蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷在制备强心药物中的应用

摘要

本发明属于强心药物制备技术领域，公开了蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷在制备强心药物中的应用。所述蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷具有式(一)所示结构：

说明书

技术领域

本发明属于强心药物制备技术领域，特别涉及蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D- 葡萄糖苷在制备强心药物中的应用。

背景技术

随着世界范围内的人口老龄化进程的加快，高血压、冠心病等常见心血管 病发病率逐年上升，因而心衰的患病率也逐渐升高。据统计，每年我国的心衰 患者约万。Na⁺/K⁺-ATP酶是强心甾的作用靶标。强心甾通过抑制Na⁺/K⁺-ATP 酶，使细胞内Na⁺浓度上升，启动Na⁺-Ca⁺交换，使细胞内Ca⁺浓度上升，从而 发挥强心作用。常用的强心甾类药物有地高辛、洋地黄毒苷、毛花苷丙、毒毛 花苷K及福寿草总苷等，均为甲型强心甾。其中地高辛的应用已超过200年。 这些药物在临床上用于治疗心力衰竭和某些心律失常，如心房纤颤及心动过速 等(Gheorghiade,M.；Adams,K.F.；Colucci,W.S.Digoxininthemanagementof cardiovasculardisorders.Circulation,2004,109,2959-2964.)。但是甲型强心甾类 药物的安全窗口小，一般治疗量已经接近于中毒剂量的60％，故甲型强心甾 的中毒案例时有发生(Chan,K.E.；Lazarus,J.M.；Hakim,R.M.Digoxinassociates withmortalityinESRD.J.Am.Soc.Nephrol,2010,21,1550-1555.)。其中毒症状 涉及多个系统，心脏反应是强心甾最严重、最危险的不良反应，约有40％的 病例发生各种类型的心律失常，也伴随胃肠道反应及中枢神经系统反应，如头 痛、失眠及视觉障碍(TheDigitalisInvestigationGroup.Theeffectofdigoxinon mortalityandmorbidityinpatientswithheartfailure.NewEngl.J.Med,1997,336, 525-533；Hallberg,P.；J.；Lindahl,B.；Stenestrand,U.；Melhus,H.； RIKS-HIAgroup.Digoxinandmortalityinatrialfibrillation:aprospectivecohort study.Eur.J.Clin.Pharmacol,2007,63,1201-1202.)。虽然已有多个甲型强心甾 类药物应用于临床，但其安全窗口小，故急需新型替代强心药物。

前期研究已知，中药蟾酥中的蟾毒灵(bufalin)具有很好的Na⁺/K⁺-ATP 酶抑制活性和强心活性(Tian,H.Y.,Luo,S.L.,Liu,J.S.,Wang,L.,Wang,Y., Zhang,D.M.,Zhang,X.Q.,JiangR.W.；YeW.C.C23SteroidsfromtheVenomof Bufobufogargarizans.J.Nat.Prod,2013,76(10),1842-1847.)，但其水溶性差，并 且，其对Na⁺/K⁺-ATP酶α1和α2亚型的抑制作用相当。现代研究认为， Na⁺/K⁺-ATP酶α1亚型广泛存在于人体内的各个组织中，而α2亚型存在于心肌 细胞中，因此，对α2亚型的选择性越高，其强心作用的安全性越好。此外， 已有专利报道一种蟾蜍甾烯化合物3-表-蟾毒灵3-O-β-D-葡萄糖苷具有抗肿瘤 作用(中国发明专利号：200610023793.4)，该化合物为氧苷(苷元与糖通过 氧原子连接)，糖基处于3α位，专利中亦提到该类化合物可能具有强心、抗休 克、抗病毒作用，但无具体数据支持。

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明申请人合成了蟾毒灵-3β-N- 甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)和蟾毒灵-3α-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(2)。这 两个化合物为氮苷(苷元与糖通过氮原子连接)。化合物1的糖基位于3β位， 而化合物2的糖基位于3α位。抗肿瘤活性评价结果表明，这类化合物对肿瘤 细胞的抑制活性强，而对正常细胞的抑制作用弱(中国发明专利号： CN103288911B)。本发明申请人进一步深入研究发现，化合物1亦具有显著的 Na⁺/K⁺-ATP酶抑制活性，其活性远强于糖基位于3α位的化合物2，并且化合 物1对α2亚型的选择性高，选择性指数为4.0，高于阳性药地高辛。强心活性 评价表明，化合物1的活性均显著强于化合物2。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供蟾毒灵 -3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷在制备强心药物中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷在制备强心药物中的应用。

所述蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷具有式(一)所示结构：

所述蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(下文简称化合物1)为氮苷结 构，其中，苷元部分为蟾毒灵，糖基部分为β-D-葡萄糖(D-Glu)，氮原子上有 甲氧基取代。

所述的药物含有蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷、其药用盐和其溶剂 化物中的至少一种。

所述的药物含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

所述的赋形剂可包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂、防腐剂等。其中 稀释剂可为乳糖、淀粉、糊精、微晶纤维素、微粉硅胶等，润湿剂可为水和 50～85％不同浓度的乙醇。

所述的药物可以采用本领域的常规方法制备成各种剂型，如胶囊、丸剂、 片剂、口服液、颗粒剂、酊剂等口服给药的剂型及注射液等口服以外的给药剂 型，如针剂等。

本发明上述蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷的合成方法为：用氯铬酸 吡啶盐酸盐将蟾毒灵氧化为酮式衍生物，再与甲氧胺盐酸盐进行亲核加成反应 后，脱去一分子水生成肟式中间体，再与叔丁胺基甲硼烷盐酸盐复合物反应生 成α和β两种构型的苷元，最后将α和β-构型的苷元与D-葡萄糖反应生成蟾毒 灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷和蟾毒灵-3α-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷，参见 CN103288911B。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明对蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷发掘了新的医疗用途， 开拓了一个新的应用领域。

(2)本发明的蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷安全性高，强心作用 强，预示着良好的药用前景。

(3)本发明的蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷的制备工艺简单，成 本低，产率高。

附图说明

图1为蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(化合物1)和蟾毒灵-3α-N- 甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(化合物2)的化学结构式。

图2为蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷对斑马鱼心脏形态的影响。

图3为蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷的强心作用效果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。

实验例1：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷的合成

(1)反应底物蟾毒灵C3位羟基经氧化剂氯铬酸吡啶盐酸盐(PCC)氧化， 生成C3位成酮的Bufalone，该步反应在室温即可，收率较高(产率90％)； (2)后者与甲氧胺盐酸盐经亲和加成-消除反应，生成C3位连有甲氧基的亚 胺结构的蟾毒灵衍生物2a/b，Bufaloneoximes，反应较为彻底，收率较高(产 率90％)；(3)肟式混合物Bufaloneoximes经还原剂叔丁胺甲硼烷盐酸盐还原， 生成C3位构型相异的异构体化合物3α和3β，反应在冰浴冷却下进行，收率 约60％，其中，中间体摩尔比约为3α:3β＝2:1，两异构体可通过硅胶柱分离； (4)将3β、3α构型的异构体与葡萄糖进行糖基化反应，从而合成C3位连有 葡萄糖基的氮苷型蟾毒灵糖基化产物，即蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷 (化合物1，产率为40％)和蟾毒灵-3α-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(化合物2， 产率为48％)。具体操作参见CN103288911B。结构式见图1。

蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(化合物1)的波谱数据：ESI-MSm/z： 578.4[M+H]⁺，600.5[M+Na]⁺，1177.2[2M+Na]⁺。¹HNMR(Pyridine-d5，400MHz) δ8.25(1H，dd，J＝9.6，2.4Hz)，7.48(1H，d，J＝2.4Hz)，6.35(1H，d，J＝9.6Hz)， 4.72(1H，d，J＝8.6Hz)，4.46(m，1H)，4.28(m，1H)，4.22(m，1H)， 3.88(m，1H)，4.55，4.35(m，2H)，3.94(s，3H)，3.83(m，1H)，2.50 (m，1H)，2.18，1.87(m，2H)，2.16，1.45(m，2H)，1.79，1.33(m，2H)， 1.69，1.51(m，2H)，1.28，1.09(m，2H)，2.19(m，1H)，1.87(m，1H)， 1.73(m，1H)，1.75(m，1H)，1.42(m，1H)，0.89(s，3H)，0.81(s，3H)。 ¹³CNMR(Pyridine-d5，100MHz)δ162.1，149.2，147.5，123.8，115.1，90.9， 84.3，80.5，80.2，71.7，71.6，63.6，62.9，57.1，51.4，48.8，42.2，40.8，37.0， 36.5，35.8，32.8，31.0，29.5，29.4，27.2，23.9，23.7，22.1，21.6，17.1。

根据质谱、核磁共振信息，鉴定产物为蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖 苷，其化学式为C₃₁H₄₇NO₉。

蟾毒灵-3α-N-甲氧基-N-beta-D-葡萄糖苷(化合物2)的波谱数据：¹HNMR (Pyridine-d₅，300MHz)δ8.33(dd，1H，J＝9.7，2.5Hz)，7.56(d，1H，J＝ 2.5Hz)，6.44(d，1H，J＝9.7Hz)，4.90(d，1H，J＝8.7Hz)，4.57(m，1H)， 4.39(m，1H)，4.31(m，1H)，3.98(m，1H)，4.63，4.47(m，2H)，4.06 (s，3H)，2.27，1.93(m，2H)，1.90，1.60(m，2H)，3.66(m，1H)，2.58 (m，1H)，2.07(m，2H)，2.26(m，2H)，1.02(m，2H)，0.97(s，3H)， 0.89(s，3H)。¹³CNMR(Pyridine-d₅，75MHz)δ162.1，149.2，147.5，123.9， 115.1，91.4，84.2，80.5，80.3，71.7，71.3，63.8，62.9，62.2，51.3，48.7， 42.3，42.0，40.7，36.5，35.9，35.3，32.9，32.1，29.4，27.8，25.2，23.6，22.4， 21.5，17.1。ESI-MSm/zC₃₁H₄₇NO₉：578.4[M+H]⁺，600.3[M+Na]⁺，1177.3 [2M+Na]⁺，HRMS(ESI)m/zC₃₁H₄₇NO₉Na([M+Na]⁺)600.3145，cacl.600.3148。

根据质谱、核磁共振信息，鉴定产物为蟾毒灵-3α-N-甲氧基-N-beta-D-葡 萄糖苷，其化学式为C₃₁H₄₇NO₉。

实施例2：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(化合物1)和蟾毒灵-3α-N- 甲氧基-N-beta-D-葡萄糖苷(化合物2)的Na⁺/K⁺-ATP酶抑制活性。

测试方法参见文献(Zhang,R.R.；Tian,H.Y.；Tan,Y.F.；Chung,T.Y.；Sun, X.H.；Xia,X.；Ye,W.C.,Middleton,M.A.；NatalyaF.；EsmannM.；Tzen,J.T.C.； Jiang,R.W.Structures,chemotaxonomicsignificance,cytotoxicand Na+,K+-ATPaseinhibitoryactivitiesofnewcardenolidesfrom Asclepiascurassavica.Org.Biomol.Chem.2014,12(44),8919-8929.)，对化合物1 和2进行活性评价，具体步骤如下：

(1)将活性测试溶液加入到96孔板中，每孔100μL，含有100mMNaCl， 20mMKCl，1mMMgCl₂，1mMEGTA，20mMTris-HCl，pH7.4，和0.2μg ofpurifiedNa⁺/K⁺-ATP酶α1或α2亚型。

(2)加入不同浓度的化合物1和2后，将96孔板37℃孵育15min。

(3)加入2mMATP-Mg启动酶促反应，并在37℃孵育15min。

(4)在每孔中加入冰冷的BIOMOLGreen试剂100μL，并室温放置20 分钟，测试620nm的吸光度。

根据吸光度可计算释放出的磷酸的量，从而计算出化合物1和2对酶的抑 制活性。本实验测得蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(化合物1)对 Na⁺/K⁺-ATP酶α1的IC₅₀为0.20±0.03μM，对α2亚型的IC₅₀为0.05±0.01μM， 对α2亚型的选择性指数为4.0；蟾毒灵-3α-N-甲氧基-N-beta-D-葡萄糖苷(2) 对α2亚型的IC₅₀均大于20μM，而相同条件下阳性药地高辛(digoxin)的IC₅₀对α1、α2亚型的IC₅₀为分别为0.31±0.04μM和0.18±0.03μM，对α2亚型 的选择性指数为1.72。可见，化合物1对Na⁺/K⁺-ATP酶的抑制活性强于化合 物2及阳性药地高辛，并且，化合物1对对α2亚型的选择性指数显著强于阳 性药地高辛。

实施例3：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(化合物1)对斑马鱼的 强心作用

本发明采用心脏带有绿色荧光(便于观察)的斑马鱼模型来研究其强心作 用(Huang,C.C.；Monte,A.；Cook,J.M.；Kabir,M.S.；Peterson,K.P.Zebrafish HeartFailureModelsfortheEvaluationofChemicalProbesandDrugs.Assay DrugDev.Technol.2013,11(9-10),561-572.)。

采用Tg(cmlc2:GFP)转基因斑马鱼(澳门大学)，其受精卵由清晨雌雄 鱼交配获得。将受精卵分成四组(给药组、阳性对照组、阴性对照组、溶媒对 照组)然后将各组受精卵放于培养液中，28℃孵化。24h后，向培养液中加入 多柔比星(0.3μM)，并继续培养24小时，造模)，用数字化荧光倒置显微镜 观察斑马鱼的心脏形态并测定心率以确定心衰模型构建成功。然后，向给药组 培养液中加入不同浓度的化合物1，阳性药对照组中加入地高辛(0.5μM)， 溶媒对照组中加入0.1％的DMSO，并继续培养48小时后，用数字化荧光倒 置显微镜观察各化合物对受损心脏形态的恢复作用，并根据文献报道的方法 (Moore,F.B.G.；HoseyM.；Bagatto,B.Cardiovascularsysteminlarvalzebrafish respondstodevelopmentalhypoxiainafamilyspecificmanner.Frontiersin Zoology,2006,3,4.)测定每搏输出量(strokevolume)、心输出量(cardiacoutput) 等心脏功能指标来评价化合物的强心活性，结果见图2，给药组标记为“1”。

结果表明，用多柔比星造模后，斑马鱼的每博输出量减少为对照组的 66.7％，而心输出量降低为对照组的67.9％，表明造模成功。当加入浓度为 0.125，0.25，0.5，1.0，2.0μM的蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷后，每 博输出量显著增加，相对于模型组，增加量分别为11.1％，55.6％，88.9％， 105.5％和122.2％(同样，斑马鱼的心输出量也显著增加，增加量分别为 21.1％，47.3％，78.9％，100.0％和115.8％。在相同条件下，阳性药地高辛 (0.5μM)的每博输出量和心输出量的增加量分别为66.7％和68.4％。可见， 本发明蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷的强心作用具有剂量依赖性，并 且，在相同浓度(0.5μM)下，蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷的强心作 用强于地高辛。

实施例4：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(化合物1)的斑马鱼的 心脏毒性

采用AB系斑马鱼(野生型，澳门大学)，其受精卵由清晨雌雄鱼交配获 得。将受精卵分成四组(对照组、模型组、给药组和阳性药组)，然后将各组 受精卵放于培养液中，28℃孵化。24h后，向给药组培养液中加入化合物1 样品(0.3μM)，模型组培养液中加入多柔比星(0.3μM)，阳性药组培养液中 加入地高辛(0.3μM)，并继续培养48h。将斑马鱼胚胎用3％甲基纤维素固 定并用3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(0.16mg/mL)进行麻醉。最后，用SZX10 体视显微镜观察和比较四组斑马鱼的心脏形态，结果见图3。

结果表明：与对照组相似，化合物1不引起斑马鱼心脏形态的变化，而地 高辛和多柔比星组的心脏外形均表现为代偿性膨大。因此本发明蟾毒灵-3β-N- 甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)的心脏毒性显著低于阳性药地高辛(digoxin)和 多柔比星(doxorubicin，抗肿瘤药，其主要副作用为心脏毒性，刘蓓菁.药物 心脏毒性反应与药物警戒.药物流行病学杂志,2011,20,205-208.)。

实验例5：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)的急性毒性实验

(1)口服给药

取体重18～22g的昆明种小鼠(购自广东省动物中心)，用实施例1制备 得到的蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)配成水溶液(混悬)灌胃50.0 mg/kg，连续一周，未见小鼠死亡。

(2)腹腔注射给药

试验方法：取体重18～22g的昆明种小鼠(购自广东省动物中心)，随机 分组，每组12只，腹腔注射不同剂量的化合物1，根据小鼠存活情况，计算 半数致死剂量LD50。

表1蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)对小鼠的急性毒性作用

半数致死量按如下公式计算：

结果表明(参见表1)，化合物1在15mg/kg的给药剂量下，未观察到小 鼠的死亡，其半数致死剂量为30mg/kg，而蟾毒灵在10mg/kg的给药剂量下， 已观察到小鼠的死亡。

实施例6：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)在制备强心药物的 应用

取蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)50g、淀粉190g混合均匀， 用70％乙醇制成软材，制粒，烘干。加入10g硬脂酸镁混合均匀，压片，制 成2000片，包薄膜衣，每片含蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷25mg。

实施例7：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)在制备强心药物总 的应用

缓释片的制备

将蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)25g，用处方量85％乙醇溶 液溶解，加辅料乳糖120g、羟丙基甲基纤维素(HPMC)110g、预胶化淀粉 60g，混合均匀；加入85％乙醇溶液混合制成软材，制粒，过(18～35)目筛 后干燥，将干颗粒过(18～35)目筛网整粒；称取硬脂酸镁10g，加入干颗粒 中，混合均匀，浅弧形冲压片(1000片)，即得蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡 萄糖苷(1)缓释片的素片，每片含蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷25mg。

实施例8：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)在制备强心药物总 的应用

口腔崩解片的制备

取蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)200g、微晶纤维素600g， 交联聚维酮300g、甘露醇160g、硬脂酸镁170g、阿斯巴甜160g、柠檬酸 10g，混合均匀，过80目筛，采用直接压片法制备片重为0.20g的口腔崩解 片(8000片)，每片含蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷25mg。

实施例9：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)在制备强心药物总 的应用

胶囊剂的制备

取蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)50g、乳糖200g、淀粉130g、 硬脂酸镁20g，加65％乙醇制成软材，干燥、过筛、制粒，装入胶囊，制成 2000粒。每粒胶囊含蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)25mg。

实施例10：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)在制备强心药物总 的应用

注射液的制备

蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)100g，丙二醇5000g，研磨， 再加适量注射用水稀释，混匀，然后加入氯化钠适量，溶解后再加入注射用水 至100L，调pH值7.0-7.4，滤过，灌封，灭菌，即得1万支注射用针剂，每 支含蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)10mg。

实施例11：蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)在制备强心药物总 的应用

脂质体纳米粒的制备

蟾毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)100g，大豆卵磷脂50g，溶于 2500mL乙醇中，另取硬脂酸20g和大豆卵磷脂脂50g溶于2500mL环己烷 中，混合搅拌均匀。于37℃恒温水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂，使药物 及辅料在烧瓶壁形成均匀脂质薄膜，于真空干燥器中放置过夜，除尽有机溶剂； 另取聚乙二醇单硬脂酸酯375g，搅拌溶解在17.5L水中，加入上述薄膜中， 超声30min，定溶至25L，得淡黄色透明溶液。将此溶液冷冻干燥可得冻干 粉。用球磨机研磨24小时，制得粒径均匀的纳米粒，混匀并分装。每袋含蟾 毒灵-3β-N-甲氧基-N-β-D-葡萄糖苷(1)10mg。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。