一种柽柳组织培养快速繁殖的方法

摘要

本发明涉及林业科学中的林木组织培养育苗技术领域，具体涉及一种柽柳组织培养快速繁殖的方法。无菌苗获得：培养基中含有6-BA、IBA、GA、蔗糖、琼脂；继代培养：无菌苗接种于继代培养基培养，培养基中含ZT、IBA、蔗糖、琼脂，获得丛生芽；生根培养：丛生芽接种于含IBA、NAA、GA、蔗糖、琼脂的生根培养基培养，得到生根组培苗；炼苗移栽。此繁殖方法，繁殖系数高，繁殖周期较短，获得的苗木壮、根系较多，移栽成活率达96%以上。省略了常规方法中的壮苗培养步骤，提高了繁殖效率，使柽柳组织培养快速繁殖技术从实验室走向生产，实现了柽柳组织培养苗木规模化生产，为柽柳的快繁推广提供了技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及林业科学中的林木组织培养育苗技术领域，涉及一种木本植物组织培养快速繁殖方法，具体涉及一种柽柳组织培养快速繁殖的方法。

背景技术

柽柳（TamarixchinensisLour.），又称中国柽柳，为柽柳科（Tamaricaceae）柽柳属（TamarixL.）中典型的多年生泌盐性木本盐生植物，喜生于河流冲积平原，海滨、滩头、潮湿盐碱地和沙荒地。其枝、叶、花具有非常高的观赏价值，且具有抗旱、抗盐碱、耐水湿等特性（张胜利等，2015），适应性强，不仅是优良的防风固沙植物，同时还是水土保持树种、盐碱地改良及绿化造林树种，也是我国造林树种中大家公认的头号耐盐树种，植株可耐2.4％的盐水浇灌、在土壤含盐为25g/kg的滨海盐渍土上能够正常生长（张立宾等，2008），而且还是良好的薪炭、编制和建筑用材；嫩枝及叶药用，能解表利尿、祛风湿、治疗麻疹，其社会经济和生态效益潜力巨大、开发应用前景十分广阔。但其当前繁殖方式主要以扦插为主，繁殖规模较小、繁殖系数较低，且受季节性限制，苗木生长参差不齐；目前虽然有组织培养繁育的相关报道，但多数仅限于科学研究而未应用于生产，影响了柽柳的推广应用。

目前有少量论文及专利对柽柳组织培养相关技术环节进行了研究，其公开的柽柳及近缘种短穗柽柳（T.laxaWilld.）组织培养技术中，几乎所有文献资料（程磊等2001；李利红等2005；韦小敏等2006ab；王鹏等2007；张永才等2007；乔梦吉等2007；孙旭旭等2009）均将柽柳及近缘种组织培养繁殖技术分为无菌苗的获取、启动培养（有的将与无菌苗获取过程结合称为初代培养）、增殖（继代）培养、生根培养及移栽等五个环节。仅个别文献资料（韩琳娜等2010、刘伯燕等2015）在概念上探讨了缩短培养周期的一步成苗组织培养法，但其方法在不违背植物生长规律的情况下，无法回避无菌苗获取（初代培养）、增殖（继代）、及生根培养等环节，其缩短的培养时间有限、节约成本有限，如果大量缩短时间，苗木生长量、扩繁量必然较小，进而导致其繁殖系数低、苗木生长受限，协调各阶段状态下的苗木繁殖效率也无法达到最佳，综合效益无法最大化。省略掉增殖（继代）培养环节，会大幅降低繁殖系数。当前现有专利（刘伯燕等2015）缺少炼苗移栽环节，无法很好地指导生产。

自2001年至今，所有公开的柽柳组织培养文献资料中，除个别研究个例（孙旭旭等2009）使用1/2MS外，基础培养基均为MS培养基，各培养阶段所使用激素限于a-萘乙酸（NAA）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、激动素（Kt），个别研究（孙旭旭等2009）中使用赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）。其中启动培养（初代培养）多使用NAA、6-BA等，增殖（继代）培养多使用6-BA、Kt等，生根培养中NAA、6-BA、Kt三种激素均有使用。生长激素有多种，且功能清楚，并具有很多的实践报道。但在柽柳组织培养技术研究的十多年中，仅仅局限在少量的激素范围内，未见有其他激素的使用，形成了固定模式下的重复性研究，没有大的创新，进而可能是导致无法突破柽柳组织培养快繁瓶颈、无法应用于生产的主要原因。其他常用激素，如吲哚丁酸（IBA）可促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进不定根的形成；玉米素（ZT）不仅能促进侧芽生长、刺激细胞分化，促进愈伤组织发芽，还能抑制过度根部形成，高浓度的玉米素还能产生不定芽分化。

所报道文献资料中，多使用升汞消毒，不仅易引起无菌苗褐化，而且易给工作人员造成健康危害、给环境造成污染。因此，十分必要研发一种使用清洁型消毒剂避免引起柽柳褐化现象、创新型组织培养配方的柽柳组织培养快速繁殖技术，促进柽柳工厂化生产、规模化推广引用。

发明内容

为了解决以上现有技术中柽柳组织培养快繁瓶颈、无法应用于生产的问题，本发明提供了一种柽柳组织培养快速繁殖的方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种柽柳组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：

（1）无菌苗获得（初代培养）

鲜嫩芽经过处理和杀菌，接于培养基中进行培养，培养基组成为MS培养基中加入6-BA1.0～2.0mg/L、IBA0.05～0.15mg/L、GA0.05～0.15mg/L、蔗糖20～30g/L、琼脂7g/L，pH值调5.8～6.0，培养条件为：在25±2℃，光照12～16h，光强2000～3000lx条件下培养15～20d，获得无菌苗；

（2）继代培养

在无菌条件下将获得的无菌苗接种于继代培养基上进行培养，培养基配方为MS培养基中加入ZT0.3～0.8mg/L、IBA0.05～0.15mg/L、蔗糖20～30g/L、琼脂7g/L，pH值调5.8～6.0，在25±2℃，光照12～16h，光强3000lx条件下培养20d，获得丛生芽；

（3）生根培养

在无菌条件下将丛生芽接种于生根培养基上，培养基配方为12MS中加入IBA0.2～0.5mg/L、NAA0.05～0.1mg/L、GA0.05～0.1mg/L、蔗糖15～20g/L、琼脂7g/L，pH值调5.8～6.0，在25±2℃，光照12～16h，光强3000lx条件下培养30～50d，得到生根组培苗；

（4）炼苗移栽

将瓶生根完好的柽柳移栽到拱棚中，用遮阳网遮阳，2d后松动瓶盖但不打开瓶盖保持2d，不出现萎蔫就将瓶盖打开五分之一的缝，之后观察叶片生长情况；待瓶盖完全打开且叶片生长旺盛时，将柽柳从瓶内移出，洗去根部培养基，放在多菌灵50%可湿性粉剂5g/L溶液中浸泡45s左右，移栽到装好基质的穴盘中每天浇水使湿度达到90%，缓冲7d，适应自然温度和湿度，15d，待新根长出后移栽到大田。

所述的方法，优选步骤（1）中培养基配方为MS培养基中加入6-BA1.0mg/L、IBA0.1mg/L、GA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L，培养条件为：在25±2℃，光照14h，光强3000lx条件下培养18d。

所述的方法，优选步骤（2）中培养基配方为MS培养基中加入ZT0.5mg/L、IBA0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L，在25±2℃，光照14h，光强3000lx条件下培养20d。

所述的方法，优选步骤（3）中培养基配方为12MS中加入IBA0.5mg/L、NAA0.1mg/L、GA0.1mg/L、蔗糖15g/L、琼脂7g/L，在25±2℃，光照14h，光强3000lx条件下培养45d。

所述的方法，优选步骤（1）中鲜嫩芽经过处理和杀菌的步骤如下：

将鲜嫩芽放在蒸馏水里面浸泡30min，浸泡时加少量洗衣粉和两滴吐温，30min后用自来水冲洗1～2h，把外植体放到接种台上接种，接种前用75%酒精擦拭接种台，开紫外30min，在接种台内将柽柳外植体用无菌水冲洗3～5次，之后用75%酒精浸泡30S，然后用无菌水冲洗3次，再用2%次氯酸钠杀菌3～9min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分。

所述的方法，优选步骤（4）中基质为草炭：蛭石体积比3：1。

本发明的有益效果：

1）利用环境有好的次氯酸钠消毒，克服外植体消毒褐化问题；

2）并研制出创新型快速继代培养及生根培养培养基配方，制定了简单易行的炼苗移栽方案，省略了常规方法中的壮苗培养步骤，提高了繁殖效率，使柽柳组织培养快速繁殖技术从实验室走向生产，实现了柽柳组织培养苗木规模化生产，为柽柳的快繁推广提供了技术支持。

3）此繁殖方法，繁殖系数高，繁殖周期较短，获得的苗木壮、根系较多，移栽成活率达96%以上。

附图说明

图1为芽分化，

图2为芽增殖，

图3-1为侧面观生根情况，图3-2为瓶底观生根情况，

图4为闭瓶炼苗，

图5-1为移栽，图5-2为移栽成活，

图6为规模化快繁。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1初代培养基的选择

【1】取材：柽柳外植体取材于大田中刚生长出来的鲜嫩枝芽，取材回来后，选择鲜嫩芽作为试验材料，

【2】试验材料前处理：放在蒸馏水里面浸泡0.5h，浸泡时加少量洗衣粉和两滴吐温，随后用自来水冲洗2h，冲洗后把外植体放到接种台上接种，

【3】接种前准备：接种前，用75%酒精擦拭接种台，开紫外0.5h。将柽柳外植体用无菌水冲洗3次，之后用75%酒精浸泡30S，然后用无菌水冲洗3次，

【4】次氯酸钠杀菌：用2%次氯酸钠杀菌处理3min、5min、7min、9min，随后接于以MS培养基为基础的各种培养基上，发现，上述各种培养基中，杀菌9min情况下，柽柳外植体稍微变色，其余均正常，将外植体放入组培室培育，每天观察长势以及长菌情况，7min以上抑菌效果均较好，以7min处理为最好，

【5】培养基筛选：以次氯酸钠杀菌7min，随后将处理好的外植体接于以MS培养基为基础的10种培养基（A-J）上（见表1），各培养基pH5.8。将外植体放入组培室培育，每天观察长势。具体如下表1。柽柳外植体在大部分培养基中均启动，但是其启动时间、腋芽生长速度、生长势存在差异，部门腋芽出现一定的变异。以（D）MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.1mg/L)+GA(0.1mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂（7g/L）培养基中柽柳外植体长势最好。

表1柽柳外植体在初代培养基上的生长表现

结论:初代培育中，培养基为MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.1mg/L)+GA(0.1mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂（7g/L），酒精消毒30min，次氯酸钠消毒7min，外植体的生长最好。现在实验室柽柳有4700瓶，约19000棵苗。柽柳的初代继代配方已完全成熟，初代配方为MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.1mg/L)+GA(0.1mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂（7g/L）。

实施例2：继代培养基的选择

获得无菌外植体后，换用继代培养基（见表2）上进行继代培育，20d转苗一次，柽柳芽分化、枝条节间长短、长势等情况均存在差异，见表2。

表2柽柳无菌苗在继代培养基上的表现

结论：在继代中，E培养基为MS+玉米素ZT(0.5mg/L)+IBA(0.1mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂（7g/L）更为适合柽柳的生长分化。继代培养基为MS+玉米素ZT(0.5mg/L)+IBA(0.1mg/L)++蔗糖（30g/L）+琼脂（7g/L）。

实施例3：生根培养基的选择

柽柳组织培养最关键的就是摸好生根配方，在生根培养中，采用了以MS、1/2MS培养基为基础的生根配方，其主根、侧根等生根情况存在很大差异，见表3。以P培养基12MS+IBA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+GA(0.1mg/L)+蔗糖（15g/L）+琼脂（7g/L），pH=5.8生根效果最好。

表3柽柳生根培养情况

综上可以得出柽柳组织培养完整的配方：

初代：MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.1mg/L)+GA(0.1mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂（7g/L），pH=5.8

继代：MS+(0.5mg/L)+IBA(0.1mg/L)++蔗糖（30g/L）+琼脂（7g/L），pH=5.8

生根：12MS+吲哚丁酸IBA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+GA(0.1mg/L)+蔗糖（15g/L）+琼脂（7g/L），pH=5.8

实施例4：炼苗移栽

（1）在3.21将100瓶生根完好的柽柳移栽到自制的小拱棚中，用遮阳网遮阳，

（2）两天后轻轻松动瓶盖但不打开瓶盖保持两天左右，如果两天后叶片不出现萎蔫就将瓶盖打开五分之一的小缝，之后观察叶片生长情况，

（3）待瓶盖完全打开且叶片生长旺盛时（这个过程大约需要一周左右），将柽柳从瓶内移出，洗去根部培养基，放在多菌灵50%可湿性粉剂5g/L溶液中浸泡45s左右，移栽到装好基质的穴盘中，移到穴盘中要注意保持湿度，每天浇水使湿度达到90%，注意，往叶片上浇水而不要是根部过湿。柽柳组培苗移栽生长情况见表4，

（4）缓冲7d左右，让柽柳苗适应自然温度和湿度，15d左右，待新根长出就可以移到大田土里，并做好苗期管理，整个组培过程就算完成了。

表4柽柳组培苗移栽生长情况

实施例5：

（1）无菌苗获得（初代培养）

选择鲜嫩芽作为实验材料，放在蒸馏水里面浸泡30min，浸泡时加少量洗衣粉和两滴吐温，30min后用自来水冲洗2h，把外植体放到接种台上接种，接种前用75%酒精擦拭接种台，开紫外30min，在接种台内将柽柳外植体用无菌水冲洗3次，之后用75%酒精浸泡30S，然后用无菌水冲洗3次，再用2%次氯酸钠杀菌7min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，最后接于MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.1mg/L)+GA(0.1mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂（7g/L）培养基进行培养，pH值调5.8，培养条件为：在25±2℃，光照14h，光强3000lx条件下培养18d，获得无菌苗；

（2）增殖（继代）培养

在无菌条件下将获得的无菌苗接种于MS+ZT(0.5mg/L)+IBA(0.1mg/L)+蔗糖（30g/L）+琼脂（7g/L）快繁培养基上，pH值调5.8，在25±2℃，光照14h，光强3000lx条件下培养20d，获得大量丛生芽；

（3）生根培养

在无菌条件下将丛生芽分段接种于12MS+IBA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+GA(0.1mg/L)+蔗糖（15g/L）+琼脂（7g/L）生根培养基上，pH值调5.8，在25±2℃，光照14h，光强3000lx条件下培养45d，得到生根组培苗；

（4）炼苗移栽

将瓶生根完好的柽柳移栽到拱棚中，用遮阳网遮阳，2d后轻轻松动瓶盖但不打开瓶盖保持2d左右，此时若不出现萎蔫就将瓶盖打开五分之一的小缝，之后观察叶片生长情况；待瓶盖完全打开切叶片生长旺盛时（约7d），将柽柳从瓶内移出，洗去根部培养基，放在多菌灵50%可湿性粉剂5g/L溶液中浸泡45s左右，移栽到装好基质的穴盘中（基质为草炭：蛭石体积比3：1），移到穴盘中要注意保持湿度，每天浇水使湿度达到90%，缓冲7d，逐步适应自然温度和湿度，15d，待新根长出后移栽到大田。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。