1的梯度继续冲，同上，依次以石油醚:乙酸乙酯＝1:1梯度冲到色带跑完为止，最后点板子进行合并。

所述点板子即以硅胶板为固定相，乙酸乙酯：石油醚＝1:1.5(体积比)为流动相，显示剂为5％硫酸乙醇溶液，以色谱板上至下第二个点(最大的点)显色为紫色点的部分进行合并。

点板子的目的是合并洗脱液中馏分相同的部分。

二、结果

其中经检测，具有明显抗炎镇痛活性的部位是：石油醚:乙酸乙酯＝1:1洗脱部分(得到白色粉末状和针状晶体混合物)，本发明所得塞隆骨脂溶性部分部分的纯化产物称之为SLG-e。

本发明所得的塞隆骨提取物可以制备抗炎镇痛药物，尤其是中药制剂。该中药制剂中的塞隆骨提取物可占制剂总质量的20-90％，其余可添加药物学常用的辅料和药学可接受的载体。

三、实验

1.本发明的塞隆骨提取物SLG-e对以二甲苯所致的小鼠耳肿胀急性炎症模型的影响

1.1实验动物

昆明种小鼠，雌性，6-8周龄，体重20－25g，分为5组，每组10只。购自青海省实验动物中心。

1.2受试药物及实验材料：；

二甲苯，塞隆骨脂溶性部分部分纯化产物SLG-e

1.3实验方法

小鼠随机分组，连续给药一周，每鼠于右耳廓均匀涂10-50μl二甲苯，左耳作对照。2小时后脱椎处死，剪下小鼠耳廓，用9mm的穿孔器将耳廓圆片取下，称重。

1.4结果

表1：塞隆骨提取物对二甲苯所致的小鼠耳肿胀的抑制作用

*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vsModel

SLG-e能明显抑制(P<0.05,P<0.01)二甲苯所致的小鼠急性炎症反应，表现出很好的量效关系。

2.SLG-e对蛋清致大鼠足肿胀的影响

2.1实验动物

SD大鼠，雌雄性兼备，6-8周龄，体重120－150g，分为5组，每组10只。购自青海省实验动物中心。

2.2受试药物及实验材料：

塞隆骨提取物(SLG-e)，新鲜鸡蛋清。自制大鼠足肿胀测定仪。

2.3实验方法

选用健康SD大鼠50只，雌雄各半，体重150士30g，随机分为5组，分别为空白对照组、阳性对照组和SLG-e高、中、低剂量组，按照表2所列剂量与途径给药。空白对照组灌胃等容积的生理盐水，每日给药1次，连续给药7d实验前于每只大鼠左后足踩关节处做标记，用外径千分尺测定大鼠左后足厚度。末次给药30min后于大鼠左后足拓皮下注射10％蛋清0.lml致炎。在致炎后1,2,3,4h分别测定大鼠左后足厚度，计算各大鼠致炎前后左后足厚度变化，以肿胀度(致炎后足厚度值与致炎前足厚度之差值)判定药物的抗炎效果。结果见表2。

2.4结果

表2：塞隆骨提取物给药对蛋清致大鼠足肿胀的影响

*P<0.05；**p<0.01vsmodel

SLG-e在抑制蛋清致的大鼠足肿胀实验中表现出了一定的抗炎效果，能够抑制由蛋清引起的大鼠足肿胀，但均未产生明显的抑制效果(p>0.05)。

3.SLG-e对二硝基氟苯诱导的DTH小鼠耳肿胀的影响

3.1实验动物：SPF级BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄，体重20－25g，分为6组，分别为四个给药组，模型组及一个阳性对照组，每组10只。购自中国科学院上海实验动物中心。

3.2受试药物及实验材料：SLG-e；0.5％DNFB(取适量DNFB溶于丙酮：橄榄油＝4：1的溶剂中)。

3.3实验方法：

1.致敏：将0.5％的DNFB溶液用枪缓慢加到BALB/C雌鼠的后脚上致敏(每只后脚20ul)。次日加强一次。

2.初次致敏后第9天，用20ul0.4％DNFB攻击鼠左耳，内外两侧各10ul。

3.攻击前1h给药；攻击后12h腹腔注射给药(可根据实际情况确定给药方案)

4.攻击后24～48h检测各指标。

注：①若BALB/C用20ul/只脚使脚肿，可改用15ul/只脚。致敏时，让致敏剂干后再将小鼠放回笼中。加强后分笼。

②ICR鼠致敏和加强用20ul0.7％；攻击用20ul0.6％DNFB

③处理小鼠前，将实验室室温调至24℃左右。攻击后，让耳部油剂晾干后放回笼中。

④在室温为24℃时，将小鼠提前取出；在实验室先放一段时间，让其恢复原先状态。

⑤处理小鼠时，脱颈椎处死→打耳片→称重

3.4结果与讨论：

表3：提取物SLG-e对DNFB诱导的BALB/c耳肿胀的抑制效果

n＝10*P<0.05,**P<0.01vsModel

DTH实验是一种体内检测细胞介导免疫功能的方法，与接触性超敏反应相似。DTH也包括致敏和触发两个阶段。致敏约需要6天，在触发后的24～48小时DTH的炎症反应达到高峰。在初始的致敏阶段有记忆性的抗原特异性细胞分布到外周各淋巴组织，在任何局部的抗原刺激会使这些细胞迅速活化引起DTH。

4.SLG-e对T/B淋巴细胞增殖的影响

4.1试验目的：

本试验采用MTT法在体外检测塞隆骨制剂及不同提取物对小鼠脾脏淋巴细胞的细胞毒性。利用丝裂原ConA，LPS分别诱导小鼠脾脏T，B淋巴细胞增殖，通过[³H]-thymidine掺入法，观察评价塞隆提取物在体外对正常小鼠淋巴细胞增殖活性的影响。

4.2受试药物：

名称：塞隆骨提取物SLG-e。

配制方法：-20℃保存备用；试验前用DMSO溶解，稀释至所需浓度后使用。

4.3试验动物及实验材料：

SPF级BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄，购自中国科学院上海实验动物中心。

MTT，ConA，LPS：Sigma公司产品。

胎牛血清(FBS)：Invitrogen公司产品。

³H-胸腺嘧啶核苷酸([³H]-thymidine)：购买于上海原子核研究所。

4.4试验原理：

刀豆素(ConA)、细菌脂多糖(LPS)是常用的有丝分裂原，在体外可分别诱导正常小鼠脾脏淋巴T细胞、B细胞增殖。淋巴细胞激活后进入细胞周期有丝分裂，细胞合成DNA量明显增加，在培养基中加入³H标记的DNA前身物质胸腺嘧啶核苷(thymidine)，可掺入到新合成的DNA中。根据[³H]-thymidine的掺入量可推测淋巴细胞对丝裂原的应答水平。掺入的[³H]-thymidine经液体闪烁测量法测出，以cpm加以计算，了解受试药物对细胞增殖活性的影响。

4.5试验方法:

脾细胞悬液制备：取实验小鼠脱脊椎法处死，消毒取脾脏。将脾脏用玻片磨碎过膜于1200rpm离心5分钟弃去上清。沉淀加红细胞裂解液2-4ml混匀，静置1分钟，加PBS后过膜，1200rpm离心5分钟弃上清，所剩细胞用PBS洗涤1-2次，最后用1640(10％FBS)调节细胞浓度。.

4.5.1细胞毒性：96孔培养板中加入90μL细胞(细胞浓度5.0×10⁶/mL)，45μL的药物(对照加45μL的DMSO)，同时加入45μL含10％FCS的RPMI-1640培养液，总体积180μL。每实验组设3个复孔，另设3孔加入RPMI-1640(含10％FCS)培养液作为细胞增殖的本底对照。细胞于含5％CO₂的37℃培养箱中培养48小时，结束培养前4-5小时每孔加入18μLMTT(5mg/mL)。培养结束时，加入溶解液90μl，放置6-7小时左右，用酶标仪于570nm处测OD值。用以下公式计算药物对淋巴细胞的细胞毒性：

4.5.2细胞增殖：96孔培养板中加入100μL细胞(细胞浓度5.0×10⁶/mL)，终浓度为5μg/ml的ConA或者终浓度为10μg/ml的LPS，同时加入SLG-e蛋白提取物(七个浓度μg/ml)，终体积200μl。每实验组设3个复孔。细胞于含5％CO₂的培养箱中培养48小时，用³H掺入法测细胞增殖。

4.6试验结果：

通过T、B淋巴细胞体外增殖实验可以看到在低剂量时SLG-e对T、B淋巴细胞增殖都有明显的抑制作用，且具有明显的量效关系。