丙戊酸钠在制备预防和治疗移植物抗宿主病药物中的应用

摘要

本发明公开丙戊酸钠在制备预防和治疗移植物抗宿主病药物中的应用，将丙戊酸钠单独或与移植物抗宿主病的标准方案联合，用于临床实践中骨髓移植(造血干细胞移植)受者移植物抗宿主病的预防和治疗，其效果相比标准方案更有效的降低移植物抗宿主病的发生率，并减轻移植物抗宿主病的严重性，尤其减少Ⅲ-Ⅳ度移植物抗宿主病的比例。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，更具体地讲，涉及丙戊酸钠在制备预防和治疗骨髓 移植(造血干细胞移植)后移植物抗宿主病药物中的应用。

背景技术

目前预防急性移植物抗宿主病的标准方案是钙调磷酸酶抑制剂如环孢素或 者他克莫司与甲氨喋呤或者霉酚酸酯联用的方案，其中钙调磷酸酶抑制剂主要 通过抑制T淋巴细胞受体下游的钙依赖性的信号转导通路来抑制供体T淋巴细胞 的增殖，而甲氨喋呤或者霉酚酸酯则通过阻断鸟苷酸的从头合成途径来发挥抑 制淋巴细胞增殖的作用。但是在接受该方案处理后仍然有一半以上的骨髓移植 (造血干细胞移植)受者会发生急性移植物抗宿主病。移植物抗宿主病的发生 极大限制了骨髓移植(造血干细胞移植)的临床应用，并且是导致移植后病人 死亡或者移植失败的主要原因，据统计，移植排异所致的死亡率达15％。此外， 急性移植物抗宿主病所致病人体内系统性的炎症状态和免疫紊乱又可诱发并促 进慢性移植物抗宿主病。激素(泼尼松)是治疗急慢性移植物抗宿主病的一线 方案，对于急性移植物抗宿主病，通常根据病人的体重每天给予2mg/kg的剂量， 而发生慢性移植物抗宿主病的病人则给予每天1mg/kg的剂量。但既往的临床实 践表明激素治疗的反应率较低，有一半以上的病人仍需要二线治疗方案。并且 对激素依赖或抵抗的移植物抗宿主病患者(又称为激素难治性移植物抗宿主病 患者)的预后极差，其长期死亡率可达90％。因此，需要探索新的药物或药物联 合方案，以更好的控制或治疗移植物抗宿主病。

丙戊酸钠是一种已经被用于临床的药物，具有广谱的抗癫痫作用，对人的 各型癫痫均有效。临床上治疗癫痫的常用剂量是每天10-20mg/kg，并可根据病情 的控制情况逐渐增加剂量。近来的研究发现，丙戊酸钠是一类组蛋白去乙酰化 酶抑制剂。大量的实验室研究均已表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有很强的抗 炎和免疫调控效应，如实验室研究及I/II期临床试验均表明伏立诺他能够有效的 降低严重急性移植物抗宿主病的发生率。此外，小鼠实验性自身免疫性脑炎模 型及小鼠肠炎模型的实验室研究显示丙戊酸钠具有良好的抗炎效应。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供丙戊酸钠在制备预防移植物抗宿主病药物 中的应用。

本发明的第二个目的在于提供丙戊酸钠与钙调磷酸酶抑制剂和甲氨喋呤 或者霉酚酸酯联合用药在制备预防移植物抗宿主病药物中的应用。

本发明的第三个目的在于提供丙戊酸钠在制备治疗移植物抗宿主病药物 中的应用。

本发明的第四个目的在于提供丙戊酸钠与泼尼松联合用药在制备治疗移 植物抗宿主病药物中的应用。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：丙戊酸钠在制备预防移植物 抗宿主病药物中的应用。

为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：丙戊酸钠与钙调磷 酸酶抑制剂和甲氨喋呤或者霉酚酸酯联合用药在制备预防移植物抗宿主病药 物中的应用。

为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：丙戊酸钠在制备治 疗移植物抗宿主病药物中的应用。

为实现本发明第四个目的，本发明公开以下技术方案：丙戊酸钠与泼尼松 联合用药在制备治疗移植物抗宿主病药物中的应用。

本发明的优点在于：本发明将丙戊酸钠单独或与移植物抗宿主病的标准方 案联合，用于临床实践中骨髓移植(造血干细胞移植)受者移植物抗宿主病的 预防和治疗，其效果相比标准方案更有效的降低移植物抗宿主病的发生率，并 减轻移植物抗宿主病的严重性，尤其减少Ⅲ-Ⅳ度移植物抗宿主病的比例。

附图说明

图1是本发明所涉及实验研究的流程图。

图2是不同处理组移植受体小鼠的生存曲线。

图3是不同处理组移植受体小鼠的体重变化曲线。

图4是不同处理组移植受体小鼠移植物抗宿主病的临床评分。

图5是不同处理组移植受体小鼠移植物抗宿主病靶器官的组织病理学检 查。

图6是不同处理组移植受体小鼠移植物抗宿主病靶器官的病理学评分。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方 法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特 殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常 规条件，例如J.萨姆布鲁克(JosephSambrook)等编写的《分子克隆实验指南》 中所述的条件，或按照制造厂商所推荐的条件进行实验。

实施例1.

在图1中，移植前一周开始给予受体小鼠酸水喂养。移植前一天(Day-1) 将BALB/c(图1所示白色小鼠)由¹³⁷Cs放射源进行全身辐照，共2次，每次 剂量为4Gy，间隔3小时。移植当天(Day0)，将C57BL/6小鼠(图1所示黑 色小鼠)引颈处死，然后分离两侧股骨和胫骨，并分离脾脏。将股骨和胫骨置 于培养皿中，用注射器吸取含1％胎牛血清的磷酸盐缓冲液将骨髓吹出，并反 复吹打数次，得到单个骨髓细胞悬液，然后用70微米滤网滤过细胞悬液。将 分离得到的脾脏置于70微米滤网中，轻柔碾磨粉碎后用注射器吸取含1％胎牛 血清的磷酸盐缓冲液反复吹打数次，得到单个脾脏细胞悬液，然后用70微米 滤网滤过细胞悬液。将骨髓细胞悬液和脾脏细胞悬液离心，收集沉淀，其中将 脾脏细胞悬液用红细胞裂解液裂解红细胞5分钟，然后再次离心收集沉淀。将 所得到的骨髓细胞和脾脏细胞沉淀分别用磁珠分选缓冲液重悬，计数细胞量， 然后加入适量的抗CD90.2磁珠，于冰上孵育20分钟，每5分钟震荡混匀。然 后加入30毫升磁珠分选缓冲液清洗，离心得到细胞沉淀。用0.5-1毫升磁珠分 选缓冲液重悬细胞，进行磁珠分选，分别得到去除T细胞的骨髓细胞悬液和脾 脏细胞中富集得到的T细胞。离心并用PBS重悬，计数细胞，并调整至合适 的浓度。每只BALB/c小鼠的移植细胞量为：去T骨髓细胞5×10⁶和(或) T细胞1×10⁶。细胞悬液由尾静脉注入。

移植受体小鼠一共分为3组，分别为去T移植组(只移植5×10⁶去T骨 髓细胞)，溶剂对照组(移植5×10⁶去T骨髓细胞和1×10⁶T细胞，并给予溶 剂处理)和丙戊酸钠处理组(移植5×10⁶去T骨髓细胞和1×10⁶T细胞，并 给予丙戊酸钠处理)。丙戊酸钠粉末溶于磷酸盐缓冲液中，浓度为30mg/ml。 从移植当天开始，每天在给药前称量小鼠体重，按300mg/kg体重经腹腔给药。

图2，移植后每天观察移植受体小鼠的生存情况。如图所示，去T移植组 BALB/c小鼠(用●表示，小鼠数量为10只)并没有发生移植物抗宿主病，而同 时接受去T骨髓细胞和T细胞的溶剂对照组小鼠(用表示，小鼠数量为20 只)均因移植物抗宿主病而死亡；相反，丙戊酸钠处理(用▲表示，小鼠数量 为20只)减轻了受体小鼠所发生移植物抗宿主病的严重程度，在整个观察期 结束时有40％的小鼠仍然存活，并且无严重的移植物抗宿主病症状。

图3，移植后每两天称量各组小鼠的体重，计算各组小鼠的平均体重。如 图所示，丙戊酸钠处理组小鼠因移植物抗宿主病所致体重下降程度较轻。(● 表示去T移植组，表示溶剂对照组，▲表示丙戊酸钠处理组)。

图4，移植后每周对各组小鼠的移植物抗宿主病发生情况进行临床评分， 评分包括5个指标——体重减轻、姿势、活动度、毛发稀疏度和皮肤完整度。 具体如下：

根据临床评分可知丙戊酸钠处理组小鼠移植物抗宿主病较对照组轻。(● 表示去T移植组，表示溶剂对照组，▲表示丙戊酸钠处理组)。

图5，移植4周以后对对照组和处理组小鼠的移植物抗宿主病靶器官进行 病理学检查(图中从左至右分别为舌、肝、肺、小肠和结肠，上下两行分别是 对照组和处理组)。组织病理学检查发现丙戊酸钠处理组小鼠各靶器官的炎症 浸润程度较溶剂对照组明显减轻。

图6，对图5中的病理学检查进行病理评分，可见丙戊酸钠处理组小鼠的 病理评分显著低于对照组小鼠。

病理学检查方法如下：

取小鼠的左肺，肝脏，小肠，结肠和舌(用于观察皮肤移植物抗宿主病的 严重程度)固定于10％中性福尔马林，经石蜡包埋，切片和HE染色等步骤制 作成5微米石蜡切片。每个器官取两张切片观察炎症程度并根据评分系统进行 病理评分。评分系统如下：

1)舌：

0：正常；

1：真皮层及基质可见单个核细胞浸润；

2：炎性浸润累及表皮层；

3：表皮可见出血或溃疡

2)肺：GVHD累及肺表现为间质及肺泡炎症，伴有支气管管腔周围及血 管浸润。

肺的损伤程度根据肺组织的累及范围确定：5％-25％＝1； 25％-50％＝2；>50％＝3。总分数为上述分数相加所得。

3)肝、肠

0：正常

0.5：局灶，少见

1：局灶，轻度

2：弥漫，轻度

3：弥漫，中度

4：弥漫，严重

肝脏：凋亡，汇管区浸润，小叶浸润，胆管损伤，血管内皮炎。

肠：杯状细胞减少，肠细胞凋亡，隐窝细胞脓肿，固有层炎症，肠黏膜溃 疡。

本发明首先应用实验室的小鼠移植物抗宿主病模型研究来探究丙戊酸钠 对于移植物抗宿主病的调控作用。实验结果表明经过丙戊酸钠处理的移植受体 小鼠移植物抗宿主病的严重性得到显著减轻。此外，丙戊酸钠治疗保留了移植 物抗白血病效应，使接受了白血病细胞的移植受体小鼠的生存期显著延长。基 于这些实验室发现，本发明将丙戊酸钠与移植物抗宿主病的标准方案联合，用 于临床实践中骨髓移植(造血干细胞移植)受者移植物抗宿主病的预防和治疗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也应视为本发明的保护范围。