安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法

摘要

本发明公开了一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，包括如下步骤：(1)选择对照动物模型；(2)样品采集；(3)耳组织DNA提取；(4)PCR扩增TLR4目的片段；(5)SSCP分析；(6)PCR扩增产物双向测序；(7)群体遗传学特性分析；(8)血清免疫指标的测定；(9)采用数学模型分析所检测到的TLR4基因遗传变异与血清免疫指标的关联性，并分析品种间血清免疫指标的差异性。旨在寻找与安徽地方猪种抗病性状相关的有效遗传标记，为安徽地方猪种质资源特性及抗病育种研究提供分子生物学参考。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记 的筛选方法。

背景技术

随着社会经济的发展，我国生猪养殖规模化程度越来越高，各种疾病的预防和控制变得 更加重要和严峻。多种疾病给生猪养殖业的发展带来严重危害，造成经济损失，且从遗传育 种的角度衡量，也严重影响了猪种一些重要经济性状的遗传改良。因此提高猪群的一般抗病 力，可有助于降低生产成本，更有利于减少药物残留，提高猪肉产品质量、公共卫生安全及 动物福利等。研究发现，一些猪病的发病机制是和猪本身的遗传背景相关的，因此应用遗传 学方法，从遗传基础上提高猪对疾病的抗性具有治本的功效。以分子标记辅助选择(MAS) 和候选基因分析为标志的分子育种技术，使猪抗病育种研究成为可能。分子抗病育种主要是 借助MAS来提高选择的准确性，因此，寻找合适的分子标记和候选基因是关键。

TLR4是TLRs家族重要成员，是细菌脂多糖或脂质A识别的主要受体，能识别多种革兰 氏阴性病原菌、衣原体、螺旋体和病毒等病原微生物，触发激活特殊的信号途径，启动和调 节机体的免疫反应，其受体基因的遗传差异可造成机体对多种病原体抵抗力不一。猪TLR4 基因编码区全长2526bp，编码由841个氨基酸残基组成的多肽，由3个外显子组成，其中外 显子3最长，含有2265bp，外显子1和2长度分别为216和167bp。自其被克隆、测序以来， 研究者们就把猪TLR4作为疾病抗性的重要候选基因，研究其在呼吸系统、肠道系统疾病以 及天然免疫反应中的作用。邱小田等将猪TLR4基因定位在SSC1q2.9-q2.13，并表明TLR4 mRNA在心、肝、脾、肺、肾各种组织中均有表达且在肺中的表达量最高，认为TLR4在肺 中的高表达与猪肺部疾病有关。包文斌等研究表明TLR4基因表达量的下调与F18大肠杆菌 抗性具有一定关系。Yang等在PK-15细胞内确定了猪TLR4基因g.1605G＞T变异导致 TLR4向下游传递信号的能力显著降低(P＜0.01)。鉴于TLR4基因在动物机体免疫应答中的 重要性，对其多态性和遗传效应进行系统分析具有重要的理论和实践意义。

断奶仔猪腹泻以及水肿病是当今规模化猪场养殖中一种常见的疾病。在仔猪的饲养管理 过程中，断奶是一个极其重要的环节。仔猪断奶后，由于断奶应激，仔猪自身消化系统尚未 发育完全，再加上来自母体的抗体来源终止等外界不良因素的影响，常常易导致仔猪断奶后 发生腹泻(Post-weaningdiarrhea，PWD)和水肿病(Oedemadisease，OD)，其中F18大肠杆菌是最 主要的致病源。至今为止，对于致病性大肠杆菌造成的危害，仍没有有效的预防措施和治疗 方法，给养猪业带来巨大的经济损失。

本发明所述研究以安徽三个本地品种(圩猪、皖南黑猪及安庆六白猪)和一个外来品种 大白猪为试验对象，检测在该四个群体中TLR4基因的遗传变异。通过测定在易感染F18大 肠杆菌的断奶培育时期仔猪的血清免疫指标，进行品种间的差异分析、以及基因型间的关联 性分析，探讨断奶仔猪血清免疫指标在不同品种间的差异以及TLR4基因多态性对不同种群 断奶仔猪血清免疫指标的遗传效应。旨在寻找与安徽地方猪种断奶仔猪抗病力相关的候选有 效遗传标记，为安徽省地方猪种种质资源特性及抗病育种研究提供分子生物学参考。

发明内容

本发明提供了一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，本发明方法 具有检测效果理想、成本低、操作简便的优点。

一种安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，包括如下步骤：

(1)对照动物模型的选择：选择安徽省地方猪种圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪与外来猪 种大白猪28日龄断奶的仔猪为研究免疫指标品种差异的对照动物模型；

(2)样品采集：仔猪35日龄时，采集耳样组织并空腹采血；

(3)耳样组织DNA提取；

(4)PCR扩增Toll样受体4即TLR4基因目的片段；

(5)目的片段单链构象多态性即SSCP分析；

(6)PCR扩增产物双向测序；

(7)群体遗传学特性分析；

(8)仔猪血清免疫指标的测定；

(9)采用数学模型分析所检测到的TLR4基因的遗传变异与血清免疫指标的关联性，并 分析品种间血清免疫指标的差异性；

根据TLR4基因单核苷酸多态性即singlenucleotidepolymorphism：SNP与免疫指标的关 联性分析，探讨所检测到的SNP位点对不同猪群断奶仔猪抗病性的指标是否有影响，从而判 定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗病育种的候选有效标记位点。

本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (1)中所述对照动物模型的选择为：35日龄的圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪及大白猪28日 龄断奶仔猪分别选择100、105、92、132头，其中圩猪采自广德安徽安泰农业开发有限公司， 皖南黑猪采自绩溪安徽丰润生态农业开发有限公司，安庆六白猪采自望江安徽现代良种养殖 有限公司，大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司。

本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (2)中耳样组织采集过程为：提前在1.5mL的Eppendorf管中注入70％体积分数浓度的酒精， 然后每头猪采耳组织块1.5g，装入所述Eppendorf管中，于-20℃保存备用。

本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (3)中耳样组织DNA提取过程为：①用眼科剪剪取0.2g耳组织，去除其表面毛发及酒精， 装入1.5mLEppendorf管中，并尽可能将耳组织剪碎；②DNA的提取采用北京全式金生物科 技有限公司的组织DNA提取试剂盒提取；③将得到的DNA调终浓度至100ng/μL，放在2-8 摄氏度保存；④DNA纯度检测：取1μLDNA在SMA1000上测定OD260/OD280的比值，当 OD260/OD280比值在1.8-2.0之间说明所提DNA纯度较高；⑤质量检测：将所提DNA用1.5％ 琼脂糖凝胶电泳检测，观察提取产物的质量以便进行后续实验。

本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (4)中PCR扩增目的片段的过程为：以步骤(3)获得的耳组织样DNA为模板，根据GenBank 猪TLR4基因外显子3序列，其登录号为AY753179，采用PrimerPremier5.0软件设计2对 引物，进行TLR4基因外显子3部分序列的克隆，并采用2％琼脂糖凝胶电泳检测克隆产物是 否为目的片段；其中引物TLR4exon3-1的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1和SEQID NO：2所示，引物TLR4exon3-2的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示， 退火温度及目的片段长度见表1。

本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (5)中目的片段单链构象多态性的过程为：先将所述TLR4-exon3-1、TLR4-exon3-2引物对 的PCR扩增产物分别进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后分别进行硝酸银染色后用凝胶成 像系统观察电泳结果得到所述断奶仔猪TAP1基因单链构象多态性；

其中，所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具体包括如下步骤：

(A)清洗制胶所用的玻璃板、夹子、软绳、样品梳等用具，晾干；

(B)制板：将干净且干燥的底板磨面朝上，磨砂玻璃边的圆头朝下，用软绳封住玻璃 板的三面，夹子夹紧；

(C)配制10％的聚丙烯酰胺凝胶72mL，双蒸水42mL，30％的PAGE24mL，10×TBE 6mL，TEMED50μL，AP330μL，混匀后快速灌胶；

(D)将胶灌至玻璃板的边缘处后，插入梳子，此时注意检查胶中是否有气泡，在室温 下放置，待胶聚合后使用；

(E)凝胶聚合好后，向电泳槽中加入1×TBE，去下夹子、软绳及梳子，将玻璃板固定 于电泳槽上，并用注射器冲洗加样孔；

(F)300V电压下预电泳30min；

(G)取3μLPCR扩增产物至96孔PCR板中，加入7μL上样缓冲液，用枪吹打混匀后， 用透明胶带封口；

(H)98℃变性10min，然后迅速冰浴10min，然后点样；

(I)240V电压电泳1h，150V电压电泳12h；

其中，所述硝酸银染色具体包括如下步骤：

(a)电泳完成后，取下玻璃板，小心取出凝胶并做好标记，用双蒸水漂洗2遍；

(b)倒入固定液，所述固定液为含10％体积分数乙醇和0.5％体积分数乙酸的双蒸水溶 液，轻微振荡5min，回收固定液；

(c)倒入2％质量分数的硝酸银溶液避光轻微振荡15min，回收硝酸银溶液；

(d)用蒸馏水漂洗2遍后，倒入显色液，所述显色液为含3％体积分数NaOH和0.1％体 积分数HCHO的双蒸水溶液，振荡进行显色反应，至条带清晰为止；

(e)蒸馏水漂洗，在凝胶成像系统中观察电泳结果。

本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (6)中PCR扩增产物双向测序的过程为：根据单链构象多态性结果，挑选不同带型的样本， 每种带型挑选3个样本，PCR扩增50μL体系送至上海生工有限公司进行双向测序，测序结 果用DNAStar或DNAMan，Chromas软件分析。

本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤(7) 中群体遗传学特性分析过程为：采用popgene软件对步骤(5)、(6)检测到的SNPs位点进行 群体遗传学分析，包括等位基因频率、基因型频率、纯合度、杂合度、有效等位基因数、多 态信息含量的计算，并用卡方检验来判断群体中基因型的分布是否处于Hardy-Weinberg平衡、 采用popgene软件进行χ2适合性检验计算。

本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (8)中仔猪血清免疫指标的测定过程为：35日龄断奶仔猪空腹前腔静脉采血，常规分离血 清，使用猪ELISA试剂盒测定免疫指标，在酶标仪450nm处测质量浓度分别为1000pg/ml、 500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.6pg/ml共7个浓度的标准品 的吸光度，绘制出标准曲线，测定首检样本的浓度；进而依照相对应的标准品的标准曲线， 依次计算血清中IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α的浓度。

本发明所述的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法，其中，所述步骤 (9)中采用的数学分析模型为：①品种间血清免疫指标的差异性分析采用SPSS19.0统计软 件One-wayANOVA程序进行方差分析和显著性检验，试验所得数据均以“平均数+SD”表 示；②不同基因型对各免疫指标的效应差异分析采用的数学模型为：Y_ij＝μ+B_i+G_j+e_ij；其中， Y_ij为免疫指标表型值；μ为群体均值；Bi表示断奶仔猪的断奶批次效应；G_j表示第j种基因型 效应；e_ij表示随机误差；采用SPSS19.0统计软件GLM程序对本试验所检测到的遗传变异与 血清免疫指标的关联性进行分析。

本发明安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法与现有技术相比具有如下 有点：

本发明所述方法以安徽省三个本地猪种(圩猪、安庆六白猪、皖南黑猪)和一个外来猪 种大白猪为试验对象，利用克隆、测序的方法检测在该四个群体TLR4基因外显子3序列区 的遗传变异。通过测定易感染F18大肠杆菌的断奶培育时期仔猪的血清免疫指标(血清IL-6、 IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α含量)，进行品种间的差异分析、以及基因型间的关联性分析， 探讨断奶仔猪血清免疫指标在不同品种间的差异以及TLR4基因多态性对不同种群断奶仔猪 血清免疫指标的遗传效应。探讨分析所检测到的TLR4基因多态性位点对不同猪群断奶仔猪 抗病力是否有影响，从而判定所检测到的SNP位点能否作为仔猪抗病育种的候选遗传标记。 从而可为安徽省地方猪种种质资源特性及抗病育种研究提供分子生物学参考。本发明所述方 法具有检测效果理想、成本低、操作简便的优点。

下面结合附图对本发明的安徽地方猪种断奶仔猪抗病力候选遗传标记的筛选方法作进一 步说明。

附图说明

图1为本发明中猪耳组织基因组DNA质量检测结果图；

图2为本发明中猪TLR4基因exon3-1引物对的PCR扩增结果图；

图3为本发明猪TLR4基因exon3-2引物对的PCR扩增结果图；

图4为本发明中猪TLR4基因exon3-1引物PCR扩增产物的SSCP检测图；其中，泳道1、 2、3、4、5、8、9为EE基因型，泳道6、7、10为EF型；

图5为本发明中猪TLR4基因exon3-2引物PCR扩增产物的SSCP检测图；其中，泳道1、 2、3、4为CC基因型，泳道5、6、7为CA型，泳道8、9、10为AA型；

图6为本发明中猪TLR4基因exon3-1引物PCR扩增片段测序结果对比图；其中，(a)图 为417位点EE基因型测序图，(b)图为417位点EF基因型测序图；(c)图为318位点EE基因 型测序图(反向测序)，(d)图318位点为EF基因型测序图(反向测序)；

图7为本发明中猪TLR4基因exon3-2引物PCR扩增片段测序结果对比图(反向测序)；其 中，(a)图为CC基因型测序图，(b)图为CA基因型测序图，(c)图为AA基因型测序图；

具体实施方式

一、猪TLR4基因外显子3序列区单核苷酸多态性分析

1、试验材料

试验动物：

试验动物中100头圩猪采自广德安徽安泰农业开发有限公司，105头皖南黑猪采自绩溪 安徽丰润生态农业开发有限公司，92头安庆六白猪采自望江安徽现代良种养殖有限公司，132 头大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司，所有采样猪只为35日龄断奶仔猪。用耳号钳 夹取一小块耳组织(约1.5g)，放置于装有1mL70％(体积分数)乙醇的1.5mLEppendorf管 中，低温保存带回实验室，-20℃保存备用。酚/氯仿法提取耳样组织DNA，超纯水溶解，超 微量紫外分光光度计测浓度和纯度，置4℃备用或-20℃保存。

主要仪器：

(1)PCR仪：美国ABI公司

(2)pH测定仪：意大利HANNA公司

(3)电子天平：美国奥豪斯公司

(4)电泳槽：北京六一仪器厂

(5)恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司

(6)高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂

(7)气浴恒温振荡器：江苏金坛市金城国胜实验仪器厂

(8)微量冷冻离心机：美国BeckmanCoulter公司

(9)白度色度计：北京辰泰克仪器有限公司

(10)电子数显卡尺：成都成量工具集团有限公司

(11)鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司

(12)稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂

(13)MiniStar微型迷你离心机：美国Tomos公司

(14)紫外分光光度计：北京美林恒通科技有限公司

(15)全自动凝胶成像分析仪：上海培清科技有限公司

主要试剂：

GoldenDNAPolymerase、2xReactionMix购自天根生化科技有限公司；琼脂糖购自西班 牙YITOBio-instrumentCompany；DNAMarker购自大连宝生物工程有限公司；蛋白酶K购 自北京艾德莱生物科技有限公司；10×LoadingBuffer购自北京全式金生物科技有限公司；亚 甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺、TEMED购自Sigma公司；引物、氯仿、Tris饱和酚、EDTA、 SDS、溴酚蓝、异戊醇、无水乙醇、二甲苯氰、甘油、醋酸钠、NaCl、KCl、NaOH、Na₂HPO₄、 KH₂PO₄、冰乙酸、、硝酸银、去离子甲酰胺、甲醛、柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖等购自上海 生工有限公司。

主要试剂配制：

(1)组织裂解液

在200mLddH2O中加入0.605gTris-base，调pH值到8.0，加入18.61gNa₂EDTA.2H2O， 溶解后加入2.5gSDS，定容至200mL，高压灭菌备用。

(2)20mg/mL蛋白酶K

将瓶装100mg的蛋白酶K溶于5mL灭菌超纯水中，分装于高压灭菌的离心管中(1mL/ 管)，-20℃保存备用。

(3)6x上样缓冲液

0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯氰，30％甘油水溶液。

(4)溴化乙锭(EB)

取EB10g完全溶解100mL水中，避光保存。

(5)0.5MEDTA

称取46.5gEDTA-Na溶于200mL超纯水，用NaOH调pH至8.0，定容至250mL。

(6)10xTBE

取108Tris碱，55g硼酸，量取40mL0.5MEDTA，超纯水定容至1000mL。

(7)30％丙烯酰胺

取72.5g丙烯酰胺，2.5g甲叉，超纯水定容至250mL，过滤，4℃保存备用。

(8)10％过硫酸铵

1g过硫酸铵溶于10mL的蒸馏水中，4℃保存备用。

(9)0.2％AgNO3

2gAgNO3溶于1000mLddH2O中。

(10)3％NaOH(显色液)

15gNaOH溶于500mLddH2O，加入甲醛1.0mL。

(11)固定液

100mL乙醇，加5mL乙酸，加水定容至1000mL。

试验方法

DNA提取

(1)剪取0.2g左右耳组织样，放入1.5mLEP管中，剪至糜烂，加入组织裂解液，55℃ 放置3h；

(2)加入5uL蛋白酶K(20ug/uL)，55℃消化过夜；

(3)加0.6mL饱和酚充分混匀，放置后分层，则继续颠倒混匀，直至形成悬浊液；

(4)12000rpm离心10min；

(5)吸取上层清澈的DNA溶液至另一个干净的离心管中(1.5mL)；

(6)加入600uL酚-氯仿-异戊醇溶液(25∶24∶1)，颠倒混匀直至形成悬浮液；

(7)12000rpm离心10min；

(8)吸取上层清澈的DNA溶液至另一个干净的离心管中(1.5mL)；

(9)重复步骤6、7、8；

(10)加入0.6mL氯仿-异戊醇(24∶1)溶液，充分混匀30min；

(11)12000rpm离心10min，吸取上层清澈的DNA溶液至另一个干净的离心管中 (1.5mL)，加入1mL冰无水乙醇(2倍体积)，充分混匀，离心管中出现絮状漂浮物，即DNA；

(12)12000rpm离心10min，将絮状悬浮物吸至另一个干净的离心管中(1.5mL)；

(13)加入0.5-1mL70％乙醇(提前放入-20℃)，10min后，吸出乙醇，再加70％乙醇， 反复冲洗2-3次；

(14)室温过夜干燥DNA样品，至无乙醇气味；

(15)加入150-300uLTE/ddH2O过夜，或65℃水浴2h，使DNA溶解；

(16)调终浓度至100ng/uL；

(17)4℃或-20℃长期保存。

DNA浓度和纯度检测

(1)取1μL的DNA在SMA1000上测定OD260/OD280之间的比值，比值在1.8-2.0之 间，说明所提DNA纯度较高；

(2)用1.5％的琼脂糖凝胶电泳法检测DNA条带，观察提取产物的质量，进行后续实验。 软件分析工具

DNA数据库：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/。

引物设计软件：Primer5.0，斯坦福在线设计软件。

序列分析软件：DNAStar，DNAMan，Chromas。

统计分析软件：SPSS19.0。

引物设计

根据GenBank猪TLR4基因(登录号为AY753179)外显子3序列，采用PrimerPremier5.0 软件设计引物，送交上海生工生物技术有限公司合成。

其中引物TLR4exon3-1的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，引 物TLR4exon3-2的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，退火温度及目 的片段长度见表1。

表1猪TLR4基因引物序列

新合成的引物是固体状粉末，在溶解前先离心1min，沉淀到管底后，按稀释比例加入对 应体积的灭菌ddH₂O稀释到10μg/μL，充分混匀，4℃保存。

PCR反应体系

PCR反应体系见表2。

表2PCR反应体系

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，Tm℃(退火温度依引物而定)复性 30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸8min，4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳检测

取3μLPCR扩增产物与2μL6×LoadingBuffer混匀，用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测(电 压6V/cm)，在凝胶成像仪下观察PCR扩增的结果、拍照。将扩增条带与Marker条带比较， 判断PCR扩增产物是否为目的片段。若扩增条带为目的片段，且为单一条带，亮度较好，则 -20℃保存PCR扩增产物，以便进行下一步试验。

单链构象多态性检测(SSCP)

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)清洗试验所需要的器械，包括玻璃板、样品梳和绳子等，并晾干，挑选一个干净、 平滑的桌面制板备用。

(2)配制72mL10％聚丙烯酰胺凝胶(24mL30％的PAGE，42mL的双蒸水，10×TBE6mL， AP：330μL，TEMED：50μL)，混匀后快速灌胶，后插入梳子(注意检查是否有气泡，如有 应排除)，放置几个小时让其自然凝固(可放入烘箱中加快凝固)。

(3)将凝好胶的板固定好后，向电泳槽中加入1×TBE，300V电压预电泳30min。

(4)在96孔PCR板每孔中先加入7μL变性剂，后加入3μLPCR产物，用枪吹打混匀 后，透明胶密封口；

(5)98℃变性10min后，迅速冰浴冷却10min，然后点样。

(6)240V电压20min，120V电压过夜14-16h。

硝酸银染色

(1)电泳结束，取下玻璃板，切胶并做好标记，清水洗3遍。

(2)固定液(10％乙醇和0.5％乙酸)震荡3-5min，回收。

(3)倒入2％AgNO3溶液，避光轻摇10-15min，回收。

(4)蒸馏水洗1-2遍。

(5)现配显色液(3％NaOH，0.1％HCHO)，润洗后显色至条带出现为止。

(6)蒸馏水漂洗，在凝胶成像系统观察电泳结果，拍照保存。

PCR产物序列测定

根据SSCP结果，挑选不同带型的样本，每种带型选3个样本，PCR扩增50μL体系送至 上海生工有限公司进行双向测序，测序结果用DNAStar或DNAMan，Chromas分析。

群体遗传学分析

SSCP结果表明呈现共显性遗传，表型反应基因型，直接计算等位基因频率和基因型频率。

基因频率是指群体中某一基因数占其同一基因座基因总数的比率。其计算公式为：

Pi＝[2(ii)+(ij1)+(ij2)+…+(ijn-1)+(ijn)]/2n

式中，Pi：第i个等位基因的频率；ii：i个等位基因纯合个体数；iin：含有i等位基因的 杂合个体数；n：为一个群体内个体的总数。

基因型频率＝基因型个体数/测定群体总数×100％

遗传多样性分析

(1)纯合度(homozygosity，Ho)：指某一群体中特定标记位点上等位基因纯合的程度， 反映群体遗传的一致性。

$H_0=\stackrel{n}{\Sigma }{p}_i^2$

式中，Ho为某一位点的纯合度，Pi为第i个等位基因的频率，n为某一位点的等位基因 数。

(2)杂合度(heterozygosity，He)：与纯合度相对，杂合度高表明群体中基因一致性较 差，群体的遗传变异较大，多态性丰富。

$\mathrm{He}=1-H_0=1-\stackrel{n}{\Sigma }{p}_i^2$

式中，He：某一位点的杂合度，Pi：某一位点上第i个等位基因频率，n：某一位点的等 位基因数，Ho：遗传纯合度；

(3)有效等位基因数(effectivenumberofalleles，Ne)：纯合度的倒数，反映等位基因 之间的相互影响，是衡量基因纯合度的一个指标。等位基因在群体中分布的越均匀，有效等 位基因数越接近实际检测到的等位基因绝对数。

Ne＝1/Ho＝1/∑Pi2

式中，Ne：某一位点的有效等位基因数，Pi：某一位点上第i个等位基因频率，Ho：遗 传纯合度；

(4)多态信息含量(polymorphisminformationcontent，PIC)：对标记基因的多态性进行 估计。PIC＞0.5高度多态，0.5＞PIC＞0.25中度多态，PIC＜0.25低度多态。

$\mathrm{PIC}=1-\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}{p}_i^2-\underset{i=1}{\overset{n-1}{\Sigma }}\underset{j=i+1}{\overset{n}{\Sigma }}2p_i^2{p}_j^2$

式中，n：等位基因数目；Pi和Pi：分别为第i和第i个等位基因在群体中的频率。PIC 值用于对标记基因多态性的估计，PIC＞0.5为高度多态，PIC＜0.25为低度多态，0.25＜PIC＜0.5 为中度多态。

群体遗传结构分析

(1)哈代-温伯格定律平衡检测：当群体处于Hardy-Weinberg平衡状态时，一对等位基 因的基因频率与基因型频率的关系有：D＝p2，H＝2pq，R＝q2，其中，D、H、R为基因型频 率，而p、q为基因频率，并有p+q＝1。

(2)卡方检验公式：χ2＝∑(Oi-Ei)2/Ei

其中，Oi为观察值，Ei为理论值。因为本研究资料的自由度df＝1，当基因型理论值小于 5时，可采用矫正公式：

$x^2=\underset{i}{\overset{n}{\Sigma }}\frac{{\left(\right|O_i-E_i|-0.5)}^2}{E_i}$

结果与分析

猪耳组织DNA检测

提取后的DNA经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1。由图1可知，本实验 提取的DNA样品质量良好，能够满足实验的要求。同时取1μLDNA提取样于SMA1000上 测定OD260/OD280，比值位于1.8-2.0，所提DNA纯度较高，可进行后续实验。

PCR扩增结果

PCR扩增TLR4基因外显子3部分序列，产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测(见图2-图3)。 如图2所示，TLR4-exon3-1引物对扩增片段为283bp，如图3所示，TLR4-exon3-2引物对扩 增片段为209bp，PCR扩增产物符合预期扩增片段的大小，如图所示，特异性良好且无非特 异性条带，可用于后续试验。

PCR-SSCP检测结果

引物对TLR4-exon3-1PCR-SSCP检测显示，TLR4-exon3-1扩增片段内有2个连锁的SNP 位点，存在2种带型，分别命名为EE和EF基因型(图4)；引物对TLR4-exon3-2PCR-SSCP 检测发现，TLR4-exon3-2扩增片段内有1个SNP位点，该位点存在3种基因型：CC、CA和 AA基因型(图5)。

TLR4基因外显子3扩增片段序列分析结果

取引物TLR4-exon3-1、TLR4-exon3-2不同带型个体的PCR产物进行测序，并将测序结 果与猪TLR4基因DNA序列(NCBI登录号为AY753179)进行比对。

结果发现：(1)TLR4-exon3-1扩增片段测序结果为：在TLR4基因第318位碱基处存在 C→A(测序结果见图6-c、图6-d，反向测序)、417位碱基处存在G→A(测序结果见图6-a、 图6-b)的连锁基因突变，定义EE(CC/GG)为野生型，EF(CA/GA)为杂合子型，318、417位 点突变均未引起氨基酸改变，其编码的氨基酸相应分别为Thr106Thr，Ala139Ala。(2) TLR4-exon3-2扩增片段测序结果为：在TLR4基因第1027位碱基处发现1个C→A的有义突 变，定义CC为野生型，CA为杂合子型，AA为突变型(测序结果见图7-a、图7-b、图7-c， 反向测序)，1027位点突变引起氨基酸从Gln变为Lys。

TLR4基因C318A/G417A、C1027A位点基因型频率和基因频率分析

通过对4个品种429头猪TLR4基因C318A/G417A、C1027A突变位点进行检测，统计 其基因频率和基因型频率，结果如表3、表4所示。C1027A突变位点在四个品种中均检测到， 在皖南黑猪和霍寿黑猪群体中各基因型频率趋势为CA＞AA＞CC，A等位基因为优势基因，而 在大白猪、圩猪群体中结果相反，基因型频率CC＞CA＞AA，C等位基因为优势基因。 C318A/G417A位点在皖南黑猪、圩猪、安庆六白猪和大白猪群体中EE基因型频率分别为 79.05％、71.00％、81.08和76.76％，为该4个群体的优势基因型，E等位基因为优势基因。

表3C1027A位点基因频率和基因型频率分析

表4C318A/G417A位点基因频率和基因型频率分析

群体遗传学分析

TLR4基因C318A/G417A位点群体遗传学分析

PIC值是衡量群体内遗传变异程度的指标，由表5可知，C318A/G417A连锁位点在皖南 黑猪、圩猪、安庆六白猪以及大白猪四个群体中的PIC值均小于0.25，处于低度多态；且经 过χ²适合性检验，皖南黑猪、圩猪、安庆六白猪以及大白猪四个群体的χ²值均小于5.991，处 于哈迪-温伯格平衡状态(P＞0.05)。

表5猪TLR4基因C318A/G417A位点在群体中的遗传多态性及χ²检验

注：PIC＞0.5为高度多态，0.25＜PIC＜0.5为中度多态，PIC＜0.25为低度多态，χ²(0.05)＝5.991；下表同。

TLR4基因C1027A位点群体遗传学分析

由表6可以看出，C1027A位点在皖南黑猪、圩猪、安庆六白猪以及大白猪四个群体中的 PIC均大于0.25小于0.5，处于中度多态；且经过χ²适合性检验，皖南黑猪、圩猪、安庆六白 猪以及大白猪四个群体的χ²值均小于5.991，处于哈迪-温伯格平衡状态(P＞0.05)。

表6猪TLR4基因C1027A位点在群体中的遗传多态性及χ²检验

注：同表5注。

本试验对猪TLR4基因的外显子3序列进行的多态性检测，共发现1个单碱基突变、1对 连锁碱基突变。其中C1027A突变位点在四个品种中均检测到，在皖南黑猪和霍寿黑猪群体 中各基因型频率趋势为CA＞AA＞CC，A等位基因为优势基因，而在大白猪、圩猪群体中结果 相反，基因型频率CC＞CA＞AA，C等位基因为优势基因。而C318A/G417A位点在皖南黑猪、 圩猪、安庆六白猪和大白猪群体中优势基因型均为EE基因型，其频率分别为79.05％、71.00％、 81.08和76.76％，E等位基因为优势基因。

四个群体在TLR4基因C1027A和C318A/G417A位点均检测到了碱基突变，符合遗传标 记标准，若今后作为遗传标记，将具有一定的普遍性。C318A位点和G417A位点均为同义突 变，并没有引起氨基酸的改变。尽管如此，但是同义突变的意义不容忽视。当同义突变处于 基因编码区时可能会导致相同氨基酸翻译简并密码子的效率不同，进而影响其转录水平，改 变蛋白质表达水平，影响机体的正常生理功能。此连锁突变是否对疾病的抗性/易感性有影响， 能否作为一个抗病性状的标记，还有待于进一步研究分析。C1027位点引起的氨基酸变异为 错义突变Gln343Lys，该突变引起氨基酸性质改变，使其由不带电的Gln转变为带正电荷的 Lys，电荷量增加，可能会引起结构的变化，从而影响蛋白功能。且相比外来猪种，我国地方 猪种都具有抗病、抗逆性强的特点，TLR4基因C1027A位点多态性分布在中外猪种间的极大 差异，是否与品种抗病性有关，值得进一步研究。

二、TLR4基因多态性与断奶仔猪血清免疫指标的关联性分析

试验材料

试验动物

试验动物中100头圩猪采自广德安徽安泰农业开发有限公司，105头皖南黑猪采自绩溪 安徽丰润生态农业开发有限公司，92头安庆六白猪采自望江安徽浩宇牧业有限公司，132头 大白猪采自肥东安徽安泰农业开发有限公司，所有采样猪只为35日龄断奶仔猪。于＜具体实 施方式＞(一)部分采耳组织同时，每只猪空腹前腔静脉采血，将采集的全血静置冰箱4℃过 夜，然后1000-3000rpm离心10分钟，取血清于-20℃保存备用。

试验设备和器材

(1)酶标仪(450nm检测波长滤光片，570nm或630nm校正波长滤光片)。

(2)洗板机(可调注液量，保证每孔350μl洗液而不溢出)。

(3)超净工作台，生物安全柜，通风柜。

(4)高精度单道加液器(量程为0.5-10ul，2-20μl，20-200μl，200-1000μl)。

(5)高精度多道加液器(8道或12道，量程为50-300μl)

(6)37℃恒温箱。

(7)低温离心机。

(8)电冰箱(4℃，-20℃，-86℃).

(9)分析天平。

(10)剪刀，镊子，钳子等。

(11)漩涡混合仪，低频振荡器等。

试验耗材和试剂

(1)猪IFNγ，IL-10，IL-6，IL-12，TNFα酶联免疫分析试剂盒。

(2)离心管(容量为1.5mL，5mL等)。

(3)一次性吸头(量程为0.5-10μL，2-20μL，20-200μL，200-1000μL).

(4)纯净水或蒸馏水。

(5)坐标纸。

(6)吸水纸。

(7)EDTA，枸橼酸钠，肝素。

试验方法

猪前腔静脉采血，常规分离血清，使用猪ELISA试剂盒测定免疫指标，在酶标仪450nm 处测以下质量浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6pg/mL共7个浓度的标准品的 吸光度(OD值)，绘制出标准曲线，测定首检样本的浓度。

试验原理

本试验采用双抗体夹心ELISA法。所提供的ELISAKit是典型的夹心法酶联免疫吸附测 定试剂盒(ELISA)。预先包被的抗体为抗猪单克隆抗体。检测相抗体为多克隆抗体，经生物 素(biotin)标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随 后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品 中的待测因子呈正相关。

操作步骤(以IL-6为例，IFNγ，IL-10，IL-12，TNFα检测操作步骤同IL-6)

(a)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋 内封存于2-8℃。

(b)预留空白孔(若使用双波长读板，空白孔可以不设)。

(c)分别将样本或不同浓度猪IL-6标准品(0pg/mL孔加标准品稀释液)加入相应孔中 (100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。

(d)提前30分钟制备生物素化猪IL-6抗体工作液。

(e)洗板3次。

(f)加入生物素化猪IL-6抗体工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱 孵育60分钟。

(h)提前30分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置。

(i)洗板3次。

(j)除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱， 避光孵育30分钟。

(k)洗板5次。

(1)加入TMB显色工作液(包括空白孔)100μL/孔，37℃孵箱，避光孵育，当标准曲 线高浓度的颜色较深，有明显的颜色梯度的时候，即可终止。试验显色反应请勿超过30分钟。

(m)加入终止液(包括空白孔)100μL/孔，混匀后即刻测量OD(450nm)值(10分钟 内)。

结果判定及计算

以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样本 的OD值可在标准曲线上查出其浓度。若样本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测， 计算浓度时应乘以稀释倍数。

数学分析模型

品种间血清免疫指标的差异性分析采用SPSS19.0统计软件One-wayANOVA程序进行方 差分析和显著性检验，试验所得数据均以“平均数±SD”表示。

不同基因型对各免疫指标的效应差异分析采用的数学模型为：Y_ij＝μ+B_i+G_j+e_ij；其中，Y_ij为免疫指标表型值；μ为群体均值；B_i表示断奶仔猪的断奶批次效应；G_j表示第j种基因型效 应；e_ij表示随机误差；采用SPSS19.0统计软件GLM程序对本试验所检测到的遗传变异与血 清免疫指标的关联性进行分析。

结果与分析：

各猪种间免疫指标差异性分析

4猪种之间免疫指标水平的差异分析显示(表7)：血清IL-6含量，安庆六白猪极显著高 于圩猪和大白猪(P＜0.01)，皖南黑猪极显著高于大白猪(P＜0.01)；而血清IL-10含量正好相 反，安庆六白猪极显著低于圩猪、皖南黑猪和大白猪(P＜0.01)；血清IL-12含量，圩猪极显 著低于霍寿黑猪、皖南黑猪和大白猪(P＜0.01)；血液IFN-γ含量在4个猪种间的差异均为极 显著；与此同时，血液TNF-α含量在4个猪种间的差异也均为极显著。另外，血清IL-6含量 在安庆六白猪中最高，血清IL-10、IL-12含量在大白猪中最高；血清IFN-γ、TNF-α含量在 圩猪中最高。

表7品种间各免疫指标水平差异单位：pg/mL

注：同列带有不同小写字母肩标表示差异显著(P＜0.05)，带有不同大写字母肩标表示差异极显著(P＜0.01)。

TLR4基因多态性与断奶仔猪血清免疫指标的关联性分析

猪TLR4基因C1027A位点多态性与免疫指标的关联分析

安庆六白猪中C1027A位点多态性与免疫指标的关联分析

由表8可知，本试验安庆六白猪群体内TLR4基因C1027A位点AA基因型个体的血清免 疫指标含量高于CA、CC型个体，其中在血清TNFα、IL-12含量指标上，AA型与CC型个 体的差异均达到极显著水平(P＜0.01)，AA型与CA型个体的差异均达到显著水平(P＜0.05)；血 清IFNγ含量在AA和CC基因型个体间达到显著水平(P＜0.05)。

表8安庆六白猪TLR4基因C1027A位点的关联分析单位：pg/mL

注：同行带有不同小写字母肩标表示差异显著(P＜0.05)，带有不同大写字母肩标表示差异极显著(P＜0.01)。

圩猪中C1027A位点多态性与免疫指标的关联分析

由表9可知，本试验圩猪群体内TLR4基因C1027A位点AA基因型个体的血清免疫指标 含量高于CA、CC型个体，其中在血清IFNγ、IL-6含量指标上，AA型与CA型个体的差异 达到显著水平(P＜0.05)，AA型与CC型个体的差异达到极显著水平(P＜0.01)；血清TNFα含量 指标在AA和CC基因型个体间达到显著水平(P＜0.05)，与CA基因型个体差异不显著。

表9圩猪TLR4基因C1027A位点的关联分析单位：pg/mL

注：同行带有不同小写字母肩标表示差异显著(P＜0.05)，带有不同大写字母肩标表示差异极显著(P＜0.01)。

皖南黑猪中C1027A位点多态性与免疫指标的关联分析

由表10可知，本试验皖南黑猪群体内TLR4基因C1027A位点AA基因型个体的血清免 疫指标含量高于CA、CC型个体，其中在血清TNFα、IL-12含量指标上，AA型与CC型个 体的差异均达到显著水平(P＜0.05)；血清IL-10含量在AA和CC基因型个体间达到极显著水 平(P＜0.01)，在AA和CA基因型个体间达到显著水平(P＜0.05)。

表10皖南黑猪TLR4基因C1027A位点的关联分析单位：pg/mL

注：同行带有不同小写字母肩标表示差异显著(P＜0.05)，带有不同大写字母肩标表示差异极显著(P＜0.01)。

大白猪中C1027A位点多态性与免疫指标的关联分析

由表11可知，本试验大白猪群体内TLR4基因C1027A位点AA基因型个体的血清免疫 指标含量高于CA、CC型个体，其中在血清IFNγ、IL-6含量指标上，AA型与CC型个体的 差异达到极显著水平(P＜0.01)，血清IL-6含量在AA和CA基因型个体间达到显著水平 (P＜0.05)，血清IFNγ含量在AA、CA与CC基因型个体间达到极显著水平(P＜0.01)；血清 IL-10含量指标在AA和CC基因型个体间达到显著水平(P＜0.05)。

表11大白猪TLR4基因C1027A位点的关联分析单位：pg/mL

注：同行带有不同小写字母肩标表示差异显著(P＜0.05)，带有不同大写字母肩标表示差异极显著(P＜0.01)。

猪TLR4基因C318A/G417A位点多态性与免疫指标的关联分析

安庆六白猪中C318A/G417A位点多态性与免疫指标的关联分析

由表12可知，本试验安庆六白猪群体内TLR4基因C318A/G417A位点EE基因型个体的 血清免疫指标含量高于EF型个体，其中在血清IL-10、IL-12含量指标上，EE型与EF型个 体的差异均达到极显著水平(P＜0.01)；血清TNFα含量在EE和EF基因型个体间达到显著水平 (P＜0.05)。

表12安庆六白猪TLR4基因C318A/G417A位点的关联分析单位：pg/ml

注：同列带有不同小写字母肩标表示差异显著(P＜0.05)，带有不同大写字母肩标表示差异极显著(P＜0.01)。

圩猪中C318A/G417A位点多态性与免疫指标的关联分析

由表13可知，本试验圩猪群体内TLR4基因C318A/G417A位点EE基因型个体的血清免 疫指标含量高于EF型个体，其中在血清IFNγ、TNFα含量指标上，EE型与EF型个体的差异 达到显著水平（P＜0.05)。

表12圩猪TLR4基因C318A/G417A位点的关联分析单位：pg/ml

注：同列带有不同小写字母肩标表示差异显著(P＜0.05)，带有不同大写字母肩标表示差异极显著(P＜0.01)。

皖南黑猪C318A/G417A多态位点与各免疫指标显著性分析

由表14可知，本试验皖南黑猪群体内TLR4基因C318A/G417A位点EE基因型个体的血 清免疫指标含量高于EF型个体，其中在血清IL-12、IL-10含量指标上，EE型与EF型个体 的差异均达到显著水平(P＜0.05)；血清TNFα含量在EE和EF基因型个体间达到极显著水平 (P＜0.01)。

表14皖南黑猪TLR4基因C318A/G417A位点的关联分析单位：pg/ml

注：同列带有不同小写字母肩标表示差异显著(P＜0.05)，带有不同大写字母肩标表示差异极显著(P＜0.01)。

大白猪C318A/G417A多态位点与各免疫指标显著性分析

由表15可知，本试验大白猪群体内TLR4基因C318A/G417A位点EE基因型个体的血清 免疫指标含量高于EF型个体，其中在血清IFNγ、IL-10含量指标上，EE型与EF型个体的差 异达到显著水平(P＜0.05)；血清IL-6含量指标在EE和EF基因型个体间达到极显著水平 (P＜0.01)。

表13大白猪TLR4基因C318A/G417A位点的关联分析单位：pg/ml

注：同列带有不同小写字母肩标表示差异显著(P＜0.05)，带有不同大写字母肩标表示差异极显著(P＜0.01)。

本研究选取的五个免疫指标在机体免疫中有着不可忽视的重要性。IL-6作为一种多功能 炎性细胞因子，能够平衡一些细胞因子的损伤效应，从而起到保护作用。白细胞介素-10(IL-10) 是一种能发挥抗炎症作用的细胞因子，可以促进B细胞的分化以及促进抗体的产生，同时抑 制巨噬细胞，并抑制Th1细胞分泌多种细胞因子。辅助性T细胞(helperTcell，Th)包含Th1 和Th2两个亚群，其中前者参与细胞免疫，主要产生IL-2，IFNγ等，而后者主要产生IL-10 等，辅助B细胞产生抗体，并参与体液免疫。IL-12的作用是独立诱导早期辅助性T母细胞 分化成Th1细胞，并且促进Th1细胞的发育以及增殖，是介导Th1细胞免疫应答的关键性细 胞因子。IL-12可刺激NK细胞和T细胞产生IFNγ。IFNγ可刺激巨噬细胞产生大量的一氧化 氮，直接杀死病原菌。TNF-α可介导NF-kB的激活，而NF-kB作为一种快反应转录因子， 可以调控促炎细胞因子、趋化因子和黏附因子等基因的活化和表达。IL-10由Th2细胞产生， IL-10几乎可以抑制如IL-6等所有炎性免疫指标的合成与释放，其中IL-12促进Th1细胞分 化及增殖的能力也可以被IL-10抑制。但同时，Th2细胞的反应及细胞因子的分泌能力也反过 来会被作为启动和维持Th1细胞的关键性细胞因子IL-12所抑制。因此，IL-10和IL-12的动 态平衡可直接关系到机体对疾病的抵抗力。由此可见，各免疫指标之间相互影响，相互配合， 从而在机体免疫中发挥重要作用。

本试验各猪种群所检测到的各项血清免疫指标值均在正常值范围内。在不同猪群中，各 免疫指标的平均值差异基本上都为极显著，这可能是由于各猪群的遗传背景及其对疾病的抗 病力不同而造成的。

TLR4基因C1027A位点各群体不同基因型的相关性分析结果显示：圩猪、大白猪、皖南 黑猪、安庆六白猪各群体不同基因型之间免疫指标的变化趋势一致，即AA基因型个体的血 清免疫指标含量高于CA、CC型个体；其中在圩猪血清IFNγ、IL-6、TNFα含量指标上，AA 型与CA型、CC型个体的差异均达到极显著或显著水平；在大白猪血清IFNγ、IL-6、IL-10 含量指标上，AA型与CA、CC型个体的差异均达到极显著或显著水平；在皖南黑猪血清TNFα、 IL-12、IL-10含量指标上，AA型与CA、CC型个体的差异均达到极显著或显著水平；在霍 寿黑猪血清TNFα、IL-12、IFNγ含量指标上，AA型与CA、CC型个体的差异均达到极显著 或显著水平；故推测在该四个群体中，TLR4基因C1027A位点AA型个体的抗病能力可能与 CA、CC型个体存在差异，A等位基因可能在猪对疾病的抗性上具有一定的优势。

TLR4基因C318A/G417A位点各群体不同基因型的相关性分析结果显示：圩猪、大白猪、 皖南黑猪、安庆六白猪各群体不同基因型之间免疫指标的变化趋势一致，即EE基因型个体 的血清免疫指标含量高于EF型个体；其中在圩猪血清IFNγ、TNFα含量指标上，EE型与EF 型个体的差异达到显著水平；在大白猪血清IFNγ、IL-6、IL-10含量指标上，EE型与EF型 个体的差异均达到极显著或显著水平；在皖南黑猪血清TNFα、IL-12、IL-10含量指标上，EE 型与EF型个体的差异均达到极显著或显著水平；在安庆六白猪血清TNFα、IL-12、IL-10含 量指标上，EE型与EF型个体的差异均达到极显著或显著水平；故推测在该四个群体中，TLR4 基因C318A/G417A位点EE型个体的抗病能力可能与EF型个体存在差异，E等位基因可能 在猪对疾病的抗性上具有一定的优势。

研究结果提示，TLR4基因C1027A、C318A/G417A位点均可作为候选靶位点应用于安徽 地方猪种圩猪、皖南黑猪、安庆六白猪及外来品种大白猪的抗病育种。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的 各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

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