一种十二烷基化果胶载羊血清蛋白微球的制备方法

摘要

一种十二烷基化果胶载羊血清蛋白微球的制备方法，采用溴代十二烷对果胶进行改性，所制备得到的十二烷基化果胶被用于包埋羊血清蛋白制备载药微球。本发明制备的十二烷基化果胶，具有良好的与钙离子的交联性能，能有效地包埋羊血清蛋白，形成致密的结构；既能在胃液中保持完整的形态，又能使蛋白药物在结肠pH下释放，达到结肠定点释放药物的目的。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及果胶作为药物载体的应用。

背景技术

随着生物技术领域的高速发展，蛋白类药物快速成为治疗药物中非常重要的一部分。目前，蛋白类药物主要通过皮下注射给药，然而这种给药方式作用时间短，需要多次及频繁注射给药，为减小反复注射给病人身心健康带来的危害，迫切需要寻找一种非注射给药途径来代替注射给药。口服给药，具有减少病人痛苦、方便、可以减少交叉污染和针刺伤等特点成为替代首选；但是蛋白类药物在上消化道中易被蛋白酶消化降解，吸收低，通过小肠上皮粘膜的数量有限。一般而言，小肠具有大量高活性的蛋白酶，而结肠内的蛋白酶因pH的变化均已失活，有利于蛋白及多肽类药物的完整吸收，因此将蛋白类药物传递到结肠是口服给药途径中提高蛋白吸收的有效手段。

果胶无毒，几乎存在于所有的高等植物中，因其良好的生物降解性、不被消化酶降解能被结肠内微生物产生的果胶酶降解的特性，已被用作结肠释药载体。但是果胶亲水性强，水凝胶孔径大，在模拟小肠液中1-2h就会完全崩塌，缓释效果不甚理想，通常采用包衣、与其它物质混合以及化学修饰来优化凝胶的释药行为。烷基化反应引入了疏水的长链烷基，产物疏水性增加，从而实现药物包埋率的增加和结肠靶向释药。

发明内容

本发明的目的是为了解决蛋白药物在消化道中被蛋白酶降解的问题，提出一种十二烷基化果胶载羊血清蛋白微球的制备方法，合成一种能有效将蛋白药物携带至结肠部分并释放的药物载体。

本发明所述的一种十二烷基化果胶载羊血清蛋白微球的制备方法，按以下步骤。

（1）配制2-3%的果胶溶液，加入质量浓度为25-27%的四丁基氢氧化铵中和溶液pH至7.0，冷冻干燥后，称取果胶粉末溶于二甲基亚砜溶液中，加入等摩尔质量溴代十二烷，室温搅拌反应24h，并在超纯水中室温下透析7天。

（2）旋转蒸发透析液得浓缩液，在4-7℃条件下，浓缩液与1mol/L氯化钠的体积分数为75%的乙醇溶液反应24h。

（3）过滤溶液，先用体积分数为75%的乙醇清洗，之后用无水乙醇清洗，直至没有氯离子，然后用无水丙酮清洗，常温常压下干燥，得十二烷基化果胶。

（4）配制十二烷基化果胶水溶液，边搅拌边将一定量的羊血清蛋白溶于其中，然后使十二烷基化果胶和羊血清蛋白的质量浓度分别为4%、1%。

（5）在每100g混合溶液中加入15-16g异辛烷与斯盘80按质量比40:1的混合物，在转速为1000r/min的磁力搅拌器上剧烈搅拌；10min后，加入1-1.3g质量浓度为20%的吐温80溶液，继续搅拌5min后，加入4-4.5g质量浓度30%的无水氯化钙溶液，继续搅拌10-15min。

（6）离心收集微球，依次用氯化钙溶液、蒸馏水以及丙酮清洗，常温常压下干燥24h得十二烷基化果胶载羊血清蛋白微球。

步骤（6）所述的氯化钙溶液为0.05mol/L氯化钙的溶液，其中含有体积分数为1%的吐温80。

本发明制备的十二烷基化果胶，具有良好的与钙离子的交联性能，能有效地包埋羊血清蛋白，形成致密的结构。既能在胃液中保持完整的形态，又能使蛋白药物在在结肠pH下释放，达到结肠定点释放药物的目的。

附图说明

图1为原果胶微球形貌图。

图2为十二烷基化果胶微球形貌图。

图3为原果胶经胃液消化后的微球形貌图。

图4为十二烷基化果胶经胃液消化后的微球形貌图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1。

（1）取2g果胶溶于水得100mL溶液，得2%的果胶溶液，在通风橱中加入质量浓度为25%的四丁基氢氧化铵溶液，并中和溶液pH至7.0。

将pH为7.0的果胶溶液进行冷冻干燥，冷冻干燥后称取1g所得果胶粉末溶于50mL二甲基亚砜溶液中，加入溴代十二烷1.28g，在室温下搅拌反应24h，并在超纯水中室温下透析7天以除去二甲基亚砜。

（2）旋转蒸发透析液得浓缩20mL左右样品，配制摩尔浓度为1mol/L氯化钠的乙醇溶液，且乙醇的体积分数为75%。在4℃条件下，浓缩样品与氯化钠溶液反应24h。

（3）过滤，先用体积分数75%的乙醇清洗滤渣2遍，之后用无水乙醇清洗滤渣2遍，直至滤液没有氯离子，用硝酸银溶液检测是否含有氯离子，然后用无水丙酮清洗滤渣2遍，常温常压下干燥滤渣，得十二烷基化果胶。

（4）配制十二烷基化果胶水溶液，完全溶解后边搅拌边将1g羊血清蛋白溶于其中，然后使十二烷基化果胶和羊血清蛋白的质量浓度分别为4%、1%。

（5）于100g混合溶液中加入15g异辛烷与斯盘80质量比40:1的混合物，在转速为1000r/min的磁力搅拌器上剧烈搅拌。10min后，加入1g质量浓度为20%的吐温80水溶液，继续搅拌5min后，加入4g质量浓度30%的无水氯化钙溶液，继续搅拌10min，使十二烷基化果胶与钙离子充分进行交联反应。

（6）离心收集微球，配制0.05mol/L氯化钙的溶液且含有体积分数为1%的吐温80，依次用氯化钙溶液、蒸馏水以及丙酮清洗，常温常压下干燥24h得十二烷基化果胶载药微球。

效果分析。

（1）果胶与钙离子交联凝胶流变性。

表1果胶及其十二烷基化果胶载药微球的存储模量

样品10℃存储模量果胶微球2050Pa十二烷基化果胶微球98Pa

存储模量越大意味着形成的凝胶体系弹性越大，因此十二烷基化果胶与钙离子交联形成的凝胶强度要大于原果胶的，载药率方面，十二烷基化果胶也要强于原果胶。

（2）微球的包封率和载药量。

表2果胶及其十二烷基化果胶载药微球的载药量和包封率

样品载药量(%)±标准偏差（%）包封率(%)±标准偏差（%）果胶微球11.97±0.76^a59.85±3.76^a十二烷基化果胶微球19.48±0.4^b97.40±1.05^b

注：同列中数据的不同上标字母代表有显著差异（p<0.05）。

十二烷基化果胶微球的载药量和包封率相对于原果胶有明显提高。

（3）微球体外释放行为。

表3不同pH环境下羊血清蛋白的累计释放率

果胶微球累计释放率（%）十二烷基化果胶微球累计释放率（%）胃环境pH=1.2、12h100.0%9.7%结肠环境pH=7.4、12h2小时释放至100.0%8小时释放至100.0%先胃环境pH=1.2、2h96.0%6.2%后结肠环境pH=7.4、10h100%100.0%

本实施例所用的测定方法。

测定方法1：十二烷基化果胶/果胶与钙离子凝胶流变测定。

将未经修饰的果胶及十二烷基化果胶分别溶解于0.1mol/LNaCl中以消除静电作用，在80℃剧烈搅拌下加入氯化钙溶液，使得果胶最后浓度为4%，钙浓度为3mmol/L。搅拌10-15min后，溶液迅速转移到预先加热到80℃的流变仪上，覆上一层硅油以防水分散失。使用1°椎板夹具，固定频率1Hz和3%应变力，流变仪温度从80℃以1℃/min的速率冷却至10℃，检测整个冷却过程中存储模量的变化，结果如表1所示。

测定方法2：测定微球的包封率和载药量，具体步骤如下。

将未经溴代十二烷修饰的果胶采用实施案例1中步骤（4）、（5）、（6）制备得到果胶载药微球，然后将10mg果胶微球与实施例1得到的十二烷基化果胶载药微球分别分散在10mLpH7.4磷酸缓冲溶液中，37℃下剧烈搅拌48h，使微球中的药物完全释放。4800-5000r/min下离心10-15min，取0.2mL的上清液用磷酸缓冲液稀释五倍，加入5mL考马斯亮蓝G-250显色液，振荡均匀。静置反应5min后，在波长595nm下测定吸光度值，以空白微球释放液为空白样，根据羊血清蛋白标准曲线，得出微球中的羊血清蛋白含量，载药量和包埋率，结果见表2。

测定方法3：微球体外释药行为的测定，具体步骤如下。

羊血清蛋白标准曲线的绘制：羊血清蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝比色法：10mg羊血清蛋白分别溶于pH为1.2的盐酸/氯化钾缓冲液和磷酸盐缓冲液中，定容至50mL，羊血清蛋白浓度为200μg/mL。分别取羊血清蛋白标准液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1mL于比色管中，加入对应的缓冲液至1mL，分别加入5mL考马斯亮蓝G-250显色液，振荡均匀，静置反应5min后，在波长595nm下测定吸光度值，以羊血清蛋白的浓度对吸光度值线性回归,得到两种缓冲液中的标准曲线回归方程。

精密称取30mg的未经修饰的果胶及十二烷基化果胶所得的载药微球，置于200mL的具塞锥形瓶中，分别加入50mL的释放介质，置于水浴恒温振荡锅中，在恒温37℃、转速75r/min下恒温振荡，模拟胃肠道蠕动。释放介质分别为模拟胃液：pH为1.2的盐酸/氯化钾缓冲液；模拟结肠液：pH为7.4磷酸缓冲液；以及前2h为模拟胃液，然后过滤换成模拟结肠液。特定时间取一定释放液，同时补充相同体积的释放介质。将样品4800r/min离心5min，吸取上清液，如上所述在波长595nm下测定吸光度，计算出不同时间羊血清蛋白的累积释放百分率，结果如表3。

实施例2。

（1）取3g果胶溶于水得100mL溶液，配制3%的果胶溶液，加入质量浓度为27%的四丁基氢氧化铵中和溶液pH至7.0，冷冻干燥后，称取果胶粉末溶于二甲基亚砜溶液中，加入等摩尔质量溴代十二烷，室温搅拌反应24h，并在超纯水中室温下透析7天。

（2）旋转蒸发透析液得浓缩液，在7℃条件下，浓缩液与1mol/L氯化钠的体积分数为75%的乙醇溶液反应24h。

（3）过滤溶液，先用体积分数为75%的乙醇清洗，之后用无水乙醇清洗，直至没有氯离子，然后用无水丙酮清洗，常温常压下干燥，得十二烷基化果胶。

（4）配制十二烷基化果胶水溶液，边搅拌边将一定量的羊血清蛋白溶于其中，然后使十二烷基化果胶和羊血清蛋白的质量浓度分别为4%、1%。

（5）在每100g混合溶液中加入16g异辛烷与斯盘80按质量比40:1的混合物，在转速为1000r/min的磁力搅拌器上剧烈搅拌；10min后，加入1.3g质量浓度为20%的吐温80溶液，继续搅拌5min后，加入4.5g质量浓度30%的无水氯化钙溶液，继续搅拌15min。

（6）离心收集微球，配制0.05mol/L氯化钙的溶液且含有体积分数为1%的吐温80，依次用氯化钙溶液、蒸馏水以及丙酮清洗，常温常压下干燥24h得十二烷基化果胶载羊血清蛋白微球。

效果分析。

(1)微球形貌观察。

通过环境扫描电镜观察新鲜制备的果胶以及十二烷基化果胶微球形态，结果如图1、图2所示。原果胶形成椭球状微球，但是表面粗糙，褶皱不光滑，质地疏松不紧密；而十二烷基化果胶微球呈均匀扁平状、光滑、无褶皱、质地紧密。SEM图谱中没有观察到药物晶体存在于微球表面，表明蛋白药物是被包埋于果胶和烷基化果胶中，没有吸附在微球表面。

（2）经胃液消化后的微球形貌观察。

如图3、图4所示，原果胶微球在pH1.2的释放介质中释药12h后，微球已全部崩塌，观察不出微球形状；而十二烷基化果胶微球释药12h后没有破碎，仍保持原有形态。

本实施例所用的测定方法。

（1）微球形貌观察。

果胶以及十二烷基化果胶微球的形状和表观形貌通过环境扫描电子显微镜（SEM）进行观察：新鲜制备的微球干燥后，用双面胶将其粘在样品板上，在不同的倍数条件下，对样品进行形貌观察。

（2）经胃液消化后的微球形貌观察。

将微球参考实施例1测试方法3进行胃肠道消化，将经胃液消化后的微球过滤，冷冻干燥后，置于环境扫描电子显微镜下进行观察。