一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法

摘要

本发明公开了一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法，是将测组织样品经预处理后，提取上清液加入超滤管中，超滤管放入离心机中离心，离心出的液体取出用氮气吹干，流动相定容，供仪器测定分析。该方法可同时检测10喹诺酮类药物残留，具有较好的回收率、稳定性和重复性。大分子杂质被截留，因此大大降低了基质效应。该方法完全可以满足动物源性食品中10种喹诺酮的日常检测要求。

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法。

背景技术

喹诺酮类（Quinolones，QNs）药物是一类抗菌作用强、抗菌谱广的人工合成抗菌药，广泛应用于临床诊断、动物疾病预防及促生长。QNs在动物源食品中的过量或不当使用会引起食用者产生潜在“三致”（致癌、致畸、致突变）作用，诱导致病菌产生耐药性，从而威胁人类健。因此，许多国家和组织都限制其使用并制订出相应的最高残留限量（MRLs）：美国禁止在食用动物养殖中使用FQNs；日本批准使用的QNs仅有恩诺沙星、二氟沙星、奥比沙星、达氟沙星、马波沙星、氧氟沙星和恶喹酸。欧盟规定动物肌肉、肝脏和肾脏中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星（环丙沙星与恩诺沙星量之和）、保沙星、沙拉沙星等的MRLs为0.01mg-1.9mg，并在NO.508/1999号法规中对牛奶中单诺沙星、氟甲喹、马波沙星、恩诺沙星和环丙沙星的最高残留限量作了规定；世界食品法典委员会和世界各国对水产品中QNs残留均有严格的限量要求，国际贸易中也对其限量有严格规定；我国于2002年规定了环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸和氟甲喹等7种QNs药物在动物肌肉组织中的最高残留限量为10~500μg/kg。因此，对动物源食品中QNs残留量的检测尤为重要。

目前QNs的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、高效液相-串联质谱法（HPLC-MS/MS）、酶联免疫法（ELISA）等。其中HPLC-MS/MS法灵敏度高、检测限低、测定种类多、集高效分离和结构鉴定于一体，该仪器在我国检测机构中的配置也较为普遍，已成为复杂混合物中痕量组分定性和定量的有力工具，已经制定了相关国家标准。检测包括样品前处理和仪器分析两部分，而样品前处理技术严重落后于上机检测技术。样品前处理常用的有液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）；LLE是净化QNs的基本方法，但存在操作费时、消耗高纯溶剂多以及样品易乳化等；SPE消耗溶剂少、不产生乳化现象，是净化QNs最常用的方法，但目前市场上商品化的固相萃取柱一般只能一次性使用，价格较高，从而导致了高成本。另外还有基质固相分散萃取、超临界流体萃取、固相微萃取、加速溶剂萃取和分子印迹固相萃取等较新的方法也应用至QNs残留分析，但都处于研究阶段，技术尚不成熟。

本申请的发明人致力于动物源食品中喹诺酮类残留检测的研究，发明专利申请CN104316615A（膜透析-高效液相色谱串联质谱法测定动物源食品中7种喹诺酮残留的方法）中采用膜透析处理样品，在5.0、10.0、25.0μg/kg3个浓度添加水平平均回收率在65.5%～84.1%之间,变异系数在4.3%～11.6%之间，样品处理简单、灵敏度高，重现性好，经济，可用于动物源食品中7喹诺酮类残留的检测确证。但是采用膜透析法处理样品耗时长（透析时间≥6h），不利于样品的快速检测。超滤（ultrafiltration，UF）主要为筛分机理，通常为不对称结构，膜孔径的大小和膜表面的性质起着不同的截留作用。其过滤粒径介于微滤和反渗透之间，约2~100nm，操作压力在0.1~0.5Mpa。其出现为动物性食品中农兽药残留检测的前处理方法的改进提供了新的契机。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法，采用超滤法对样品进行前处理，仪器分析采用HPLC-MS/MS，可同时检测动物源性食品中恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIP)、恶喹酸(OXO)、沙拉沙星(SAR)、双氟沙星(DIF)、氟甲喹(FLU)、萘啶酸(NDL)、氧氟沙星（OFL）、诺氟沙星（NOR）、丹诺沙星（DAN）10种喹诺酮类药物。

本发明的技术方案是：一种动物组织中喹诺酮类药物残留的检测方法，其包括步骤：将待测组织样品经预处理后，提取上清液加入超滤管中，超滤管放入离心机中离心，离心出的液体取出用氮气吹干，流动相定容，供仪器测定分析。

其中，所述预处理步骤为：准确称取5.00g粉碎好的样品，加入20mL1%乙酸酸化乙腈，混匀，超声20min，加烘好后的无水硫酸钠5g混匀，8000r/min的速率离心5min；

所述超滤管为50mL，截留分子量为3kD；

所述离心为低温离心，优选5000r/min离心10min。

本发明仪器测定分析采用HPLC-MS/MS，其液相色谱柱采用通用性，填料选自十八烷基键合相硅胶，流动相为0.1%甲酸溶液A-乙腈B，通过调整流动相比例和梯度均能达到满意的峰形和分离效果。采用WatersXbridgeC18,3.5μm2.1×150mm色谱柱时，流动相：0.1%甲酸溶液A-乙腈B，流速：0.2mL/min，梯度洗脱：t=0min,80%A,20%B；t=1min,80%A,20%B；t=6min,40%A,60%B；t=10min,20%A,80%B；t=14min,20%A,80%B；t=14.1min，80%A,20%B；t=20min,80%A,20%B；质谱条件为：电喷雾电离源正离子扫描(ESI+)，多反应监测模式(MRM)；电喷雾电压:5.0kV；离子源温度:500℃，雾化气压力(GSl):70psi；辅助气流速(GS2):55psi，气帘气压力(CUR):20psi；碰撞室入口电压(EP):10V；碰撞室出口电压(CXP):10V，监测分析物的离子对进行药物残留确证分析。

本发明采用50mL，截留分子量3kD的超滤管，10种分子量在200-400间的喹诺酮经1%乙酸酸化乙腈提取，在离心力作用下均可从超滤管中被快速“过滤”出来，而被截留的大分子物质在离心时不会损坏超滤膜。该前处理方法可同时提取10种喹诺酮，应用本发明的HPLC-MS/MS测定，平均回收率在71.4%～85.9%之间,变异系数在3.9%～10.7%之间，具有较好的回收率、稳定性和重复性。另外，大分子杂质被截留，因此大大降低了基质效应。该方法完全可以满足动物源性食品中10种喹诺酮的日常检测要求。

附图说明

图1-图10为多反应监测的特征离子色谱图。

具体实施方式

1.样品的前处理

准确称取5.00g粉碎好的样品，加入20mL1%乙酸酸化乙腈，混匀，超声20min，加烘好后的无水硫酸钠5g混匀，8000r/min的速率离心5min，取12mL左右上清液沿管壁慢慢加入超滤管中，5000r/min离心10min，将离心出的液体取出10mL用氮气吹干，流动相定容成1.0mL，供HPLC-MS/MS测定分析。

2.液相色谱条件

本实施例采用的色谱柱为WatersXbridgeC18,3.5μm2.1×150mm，AgilentZorbaxSB-C18、XDB-C18等十八烷基键合相硅胶也可以满足分离要求。

进样量：20μL；流动相：A:0.1%甲酸溶液；B:乙腈；流速：0.2mL/min；梯度洗脱条件见表1。

表1液相色谱梯度洗脱程序

时间Time(min)A(%)B(%)080201.080206.0406010.0208014.0208014.1802020.08020

3质谱条件

电喷雾电离源正离子扫描(ESI+)；多反应监测模式(MRM)；电喷雾电压:5.0kV；离子源温度:500℃；雾化气压力(GSl):70psi；辅助气流速(GS2):55psi；气帘气压力(CUR):20psi；碰撞室入口电压(EP):10V；碰撞室出口电压(CXP):10V。监测离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)如表2所示。

表210种喹诺酮优化的质谱分析参数

*定量离子

4方法学验证

4.1标准曲线

制备不含待测组分的空白基质溶液，配制成一系列基质标准工作溶液，浓度分别为5.0、10.0、25.0、50.0、100.0μg/kg上机测定，以峰面积（Y轴）对相应的喹诺酮的浓度（X轴）绘制标准曲线。结果表明，喹诺酮在5.0~100μg/kg（相当于样品）浓度范围内，10种喹诺酮的标准校正曲线的线性良好,相关系数r均大于0.99（见表3）。

4.2方法的检出限和定量限

方法的检出限（LOD）是以空白样品基质稀释标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪比S/N=3和样品处理过程的稀释倍数计算得出。定量限（LOQ）是样品基质加标标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪比S/N=10和样品处理过程的稀释倍数计算得出。各种喹诺酮药物的定量限为0.49-2.59μg/kg。

表310种喹诺酮的线性回归方程、相关系数

4.3回收率和精密度

选用不含分析物的空白样品,分别添加5.0、10和50μg/kg3个浓度水平的混合标准溶液，按前处理方法进行处理，做回收率实验，每个水平重复6次，测精密度,结果见表4-5，4-6，4-7。测得平均回收率在71.4%～85.9%之间,变异系数在3.9%～10.7%之间。说明该方法具有较好的回收率、稳定性和重复性，完全可以满足动物源性食品中10种喹诺酮的日常检测要求。

表4猪肝中10种喹诺酮的平均回收率和变异系数(n=6)

表5猪肾中10种喹诺酮的平均回收率和变异系数(n=6)

表6猪肉中10种喹诺酮的平均回收率和变异系数(n=6)

表7牛肉中10种喹诺酮的平均回收率和变异系数(n=6)

表8鱼肉中10种喹诺酮的平均回收率和变异系数(n=6)

表9鸡肉中10种喹诺酮的平均回收率和变异系数(n=6)

5.实际样品

从市面上购得猪肝、猪肾、猪肉、鸡肉、牛肉、鱼肉等15份以及本实验室保留的阳性样品3份分别用本方法和《GBT21312-2007动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱质谱法》进行检测，除本实验室的阳性样品外，其余样品皆未检出，本实验室的阳性样品分别检出恩诺沙星（101.0ug/kg）、环丙沙星（36.5ug/kg）和诺氟沙星（18.6ug/kg），结果数据的偏差范围在10%以内。

本研究通过对超滤管体积、截留分子量的选择、离心时间的确定等，建立了超滤管-高效液相色谱-质谱的检测方法，同时对10种喹诺酮进行了检测，对猪肉、鸡肉、牛肉、鱼肉、猪肝、猪肾等动物组织进行了添加分析，结果表明：该方法定量准确、灵敏度高、重现性好、基质效应小，能满足这10种喹诺酮类药物的残留检测任务，但QNs的种类还有很多，其它种类的QNs值得进一步研究。