靶向肝癌细胞和肝癌干细胞的共载盐霉素钠和阿霉素纳米脂质体的体内外研究

摘要

从全球范围来看，中国是世界上肝癌发病率最高的国家。目前肝癌的治疗手段主要有手术治疗、放射治疗和化学药物治疗等，就目前肝癌的治疗情况而言，化学药物治疗肝癌是肝癌治疗的重要手段之一。目前肝癌难以治愈的原因之一为肝癌细胞对抗肝癌药物的耐药性，使得肝癌细胞不能被全部消灭，而导致肝癌的复发、转移;另一原因为新近提出的“肿瘤干细胞学说”，普通的抗肝癌药物只能有效杀伤肝癌细胞，而对肝癌干细胞具有耐药性，导致肝癌干细胞比例在肝癌组织中的比例上升，极易诱发肝癌的复发与转移。
　　针对上述问题提出两种方案:1、利用抗肿瘤药物的联用治疗肝癌，增大抗肿瘤范围，增强肝癌的治愈效果;2、利用抗肝癌干细胞药物杀伤肝癌干细胞，有效防止肝癌的复发和转移。结合两种方案，本课题选择传统的抗肝癌药物与抗肝癌干细胞药物联用治疗肝癌，能够分别选择性作用于肝癌细胞和肝癌干细胞，实现同时杀伤，以期达到肝癌根治的效果。
　　盐霉素(SAL)是一种环醚类的离子载体抗生素，可以选择性作用于多种肿瘤干细胞，包括肝癌干细胞，据报道盐霉素钠(SAL-Na)也具有相似效果。阿霉素(DOX)是治疗肝癌的一种常用化疗药物。本课题将利用纳米脂质体作为药物载体包载抗肝癌干细胞药物SAL-Na和抗肝癌药物DOX，靶向递送至肝肿瘤部位，以达到肝癌的有效治疗的同时降低药物对机体正常组织的毒副作用。
　　成功建立SAL-Na和DOX的HPLC体外含量测定方法学。SAL-Na的线性方程为:A=419.4C-226.7(r2=0.9994)，线性范围为:7.8～1000μg/mL。DOX的线性方程为:A=13814C+192.8(r2=0.9997)，线性范围为:0.19～50μg/mL。经考察，SAL-Na与DOX方法学中药物的线性相关性、特异性、日内精密度、日间精密度、回收率、稳定性等方法学参数均符合药物的含量测定要求。为下一步载药纳米脂质体的包封率、载药量测定及体外释放度的考察奠定了方法学基础。
　　选择四株肝癌细胞系为模型细胞，熟练掌握细胞的培养、传代、冻存和复苏等基本细胞实验的操作，利用无血清悬浮培养技术，从中筛选出HepG2微球体(HepG2-TS)作为肝癌干细胞。通过不同代HepG2-TS的成球率、致瘤能力（肿瘤干细胞鉴定的金标准）、肝癌干细胞表型标记抗体-CD133的表达情况对HepG2-TS作为肝癌干细胞进行了鉴定，结果显示，第3代HepG2-TS的成球率约为肝癌HepG2细胞成球率的2倍，HepG2-TS细胞在裸鼠身上的致瘤能力较肝癌HepG2细胞约强近100倍，HepG2-TS细胞中CD133+的表达率较肝癌HepG2细胞约高5倍。综合上述结果，HepG2-TS可作为肝癌干细胞用于后续实验。通过体外细胞毒性实验，在肝癌细胞系中，SAL-Na对DOX具有增敏作用;SAL-Na与DOX同时作用于肝癌细胞的杀伤效果高于顺序作用的杀伤效果;SAL-Na对HepG2-TS具有选择特异性，而DOX对HepG2-TS具有耐药性，选择性作用于肝癌HepG2细胞;最后，在肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞中筛选出DOX与SAL-Na协同比例为摩尔比1∶1，1∶5。
　　采用薄膜分散法，成功制备空白纳米脂质体、载盐霉素钠纳米脂质体(SLN)、载阿霉素纳米脂质体(DLN)及按协同比例共载盐霉素钠与阿霉素的纳米脂质体(SDLN)，并优化纳米脂质体的处方，选择HSPC∶CHOL∶DSPE-PEG-2k=85∶10∶5（摩尔比）作为纳米脂质体的优选处方。通过动态光粒径仪、透射电子显微镜(TEM)对纳米脂质体的表观结构、粒径、Zeta电位进行了表征，结果显示，成功制备了分布均匀、粒径在100 nm附近、Zeta电位在-35 mV附近、具有明显脂质双分子层结构的纳米脂质体。依据SAL-Na与DOX在释放介质中的稳定性，分别对载药脂质体的体外释放情况进行了考察，结果显示SDLN、DLN、SLN在72h内均具有一定程度的缓释效果。
　　以DOX作为荧光探针，比较了肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞对载药纳米脂质体与游离药物的摄取情况。结果显示，肝癌HepG2细胞和HepG2-TS对载药纳米脂质体的摄取能力均高于对游离药物的摄取能力，说明纳米脂质体对肝癌细胞和肝癌干细胞具有靶向性。通过细胞毒性实验，考察、比较了空白纳米脂质体载体、载药纳米脂质体与游离药物单用及联用对肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞的细胞毒性。结果显示，空白纳米脂质体对肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞均无明显细胞毒性;载药纳米脂质体可保持游离药物对肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞的细胞毒性;SLN-DLN、SDLN可保持F-SAL-Na-DOX对肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞的细胞毒性，说明SDLN-DLN、SDLN可同时作用于肝癌细胞和肝癌干细胞且具有较强的杀伤作用。
　　分别采用HPLC-MS与HPLC分析了SDLN、SLN-DLN及F-SAL-Na-DOX三组处方在SD大鼠体内SAL-Na、DOX的药代动力学特征。结果显示，SAL-Na与DOX缓释效果最优的均为SLN-DLN组，而SDLN组更好的保持了DOX与SAL-Na的包载比例。成功建立HepG2肝癌裸鼠模型，考察了PBS组、Blank liposomes组、F-SAL-Na组、SLN组、F-DOX组、DLN组、F-SAL-Na-DOX组、SLN-DLN组以及SDLN组的体内抗肿瘤活性与系统毒性。结果显示，空白纳米脂质对裸鼠没有明显毒性;其中抗肿瘤活性最佳的为SLN-DLN组与SDLN组且没有明显的系统毒性，抑瘤率分别为76.46±5.49、71.55±5.26％。最后，通过对离体肿瘤进行无血清悬浮培养HepG2-TS，考察了各处方的体内抗肝癌干细胞活性。结果显示，SLN-DLN组与SDLN组均可显著的抑制HepG2-TS的数量及体积，说明SLN-DLN组与SDLN组对肝癌干细胞具有很强的抑制作用。
　　综上所述，SLN-DLN联用与SDLN可以同时作用于肝癌细胞和肝癌干细胞，其抗肝癌活性最优，以协同比例共载两种药物的SDLN可以作为肝癌治疗的有效手段为临床治疗提供新的选择。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 研究背景

第二章 盐霉素钠和阿霉素体外分析方法的建立及稳定性考察

引言

一、仪器与材料

(一)仪器

(二)材料

二、方法与结果

(一)SAL-Na体外HPLC分析方法的建立

(二)DOX体外HPLC分析方法的建立

三、小结与讨论

第三章 体外细胞学实验筛选游离盐霉素钠与阿霉素对肝癌细胞和肝癌干细胞的协同作用比例

引言

一、仪器与材料

(一)仪器

(二)材料

(三)细胞株

(四)实验动物

二、方法与结果

(一)肝癌细胞的培养与肝癌干细胞的培养、鉴定

(二)游离盐霉素钠和阿霉素对肝癌细胞和肝癌干细胞的细胞毒性

(三)筛选游离盐霉素钠和阿霉素在HepG2细胞及HepG2-TS细胞中的协同比例

三、小结与讨论

第四章 载药纳米脂质体的制备及表征

引言

一、仪器与材料

(一)仪器

(二)材料

二、方法与结果

(一)薄膜分散法制备共载盐霉素钠和阿霉素的纳米脂质体

(二)纳米脂质体处方的优化

(三)纳米脂质体的表征

(四)载药纳米脂质体的体外释放行为

三、小结与讨论

第五章 载药纳米脂质体的体外抗肿瘤活性研究

引言

一、仪器与材料

(一)仪器

(二)材料

(三)细胞株

二、方法与结果

(一)流式细胞仪验证肝癌HepG2细胞对纳米脂质体的摄取

(二)激光共聚焦显微镜验证肝癌细胞和肝癌干细胞对纳米脂质体的摄取

(三)载药纳米脂质体对肝癌HepG2细胞和HepG2-TS细胞的细胞毒性

三、小结与讨论

第六章 载药纳米脂质体的体内药代动力学研究和体内抗肿瘤活性研究

引言

一、仪器与材料

(一)仪器

(二)材料

(三)细胞株

(四)实验动物

二、方法与结果

(一)盐霉素钠和阿霉素在大鼠体内的药代动力学研究

(二)体内抗肝癌活性研究

(三)体内抗肝癌干细胞活性研究

三、小结与讨论

全文总结

参考文献

脂质体联合给药在肿瘤治疗中的应用研究(综述)

硕士期间发表的论文

致谢