检测彩色豆马勃侵染马尾松的分子特异性标记引物及方法

摘要

本发明涉及一种检测彩色豆马勃的分子特异性标记引物,以及能对彩色豆马勃侵染马尾松进行快速鉴定的方法。所述引物序列为：上游引物：5ˊ-CAGGAGGATGGACTCGCAGGGTTTC-3ˊ；下游引物：5ˊ-CCATGACGTGGGCATTGCTTGAACT-3ˊ。本发明分子特异性标记引物可对菌根中彩色豆马勃进行快速的早期鉴别与常规形态学检测、显微观察相比，具有检测时间短，准确性高的优点；本发明方法检测所需时间只要1天，而常规的形态学观察、显微观察试验所需要的时间至少两周时间。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及检测彩色豆马勃早期侵染马尾松的分子特异性标记引物，以及利用该引物对彩色豆马勃早期侵染马尾松进行鉴别和检测的方法。

(二)背景技术

菌根(Mycorrhizas)是真菌(共生菌)与宿主植物根形成的具有特定形态结构和功能的共生体，能增加宿主植物对营养的吸收、促进宿主植物生长、产生抗生物质和形成机械屏障增强宿主植物的抗病力等。以担子菌为主的真菌与林木共生形成的外生菌根(Ectomycorrhiza)是森林树木的自然供养系统，在森林生态系统中具有极其重要的地位和作用，在长期保持森林生产力方面具有特殊的功能(花晓梅，1997)。利用外生菌根对树木和森林生态系统的有益作用促进林业的发展，最大限度地提高林业生产力是林业的一条可持续发展的道路。

彩色豆马勃(Pisolithustinctorius(Pers.)Coker&Couch)又名豆包菌，是一种外生菌根真菌，能生存在树苗的根上，是松苗的一种有前途的外生菌根共生物。具有这种真菌的树苗能在恶劣的土壤条件下生长，而且比在良好生长条件下具有其他真菌外生菌根的树苗生长得快，因此在造林时常先将苗木接种此菌后，再移植到山区，以增加树苗的存活率。由于在外生菌根真菌彩色豆马勃侵染马尾松根的早期，仅仅靠肉眼观察根部是无法判断侵染的发生以及侵染程度，因此根据分子DNA鉴定需样品量微小且灵敏度高的特点，因此为发展简便、快速、准确的鉴定技术提供了有效手段。并且分子鉴定手段相对来说较稳定，具有迅速、简便、低成本的特点。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种检测彩色豆马勃的分子特异性标记引物,以及能对彩色豆马勃侵染马尾松进行快速鉴定的方法。

本发明采用的技术方案是：

菌根中彩色豆马勃的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物：5'-CAGGAGGATGGACTCGCAGGGTTTC-3'；

下游引物：5'-CCATGACGTGGGCATTGCTTGAACT-3'。

该引物对是在文库构建的基础上，采用PCR技术，经过大量筛选试验，获得的彩色豆马勃的特异性DNA片段，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础，所设计的特异性引物，以该引物对彩色豆马勃和马尾松进行PCR扩增，可获得349大小的特异性片段。

本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对马尾松形成的根尖是否侵染彩色豆马勃进行鉴定和检测的方法，所述方法为：提取待测马尾松根尖DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现349bp的DNA条带，则待测马尾松根尖中已经侵染了彩色豆马勃；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5'-CAGGAGGATGGACTCGCAGGGTTTC-3'；

上游引物：5'-CCATGACGTGGGCATTGCTTGAACT-3'。

本发明方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下：

具体的，PCR反应条件如下：

94℃预变性6min；92℃变性40s、54.5℃退火40s、72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

PCRBuffer终浓度为1×，是指PCRBuffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCRBuffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCRBuffer。10×PCRBuffer成分为：100mMTris-HCl(pH8.5)、500mMKCl、25mMMgCl2和1.0％Triton-X-100，溶剂为ddH₂O。

具体的，本发明所述方法如下：

(1)取待测马尾松根尖，以SDS-CTAB法提取待测马尾松根尖基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每20μL组成如下：

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min；92℃变性40s、54.5℃退火40s、72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，EB染色通常在含0.5μg/m1EB的水溶液中染色30分钟。于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现349bp的DNA条带，则待测根尖中已经侵染了彩色豆马勃，反之则否。

本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对菌根中彩色豆马勃进行快速的早期鉴别，与常规形态学检测、显微观察相比，具有检测时间短，准确性高的优点；本发明方法检测所需时间只要1天，而常规的形态学观察、显微观察试验所需要的时间至少两周时间。

(四)附图说明

图1为对马尾松根尖进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；箭头所指为从编号为已经侵染了彩色豆马勃的马尾松根尖扩增出的分子量为349bp的特殊DNA条带；其余编号为未侵染彩色豆马勃的马尾松根尖的扩增。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(1)基因组DNA的提取：基因组DNA的提取采用以SDS-CTAB法进行提取。纯化的基因组DNA先用1.5％的琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用DNA/RNA紫外分光光度计定量检测。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物5'-CAGGAGGATGGACTCGCAGGGTTTC-3'和下游引物5'-CCATGACGTGGGCATTGCTTGAACT-3'，由上海生工生物工程技术有限公司合成。

(3)菌根鉴定的PCR扩增：

PCR反应体系组成：

10×PCRBuffer2μl，10mmol/LdNTPs2μl，25mmol/LMgCl₂2μl，5U/μlTaqDNA酶0.5μl，25mM特异引物对各1μl，20ng/μl模板DNA3μl，ddH₂O补足至20μl。

扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min；

92℃变性40s、68℃退火40s、72℃延伸2min，共30个循环；

最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5ul，与1ul0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/m1EB的水溶液中染色30分钟，然后在培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。

按照上述方法，分别对多个侵染彩色豆马勃的马尾松根尖(编号1～3)和未侵染彩色豆马勃的马尾松根尖(编号4～6)进行检测电泳结果见图1。其中编号1-3样品，都扩增出分子量为349bp左右的特殊DNA条带，其余编号未见有349bp左右的特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明分子特异性标记用于菌根中彩色豆马勃的鉴定，其稳定性好、特异性高。