阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体及其制备方法

摘要

本发明所述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体，主要由盐酸阿霉素、伊曲康唑、磷脂、其它组分、硫酸铵溶液和注射用水制成，平均粒径为60～200nm，所述盐酸阿霉素、伊曲康唑、磷脂、其它组分的质量份如下：盐酸阿霉素1～40份，伊曲康唑1～20份，磷脂80～140份，其它组分20～100份；所述其它组分为胆固醇、糖脂质、谷固醇中的至少一种，所述硫酸铵溶液浓度为100～400毫摩尔/升，所述注射用水为生理盐水或质量浓度5％的葡萄糖注射液。所述脂质体赋予药物肿瘤组织靶向性，更有效的抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖，并降低药物对人体正常组织的毒副作用。

说明书

技术领域

本发明属于药剂技术领域，特别涉及一种阿霉素和伊曲康唑共载脂质体及其制备方法。

背景技术

目前癌症的防治已经有重大的进展，但是由于癌症早期诊断困难，以及缺少治疗癌症转 移的有效技术方案，治愈癌症仍然是一个难题。此问题的症结在于，尽管抗细胞增殖药物可 直接杀死部分肿瘤细胞，但因周围血管的支持，残存肿瘤细胞仍可继续增殖，甚至通过血管 或淋巴管转移，导致肿瘤治疗失败。针对这一问题，全球医学界近年来纷纷采用“抗肿瘤血管 生成+抗肿瘤细胞增殖”的治疗方案，以达到“饿死肿瘤”的目的，这已逐渐成为癌症治疗新趋 势。

2015年中华医学杂志报道了盐酸阿霉素和伊曲康唑单独使用以及联合使用对急性髓系白 血病细胞增殖和凋亡的影响的体外实验(Zhonghuayixuezazhi.2015；95:299-305)。1999年 Biological&pharmaceuticalbulletin杂志报道了伊曲康唑可逆转肿瘤细胞对阿霉素耐药，增强 阿霉素IC₅₀值(Biological&pharmaceuticalbulletin.1999；22:1355-9)。上述两项研究报道中存 在以下不足，有待改进。1)所用盐酸阿霉素和伊曲康唑均以水溶液剂型使用。通过静脉给药 用于肿瘤治疗，缺乏肿瘤靶向性，导致对肿瘤治疗效果差，对正常组织毒副作用较大。2)上 述两项研究仅报道了体外细胞的初步结果，缺乏体内荷瘤动物治疗效果的评价结果，因而不 足以全面评价药物的疗效及毒副作用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体及 其制备方法，以赋予药物肿瘤组织靶向性，更有效的抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖，并 降低药物对人体正常组织的毒副作用。

本发明所述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体，主要由盐酸阿霉素、伊曲康唑、磷脂、 其它组分、硫酸铵溶液和注射用水制成，平均粒径为60～200nm，所述盐酸阿霉素、伊曲康唑、 磷脂、其它组分的质量份如下：

所述其它组分为胆固醇、糖脂质、谷固醇中的至少一种，所述硫酸铵溶液的浓度为 100～400毫摩尔/升，所述注射用水为生理盐水或质量浓度5％的葡萄糖注射液。

上述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体，所述磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、 磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、心磷脂中的至少一种。

上述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体，所述磷脂酰胆碱为氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化 蛋黄磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱中的一种。

上述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体，还包含1～20质量份聚乙二醇修饰的磷脂。所述 聚乙二醇修饰的磷脂为聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷 脂酰甘油、聚乙二醇修饰的二油酰磷脂酰乙醇胺中的一种。

本发明所述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体的制备方法，工艺步骤如下：

(1)制备伊曲康唑纳米脂质体

原料为伊曲康唑1～20质量份、磷脂80～140质量份、其它组分20～100质量份，或者伊曲 康唑1～20质量份、磷脂80～140质量份、其它组分20～100质量份、聚乙二醇修饰的磷脂1～20 质量份，将上述各原料共同溶于溶剂中形成混合均匀的溶液，所述溶剂的用量应使溶液中磷 脂的浓度为1～200mg/L，继后除去所述溶液的溶剂得到脂膜，再将所得脂膜溶于浓度为 100～400毫摩尔/升的硫酸铵溶液中形成悬液，硫酸铵溶液的用量应使形成的悬液中磷脂的浓 度为0.1～1mg/mL，将所得悬液依次于30～65℃水浴超声15～30分钟、室温下探头超声1～ 5分钟，超声处理后分离去除游离伊曲康唑得到伊曲康唑纳米脂质体；

(2)制备阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体

将1～40质量份盐酸阿霉素用注射用水配制成浓度为1～10mg/mL的盐酸阿霉素水溶液； 将步骤(1)得到的伊曲康唑纳米脂质体于注射用水中透析4～12小时，所述伊曲康唑纳米脂 质体与注射用水的体积比为1︰(50～1000)，透析过程中每隔2～6h更换新鲜等量注射 用水，透析结束后，取出袋内的伊曲康唑纳米脂质体与配制好的盐酸阿霉素水溶液混合均匀 形成混合液，并将所述混合液于30～65℃水浴保温10～60min，然后分离去除游离阿霉素， 即得阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体；

所述其它组分为胆固醇、糖脂质、谷固醇中的至少一种；所述注射用水为生理盐水或质 量浓度5％的葡萄糖注射液；所述溶剂为甲醇与二氯甲烷以体积比1:2组合所得的组合溶剂， 或甲醇与三氯甲烷以体积比1:2组合所得的组合溶剂。

上述方法中，所述磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝 氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、心磷脂中的至少一种；

上述方法中，所述磷脂酰胆碱为氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋黄磷脂酰胆碱、大豆磷脂 酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱中的一种。

上述方法中，所述聚乙二醇修饰的磷脂为聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙 二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰甘油、聚乙二醇修饰的二油酰磷脂酰乙醇胺中的一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明为盐酸阿霉素和伊曲康唑共用提供了一种新的剂型，即脂质体。

2、本发明所述方法通过将盐酸阿霉素和伊曲康唑共载，制成纳米级的脂质体，纳米脂质 体可以通过EPR效应(实体瘤的高通透性和滞留效应)靶向肿瘤组织，赋予了药物的肿瘤组 织靶向性。

3、由于本发明所述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体具有肿瘤组织靶向性，并且盐酸阿 霉素和伊曲康唑具有协同抗肿瘤作用，相比将盐酸阿霉素、伊曲康唑分别以溶液形式单独或 同时使用，或将盐酸阿霉素与伊曲康唑以盐酸阿霉素和伊曲康唑混合溶液的形式使用，本发 明所述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体能更有效的抑制肿瘤细胞增殖(见实施例6、实施 例10)，抑制血管内皮细胞增殖(见实施例7)，从而抑制肿瘤血管生成，并能抑制肿瘤细胞 和血管内皮细胞迁移(见实施例9)，减少肿瘤转移(见实施例10)，因而能进一步提高肿瘤 治疗效果(见实施例10)。

3、本发明所述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体能增加肿瘤细胞对盐酸阿霉素的摄取 (见实施例8)，从而可以减少盐酸阿霉素的使用量，同时由于药物具有肿瘤组织靶向性，因 此能避免药物以游离形式使用时对人体正常组织的毒副作用(见实施例10)。

3、本发明所述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体药物包封率可达到90％以上，粒径可低 于200nm，具有包封率高、稳定性好、成本低、制备简单等优点。

附图说明

图1为细胞摄取实验结果图(a为游离盐酸阿霉素组，b为实施例1组)

图2为细胞迁移实验结果图(a为4T1细胞孔板上的初始划痕；b为4T1细胞的对照组1， 24h划痕；c为4T1细胞的对照组2，24h划痕；d为4T1细胞的实验组，24h划痕；e为HUVEC 细胞孔板上的初始划痕；f为HUVEC细胞的对照组1，24h划痕；g为HUVEC细胞是对照 组2，24h划痕；h为HUVEC细胞的实验组，24h划痕)。

图3为小鼠肿瘤体积变化曲线。

图4为小鼠体重变化曲线。

图5为组织染色和免疫组化结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明所述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体做进一步说明。

以下实施例中，各原料均于市场购得。

以下实施例中，药物包封率的计算公式为：包封率＝(药物投料质量-游离药物质量)/药 物投料质量×100％。

实施例1

本实施例的工艺步骤如下：

(1)制备伊曲康唑纳米脂质体

称取伊曲康唑10g(2质量份)、大豆磷脂(大豆磷脂酰胆碱纯度＞76％)540g(108质量 份)、胆固醇400g(80质量份)，将称量好的各原料共同溶于甲醇与二氯甲烷以体积比1:2组 合所得的组合溶剂中形成溶液，所述组合溶剂的用量以溶液中大豆磷脂浓度为1mg/L为限， 除去溶剂得到脂膜，将所得脂膜溶于250mmol/L的(NH₄)₂SO₄溶液中形成悬液，(NH₄)₂SO₄溶液的用量以形成的悬液中大豆磷脂的浓度0.1mg/mL为限，将所得悬液于30℃水浴超声15 分钟，室温下探头超声1分钟，再在3500转/分钟下离心5min，吸取上清液即得伊曲康唑纳 米脂质体；

(2)制备阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体

称取盐酸阿霉素50g(10质量份)并配置成浓度为1mg/mL的盐酸阿霉素水溶液；将步 骤(1)得到的伊曲康唑纳米脂质体于生理盐水(质量浓度为0.9％的NaCl溶液)中透析4小 时，伊曲康唑脂质体与生理盐水的体积比为1:1000，每隔2h换新鲜等量生理盐水，透析结束 后，取出袋内的伊曲康唑纳米脂质体与配制好的盐酸阿霉素水溶液混合均匀，并于30℃水浴 保温10min，然后采用SephadexG-50凝胶柱层析分离除出游离药物，即得阿霉素和伊曲康唑 共载纳米脂质体。

采用激光粒度仪测得本实施例制备的脂质体的平均粒径(数均)为62nm。采用高效液相 方法检测游离阿霉素和伊曲康唑含量。阿霉素包封率为90％，伊曲康唑包封率为92％。

实施例2

本实施例的工艺步骤如下：

(1)制备伊曲康唑纳米脂质体

称取伊曲康唑100g(20质量份)、磷脂酰甘油280g(56质量份)、氢化大豆磷脂酰胆碱 420g(84质量份)、胆固醇150g(30质量份)、聚乙二醇修饰的胆固醇45g(9质量份)，将 称量好的各原料共同溶于甲醇与二氯甲烷以体积比1:2组合所得的组合溶剂中形成溶液，所 述组合溶剂的用量以溶液中磷脂(磷脂酰甘油与氢化大豆磷脂酰胆碱的总质量)浓度为200 mg/L为限，除去溶剂得到脂膜，将所得脂膜溶于400mmol/L(NH₄)₂SO₄溶液中形成悬液， (NH₄)₂SO₄溶液的用量以形成的悬液中磷脂(磷脂酰甘油与氢化大豆磷脂酰胆碱的总质量)的 浓度1mg/mL为限，将所得悬液于65℃水浴超声30分钟，室温下探头超声5分钟，再在3500 转/分钟下离心5min，吸取上清液即得伊曲康唑纳米脂质体；

(2)制备阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体

称取盐酸阿霉素5g(1质量份)并配置成浓度为10mg/mL的盐酸阿霉素水溶液；将步 骤(1)得到的伊曲康唑纳米脂质体于葡萄糖注射液(质量浓度为5％的葡萄糖溶液)中透析 12小时，伊曲康唑脂质体与生理盐水的体积比为1:50，每隔2h换新鲜等量葡萄糖注射液， 透析结束后，取出袋内的伊曲康唑纳米脂质体与配制好的盐酸阿霉素水溶液混合均匀，并于 65℃水浴保温60min，然后采用SephadexG-50凝胶柱层析分离除出游离药物，即得阿霉素和 伊曲康唑共载纳米脂质体。

采用激光粒度仪测得本实施例制备的脂质体的平均粒径(数均)为102nm。采用高效液 相方法检测游离阿霉素和伊曲康唑含量。阿霉素包封率为93％，伊曲康唑包封率为90％。

实施例3

本实施例的工艺步骤如下：

(1)制备伊曲康唑纳米脂质体

称取伊曲康唑20g(4质量份)、磷脂酰丝氨酸180g(36质量份)、氢化蛋黄磷脂酰胆碱 400g(80质量份)、胆固醇100g(20质量份)、聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰甘油100g(20 质量份)，将称量好的各原料共同溶于甲醇与三氯甲烷以体积比1:2组合所得的组合溶剂中形 成溶液，所述组合溶剂的用量以溶液中磷脂(磷脂酰丝氨酸与氢化蛋黄磷脂酰胆碱的总质量) 浓度为50mg/L为限，除去溶剂得到脂膜，将所得脂膜溶于300mmol/L(NH₄)₂SO₄溶液中形 成悬液，(NH₄)₂SO₄溶液的用量以形成的悬液中磷脂(磷脂酰丝氨酸与氢化蛋黄磷脂酰胆碱的 总质量)的浓度4mg/mL为限，将所得悬液于50℃水浴超声20分钟，室温下探头超声2分 钟，再在3500转/分钟下离心5min，吸取上清液即得伊曲康唑纳米脂质体；

(2)制备阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体

称取盐酸阿霉素200g(40质量份)并配置成浓度为5mg/mL的盐酸阿霉素水溶液；将 步骤(1)得到的伊曲康唑纳米脂质体悬液于生理盐水(质量浓度为0.9％的NaCl溶液)中透 析6小时，伊曲康唑脂质体与生理盐水的体积比为1:200，每隔6h换新鲜等量生理盐水，透 析结束后，取出袋内的伊曲康唑纳米脂质体与配制好的盐酸阿霉素水溶液混合均匀，并于50℃ 水浴保温30min，然后采用SephadexG-50凝胶柱层析分离除出游离药物，即得阿霉素和伊曲 康唑共载纳米脂质体。

采用激光粒度仪测得本实施例制备的脂质体的平均粒径(数均)为146nm。采用高效液 相方法检测游离阿霉素和伊曲康唑含量。阿霉素包封率为91％，伊曲康唑包封率为94％。

实施例4

本实施例的工艺步骤如下：

(1)制备伊曲康唑纳米脂质体

称取伊曲康唑25g(5质量份)、磷脂酰丝氨酸180g(36质量份)、氢化蛋黄磷脂酰胆碱 400g(80质量份)、胆固醇500g(100质量份)、聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺50g (10质量份)，将称量好的各原料共同溶于甲醇与三氯甲烷以体积比1:2组合所得的组合溶剂 中形成溶液，所述组合溶剂的用量以溶液中磷脂(磷脂酰丝氨酸和氢化蛋黄磷脂酰胆碱的总 质量)浓度为50mg/L为限，除去溶剂得到脂膜，将所得脂膜溶于100mmol/L的(NH₄)₂SO₄溶液中形成悬液，(NH₄)₂SO₄溶液的用量以形成的悬液中磷脂(磷脂酰丝氨酸和氢化蛋黄磷脂 酰胆碱的总质量)的浓度4mg/mL为限，将所得悬液于50℃水浴超声20分钟，室温下探头 超声2分钟，再在3500转/分钟下离心5min，吸取上清液即得伊曲康唑纳米脂质体；

(2)制备阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体

称取盐酸阿霉素25g(5质量份)并配置成浓度为5mg/mL的盐酸阿霉素水溶液；将步骤 (1)得到的伊曲康唑纳米脂质体于生理盐水(质量浓度为0.9％的NaCl溶液)中透析6小时， 伊曲康唑脂质体与生理盐水的体积比为1:500，每隔4h换新鲜等量生理盐水，透析结束后， 取出袋内的伊曲康唑纳米脂质体与配制好的盐酸阿霉素水溶液混合均匀，并于50℃水浴保温 30min，然后采用SephadexG-50凝胶柱层析分离除出游离药物，即得阿霉素和伊曲康唑共载 纳米脂质体。

采用激光粒度仪测得本实施例制备的脂质体的平均粒径(数均)为135nm。采用高效液 相方法检测游离阿霉素和伊曲康唑含量。阿霉素包封率为93％，伊曲康唑包封率为91％。

实施例5

本实施例的工艺步骤如下：

(1)制备伊曲康唑纳米脂质体

称取伊曲康唑5g(1质量份)、二硬脂酰磷脂酰胆碱180g(36质量份)、磷脂酰乙醇胺 220g(44质量份)、糖脂质500g(100质量份)、聚乙二醇修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺5g (1质量份)，将称量好的各原料共同溶于甲醇与三氯甲烷以体积比1:2组合所得的组合溶剂 中形成溶液，所述组合溶剂的用量以溶液中磷脂(二硬脂酰磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺总质 量)浓度为50mg/L为限，除去溶剂得到脂膜，将所得脂膜溶于300mmol/L(NH₄)₂SO₄溶液中 形成悬液，(NH₄)₂SO₄溶液的用量以形成的悬液中磷脂(二硬脂酰磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺 总质量)的浓度4mg/mL为限，将所得悬液于50℃水浴超声20分钟，室温下探头超声2分 钟，再在3500转/分钟下离心5min，吸取上清液即得伊曲康唑纳米脂质体；

(2)制备阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体

称取盐酸阿霉素45g(9质量份)并配置成浓度为5mg/mL的盐酸阿霉素水溶液；将步骤 (1)得到的伊曲康唑纳米脂质体于葡萄糖注射液(质量浓度为5％的葡萄糖溶液)中透析10 小时，伊曲康唑脂质体与生理盐水的体积比为1:200，每隔2h换新鲜等量葡萄糖注射液，透 析结束后，取出袋内的伊曲康唑纳米脂质体与配制好的盐酸阿霉素水溶液混合均匀，并于50℃ 水浴保温30min，然后采用SephadexG-50凝胶柱层析分离除出游离药物，即得阿霉素和伊曲 康唑共载纳米脂质体。

采用激光粒度仪测得本实施例制备的脂质体的平均粒径(数均)为200nm。采用高效液 相方法检测游离阿霉素和伊曲康唑含量。阿霉素包封率为94％，伊曲康唑包封率为90％。

实施例6:肿瘤细胞增殖抑制实验

将作为对照组1的游离盐酸阿霉素水溶液(DOX)、作为对照组2的游离伊曲康唑(ITZ) 注射液、各个实施例制备的阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体分别用于细胞实验，采用CCK-8 比色法进行实验，步骤如下：

将对数生长期的4T1(小鼠乳腺癌)细胞用胰蛋白酶消化，用培养基稀释成3×10⁴/ml的 细胞悬液，将该细胞悬液按100μl/孔加入96孔细胞培养板中，每孔细胞数为3000～4000个。 将细胞培养板置于37℃孵箱中，孵育24h，显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。分别将对 照组1、对照组2、各个实施例制备的阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体样品溶于培养基中， 所有溶液以其中盐酸阿霉素的含量为基准，稀释成不同浓度，折算成盐酸阿霉素浓度分别为 0.001μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，0.25μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml。伊曲 康唑溶液同样稀释成上述浓度。向上述96孔细胞培养板中分别加入不同浓度的各样品100μl/ 孔，每个浓度设3个复孔，培养48h后，每孔加入10μlCCK-8溶液，继续培养4h。

IC₅₀即50％抑制浓度，是抑制半数癌细胞增殖时的药物浓度，IC₅₀值越低，说明细胞毒性 作用越大。试验中IC₅₀值由IC50.exe软件计算得到，结果见表1。

表1

由表1可知，共载脂质体中阿霉素的IC₅₀远远低于盐酸阿霉素溶液，说明共载纳米脂质 体抑制肿瘤细胞增殖的作用更强。

实施例7：血管内皮细胞增殖抑制实验

将伊曲康唑注射液(ITZ)、伊曲康唑纳米脂质体(按实施例1步骤(1)制备得到，不含 阿霉素，因为阿霉素是细胞毒性药物)分别用于细胞实验，采用CCK-8比色法进行实验，步 骤如下：

将对数生长期的HUVEC(人脐静脉内皮细胞)用胰蛋白酶消化，用培养基稀释成5X10⁴/ml 的细胞悬液，将该悬液按100μl/孔均匀加入96孔细胞培养板中，每孔细胞数约为5000个。 将细胞培养板置于37℃孵箱中，孵育24h，显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。分别将上 述游离伊曲康唑注射液、伊曲康唑纳米脂质体样品溶于培养基中，所有溶液以伊曲康唑的含 量为基准，稀释成不同浓度溶液，依次为0.001μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，0.25μg/ml， 0.5μg/ml，1μg/ml，10μg/ml，50μg/ml。向上述孔细胞培养板中加入不同浓度的药物100μl/孔， 每个浓度设3个复孔，培养48h后，每孔加入10μlCCK-8溶液，继续培养4h。

由IC50.exe软件计算IC₅₀值，结果见表2。

表2

由表2可知，伊曲康唑脂质体对血管内皮细胞增殖的抑制效果更好。

实施例8：细胞摄取实验

将作为对照组的游离盐酸阿霉素水溶液(DOX)、作为实验组的实施例1制备的阿霉素 和伊曲康唑共载纳米脂质体分别用于细胞实验，采用激光共聚焦显微镜进行细胞摄取实验， 步骤如下：

将对数生长期的4T1(小鼠乳腺癌)细胞用胰蛋白酶消化，用培养基稀释成3×10⁴/ml的 细胞悬液，将该悬液按100μl/孔均匀加入直径20mm的玻底皿中。将玻底皿置于37℃孵箱中， 孵育24h，显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。将对照组和实施例1的样品加入细胞培养 基中，使阿霉素终浓度分别为0.1μg/ml，0.25μg/ml。继续培养4小时后，吸去培养基，用新 鲜磷酸盐缓冲液清洗两次。然后加入10微升10mg/ml的Hoechst33258试剂，再加入200 微升磷酸盐缓冲液共同孵育15分钟。时间届满，弃去溶液，用新鲜磷酸盐洗涤一次，加入 200微升新鲜磷酸盐缓冲液保持细胞润湿备测。激光共聚焦488nm激发，检测575-585nm发 射光，结果见图1。由图1可见，实验组细胞内阿霉素荧光强于对照组，说明共载脂质体能 提高肿瘤细胞对盐酸阿霉素的摄取量。

实施例9:细胞迁移实验

肿瘤细胞突破血管基底膜，通过血管转移至远端形成新的肿瘤病灶以及血管内皮细胞的 迁移是肿瘤转移的主要因素之一。因此采用细胞迁移实验考查药物以及本发明所述共载纳米 脂质体对肿瘤转移的作用。由于阿霉素对细胞生长有抑制作用，细胞迁移实验中如果采用含 阿霉素的脂质体则会影响细胞活力，从而干扰迁移实验的结果。所以该细胞迁移实验中仅考 察了伊曲康唑注射液和伊曲康唑脂质体。对照组1为不含药的正常培养基、对照组2为伊曲 康唑注射液，实验组为按照实施例5中步骤(1)的方法制备的伊曲康唑纳米脂质体(不含阿 霉素)，将各组分别用于细胞划痕实验，采观用光学相差显微镜进行察和拍照，步骤如下：

将对数生长期的4T1(小鼠乳腺癌)细胞和HUVEC(人脐静脉内皮细胞)用胰蛋白酶 消化，用培养基稀释成3×10⁴/ml的细胞悬液，将该悬液按600μl/孔均匀加入24孔板中。将孔 板置于37℃孵箱中孵育24h，显微镜下观察可见细胞融合贴壁生长。用200ul无菌枪头垂直 于孔板刮去孔底的细胞，使其形成宽度均匀的划痕，吸去培养基，用磷酸盐缓冲溶液清洗两 次除去脱落的细胞。将对照组1、对照组2和实验组样品加入细胞培养基中，使伊曲康唑浓 度均为1.5μg/ml。继续培养24小时后，吸去培养基，用新鲜磷酸盐缓冲液清洗两次，拍照结 果见图2。

由图2可以看出，对于4T1细胞和HUVEC均是实验组的划痕区域内细胞数量最少，说 明细胞迁移量最低；其次是对照组2迁移量较少；对照组1划痕基本愈合，细胞迁移量最大。 这说明伊曲康唑脂质体能更好的抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞迁移。

实施例10荷瘤小鼠治疗实验

将生理盐水、阿霉素和伊曲康唑混合液、实施例1制备的阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂 质体分别注射给荷瘤小鼠用于肿瘤治疗实验，所述阿霉素和伊曲康唑混合液的制备方法如下： 用二甲亚砜溶液溶解伊曲康唑得到伊曲康唑溶液，所得溶液中伊曲康唑浓度为10mg/mL，量 取所得伊曲康唑溶液，用适量生理盐水稀释后称取盐酸阿霉素溶解于稀释后的伊曲康唑溶液 中。伊曲康唑溶液、生理盐水以及盐酸阿霉素用量保证终溶液中伊曲康唑浓度为0.1mg/mL， 阿霉素浓度为0.5mg/mL。

实验方法如下：

对数生长期的4T1(小鼠乳腺癌)细胞用胰蛋白酶消化，用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释 成1X10⁷个/mL，对每只小鼠于右侧第二对乳腺脂肪垫内注射50ul细胞悬液，制作小鼠原位 乳腺癌模型。当肿瘤体积增长至50～100mm³时开始给药。小鼠随机分成3组，每组8只， 分别为生理盐水组、阿霉素和伊曲康唑混合溶液组、实施例1组。对阿霉素和伊曲康唑混合 溶液组的小鼠注射阿霉素和伊曲康唑混合溶液，给药剂量为阿霉素5mg/kg和伊曲康唑

1mg/kg。对实施例1组的小鼠注射实施例1制备的阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体，给药 剂量为阿霉素3mg/kg，伊曲康唑0.6/kg，对生理盐水组的小鼠注射等量生理盐水。各组小鼠 每隔两天给药一次，一共给药5次，于给药当天称量小鼠体重并用游标卡尺测量肿瘤的长径 L(mm)和短径W(mm)。根据公式V＝LXW²/2计算肿瘤体积V(mm³)，绘制各组肿瘤 生长曲线。小鼠肿瘤体积变化曲线见图3，小鼠体重变化曲线见图4。最后一次测量后，颈椎 脱臼处死小鼠，分别取出各组小鼠的肿瘤、心、肺做组织切片，免疫组化染色，方法如下： TUNEL法检测凋亡细胞

对各组小鼠的肿瘤组织分别依次进行4％多聚甲醛固定、常规乙醇脱水、常规石蜡包埋、 切片、切片常规脱蜡至水。用胰蛋白酶K(ProteinaseK)工作液在37℃处理组织切片25min， PBS漂洗3次。然后按照TUNEL试剂盒(罗氏公司Tunel试剂盒(Insitucelldeathdetection kit-POD法))的说明书进行操作。结果见图5(TUNEL)，阳性表达为浅黄色或棕黄色，阴 性表达为蓝色，底色为白色。

CD31(血小板-内皮细胞粘附分子，该实验用于检测微血管生成)

对各组小鼠的肿瘤组织分别依次进行4％多聚甲醛固定、常规乙醇脱水、常规石蜡包埋、 切片、切片常规脱蜡至水。每张切片加1滴3％H₂O₂，室温10分钟以灭活内源性过氧化物酶， 蒸馏水洗3次。继以热修复抗原，滴加山羊血清封闭液，室温20分钟。滴加稀释的一抗CD31 兔多克隆抗体(英国abcam)(1：200)，4℃过夜，PBS(PH7.2-7.4)洗3次。滴加生物素化 山羊抗鼠/兔IgG二抗，37℃下30分钟，PBS洗3次。滴加三抗辣根过氧化酶标记链霉素卵 蛋白试剂，37℃下30分钟，PBS洗4次。DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1ml蒸馏 水，想蒸馏水中加试剂盒A、B、C试剂各1滴，混匀后滴加到各切片上，室温显色，镜下控 制反应时间2分钟左右，蒸馏水洗涤。切片经苏木素轻度复染，脱水，二甲苯透明，中性树 胶封片。结果见图5(CD31)阳性表达为浅黄色或棕黄色，阴性表达为蓝色，底色为白色， 主要表达在细胞浆、细胞膜，或间质等。

uPA(尿激酶型纤溶酶原激活物，该实验用于检测肿瘤微转移灶)

对各组小鼠的肺分别依次进行4％多聚甲醛固定、常规乙醇脱水、常规石蜡包埋、切片、 切片常规脱蜡至水。每张切片加1滴3％H₂O₂，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物 酶的活性。继以热修复抗原，PBS冲洗3次。每张切片加1滴稀释的一抗体uPA抗体(中国 碧云天公司)，室温下孵育2小时后，PBS冲洗三次。每张切片加1滴聚合物增强剂，室温 下孵育20分钟后，PBS冲洗三次。每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟 后，PBS冲洗三次。每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺)，显微镜下观察5 分钟，苏木素复染，0.1％HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯 透明，中性树胶封固，晾干后观察。结果见图5(uPA)阳性表达为棕黄色着色，阴性表达为 蓝色，底色为白色。

H&E(苏木素-伊红染色，该实验用于观察组织病理性变化)

对各组小鼠的肺分别依次进行4％多聚甲醛固定、常规乙醇脱水、常规石蜡包埋、切片、 切片常规脱蜡至水。按照H&E试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)说明书操作。

由图3小鼠肿瘤体积变化曲线可见，阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体处理组肿瘤体积 减小，阿霉素和伊曲康唑混合溶液组肿瘤体积轻微增加，生理盐水组肿瘤体积快速增加，说 明阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体对抑制肿瘤组织生长效果最好。

由图4小鼠体重变化曲线可见，生理盐水组和阿霉素和伊曲康唑共载脂质体组小鼠体重 变化不大，阿霉素和伊曲康唑混合溶液组体重大幅度减小，说明本发明所述阿霉素和伊曲康 唑共载纳米脂质体毒副作用更小。

图5组织切片染色和免疫组化结果图可见，三个治疗组中，虽然阿霉素和伊曲康唑共载 纳米脂质体组用药量比混合液组更少，但是共载纳米脂质体组肿瘤组织凋亡细胞最多 (TUNNEL)，血管新生最少(CD31)，肺部肿瘤微转移灶最少(uPA)，以及心脏损伤程度最 轻(H&E)。说明本发明所述阿霉素和伊曲康唑共载纳米脂质体具有更好的肿瘤治疗效果以及 抗肿瘤转移效果，而且对正常组织毒副作用很小。