一种辅助鉴定油菜渐渗后代C基因组的成套引物及其应用

摘要

本发明公开了一种辅助鉴定油菜渐渗后代C基因组的成套引物及其应用。本发明的成套引物由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7组成。通过实验证明：本发明的7对引物可以用来鉴定油菜渐渗后代是否含有C基因组，且具有准确、快速、稳定、操作简单、低成本等特点，为油菜渐渗体系快速监测及安全评估体系、油菜品种选育及野芥菜防治提供了便捷的技术平台，应用前景良好。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种辅助鉴定油菜渐渗后代C基因组的成套 引物及其应用。

背景技术

油菜是一种重要的油料作物，在国内栽培很广。甘蓝型油菜(B.napus,AACC， 2n＝38)由二倍体甘蓝(B.oleracea，CC，2n＝18)和芸薹或称芜菁(B.campetris/rapa， AA，2n＝20)杂交并经长期进化而形成；芥菜型油菜(B.juncea，AABB，2n＝36)则 由具有BB基因组的黑芥(B.nigra，2n＝16)与芸薹杂交进化而成。甘蓝型油菜、二 倍体甘蓝、芸薹、芥菜型油菜和黑芥5个种之间互有亲缘关系，可进行近缘种杂交。 Truco等(1996)认为芸薹属A、B、C基因组有着共同的起源。其中，A与C的同源 性最高，B与C次之，A与B最低。这种同源性的差异在杂交亲和力上则表现为油菜 与芸薹的亲和力最高。

甘蓝型油菜和芥菜型油菜是芸薹属中两个最重要的品种。甘蓝型油菜(含有C基 因组)是常异花授粉植物，可以与多种近缘种群产生杂交，易向亲和性好的野生近缘 种发生基因流动。芥菜型油菜(不含有C基因组)具有许多甘蓝型油菜没有的优良特 性，如分枝发达、抗裂荚、抗病、含油量高等。野芥菜是我国农田、荒地普遍存在的 一种重要杂草，种类繁多，危害小麦、青稞、油菜、蚕豆和豌豆等多种作物甚至还危 害夏秋季作物。如果甘蓝型油菜栽培种能通过花粉传播流动到野芥菜中，并能提高野 芥菜的适合度，将可能增加野芥菜的生存竞争力，而为有效防治野芥菜带来更大困难。 鉴于芸薹属近缘种之间的基因渐渗和基因流，在油菜品种选育和野芥菜防治过程中， 分析甘蓝型油菜和芥菜渐渗后代的C基因组成分具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后代是否含有C基因组 的成套引物。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后代是否含有C基因组的成套引物由引物 对(1)-(7)组成：

(1)为由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成 的引物对1；

(2)为由SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成 的引物对2；

(3)为由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成 的引物对3；

(4)为由SEQ ID No.7所示的单链DNA和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成 的引物对4；

(5)为由SEQ ID No.9所示所示的单链DNA和SEQ ID No.10所示的单链DNA 组成的引物对5；

(6)为由SEQ ID No.11所示的单链DNA和SEQ ID No.12所示的单链DNA组 成的引物对6；

(7)为由SEQ ID No.13所示的单链DNA和SEQ ID No.14所示的单链DNA组 成的引物对7。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后代是否含有C基因组 的成套PCR试剂。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后代是否含有C基因组的成套PCR试剂 由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6和 PCR试剂7组成；

所述PCR试剂1包括上述成套引物中的引物对1；

所述PCR试剂2包括上述成套引物中的引物对2；

所述PCR试剂3包括上述成套引物中的引物对3；

所述PCR试剂4包括上述成套引物中的引物对4；

所述PCR试剂5包括上述成套引物中的引物对5；

所述PCR试剂6包括上述成套引物中的引物对6；

所述PCR试剂7包括上述成套引物中的引物对7。

上述成套PCR试剂中，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物 对4、所述引物对5、所述引物对6和所述引物对7中的各条引物的终浓度均为 10umol/L。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述成套引物或上述成套PCR试剂的试剂 盒。

上述成套引物或上述成套PCR试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后 代是否含有C基因组中的应用也属于本发明的保护范围。

上述成套引物或上述成套PCR试剂或上述试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定油菜渐 渗后代是否含有C基因组的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述成套引物或上述成套PCR试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后 代为甘蓝型油菜还是芥菜型油菜中的应用也属于本发明的保护范围。

上述成套引物或上述成套PCR试剂或上述试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定油菜渐 渗后代为甘蓝型油菜还是芥菜型油菜的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后代是否含有C基因组 的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后代是否含有C基因组的方法包括如下步 骤：

用上述成套引物中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物 对6和引物对7分别对待测油菜渐渗后代进行PCR扩增，分别得到所述待测油菜渐渗 后代的7对引物对的PCR扩增产物；检测所述7对引物对的PCR扩增产物的大小；

若所述7对引物对的PCR扩增产物满足如下1)-7)至少一种条件：

1)所述引物对1对应的PCR扩增产物含有大小为333bp的片段；

2)所述引物对2对应的PCR扩增产物含有大小为303bp的片段；

3)所述引物对3对应的PCR扩增产物含有大小为157bp的片段；

4)所述引物对4对应的PCR扩增产物含有大小为295bp的片段；

5)所述引物对5对应的PCR扩增产物含有大小为333bp的片段；

6)所述引物对6对应的PCR扩增产物含有大小为168bp的片段；

7)所述引物对7对应的PCR扩增产物含有大小为194bp的片段；

则所述待测油菜渐渗后代含有或候选含有C基因组；

若所述7对引物对的PCR扩增产物均不满足上述1)-7)任一种，则所述油菜渐 渗后代不含有或候选不含有C基因组。

本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后代为甘蓝型油菜还 是芥菜型油菜的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后代为甘蓝型油菜还是芥菜型油菜的方 法包括如下步骤：

用上述成套引物中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物 对6和引物对7分别对待测油菜渐渗后代进行PCR扩增，分别得到所述待测油菜渐渗 后代的7对引物对的PCR扩增产物；检测所述7对引物对的PCR扩增产物的大小；

若所述7对引物对的PCR扩增产物满足如下1)-7)至少一种条件：

1)所述引物对1对应的PCR扩增产物含有大小为333bp的片段；

2)所述引物对2对应的PCR扩增产物含有大小为303bp的片段；

3)所述引物对3对应的PCR扩增产物含有大小为157bp的片段；

4)所述引物对4对应的PCR扩增产物含有大小为295bp的片段；

5)所述引物对5对应的PCR扩增产物含有大小为333bp的片段；

6)所述引物对6对应的PCR扩增产物含有大小为168bp的片段；

7)所述引物对7对应的PCR扩增产物含有大小为194bp的片段；

则所述待测油菜渐渗后代为或候选为甘蓝型油菜；

若所述7对引物对的PCR扩增产物均不满足上述1)-7)任一种，则所述油菜渐 渗后代为或候选为芥菜型油菜。

上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测油菜渐渗后代的基因组DNA。

上述方法中，所述引物对1进行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物对2进 行PCR扩增的退火温度为55℃；所述引物对3进行PCR扩增的退火温度为50℃； 所述引物对4进行PCR扩增的退火温度为50℃；所述引物对5进行PCR扩增的退火 温度为50℃；所述引物对6进行PCR扩增的退火温度为50℃；所述引物对7进行 PCR扩增的退火温度为55℃。

鉴定或辅助鉴定油菜渐渗后代是否含有C基因组的物质在鉴定油菜渐渗后代为甘 蓝型油菜还是芥菜型油菜中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明以基因组组成不同的4种芸薹属植物为实验材料，筛选出了分别位于不同 C染色体上、鉴别效率高、特征带清晰和带型稳定的7对引物对。通过实验证明：本 发明的7对引物对可以用来鉴定油菜渐渗后代C基因组组成情况，且具有准确、快速、 稳定、操作简单、低成本等特点，为油菜渐渗体系快速监测及安全评估体系、油菜品 种选育及野芥菜防治提供了便捷的技术平台，应用前景良好。

附图说明

图1为本发明的7对引物对对7种供试材料的扩增结果。图1A为Na12C08引物 对的扩增结果；图1B为Ol10B04引物对的扩增结果；图1C为Ol13C03引物对的扩 增结果。其中Marker:1,16,27,42；甘蓝型油菜Westar:2,3,28,29；野芥菜:4,5,30,31； 甘蓝型油菜GT1:6-10；杂交种F₁:11～15；BC₁:17～21；BC₂:22～26；BC₃:32～36；BC₄: 37～41；BC₅:43～47。

图2为本发明的7对引物对对7种供试材料的扩增结果。图2A为CB10502引物 对的扩增结果；图2B为Na12F03引物对的扩增结果；图2C为CB10179引物对的扩 增结果。其中，Marker:1,16,27,42；甘蓝型油菜Westar:2,3,28,29；野芥菜:4,5,30, 31；甘蓝型油菜GT1:6-10；杂交种F₁:11～15；BC₁:17～21；BC₂:22～26；BC₃:32～36； BC₄:37～41；BC₅:43～47。

图3为本发明的83b1引物对对7种供试材料的扩增结果。其中，Marker:1,26； 甘蓝型油菜Westar:2,3,27,28；野芥菜:4,5,29,30；甘蓝型油菜GT1:6-10；F1:11～15； BC1:16～20；BC2:21～25；BC3:31～35；BC4:36～40；BC5:41～45。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的黄金小白菜(B.rapa,AA)、香港卷心菜(B.oleracea,CC)、甘蓝 型油菜Westar(B.napus,AACC)和野芥菜(B.juncea,AABB)均在文献“Wang YH,Wei  W,Kang DM,Ma KP.Seed Coat Microsculpturing Is Related to Genomic Components in  Wild Brassica juncea and Sinapis arvensis.PLOS ONE,2013,8(12):1-10.”中公开过，公 众可从中国科学院植物研究所获得。

油菜渐渗后代是指油菜与芥菜的杂交子代与母本芥菜不断回交获得的后代。

实施例1、鉴定油菜渐渗后代C基因组的引物的获得

1、鉴定油菜渐渗后代C基因组的引物的获得

分别以基因组组成不同的4种芸薹属植物(表1)：黄金小白菜(B.rapa,AA)、 香港卷心菜(B.oleracea,CC)、甘蓝型油菜Westar(B.napus,AACC)和野芥菜(B.juncea, AABB)的基因组DNA为模板，采用芸薹属植物的相关141对引物对进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物。

表1、本发明中采用的试验材料

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，最后选出分别位于不同C染色体上、 鉴别效率高、特征带清晰、带型稳定的7对引物对：

Na12C08引物对(引物对1)为：上游5’-CAAACGATTTGTTTACCCG-3’(序列 1)；下游5’-CGTGTAGGGTGATCTAGATGGG-3’(序列2)；

Ol10B04引物对(引物对2)为：上游5’-ATCTTCCTCCACGTTCATGC-3’(序 列3)；下游5’-CGAATCTTGAAGTTCTGACCC-3’(序列4)；

Ol13C03引物对(引物对3)为：上游5’-GATCGGAGATGCGATGAGAG-3’(序 列5)；下游5’-GCATGCACCAGTGAAAAACTC-3’(序列6)；

CB10502引物对(引物对4)为：上游5’-TTGAAGAGTGGGGATTCA-3’(序列 7)；下游5’-GGTGAGCTTCTTCCTTCC-3’(序列8)；

Na12F03引物对(引物对5)为：上游5’-GGCGACATAGATTTGAACCG-3’(序 列9)；下游5’-TCCACTTTCTCTCTCTTCCCC-3’(序列10)；

CB10179引物对(引物对6)为：上游5’-ACGAAGCAAATAACAAAGA-3’(序 列11)；下游5’-GAAACCCGAAAGCCTAAG-3’(序列12)；

83b1引物对(引物对7)为：上游5’-GCCTTTCTTCACAACTGATAGCTAA-3’(序 列13)；下游5’-TCAGGTTGCCTCGTTGAGTTC-3’(序列14)。

2、鉴定油菜渐渗后代C基因组的引物的验证

分别以黄金小白菜(B.rapa,AA)、香港卷心菜(B.oleracea,CC)、甘蓝型油菜 Westar(B.napus,AACC)和野芥菜(B.juncea,AABB)的基因组DNA为模板，分别 采用7对引物对进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物，并对PCR扩增产物进行测 序。

结果如表2所示：从表2中可以看出：7对引物对均可在含有C基因组的香港卷 心菜(CC)和甘蓝型油菜Westar(AACC)中检测到相应的扩增产物，而在不含有C 基因组的黄金小白菜(AA)和野芥菜(AABB)中检测不出相应的扩增产物。

上述试验结果表明：本发明的7对引物对可按照如下方法检测待测油菜渐渗后代 是否含有C基因组以及油菜渐渗后代属于甘蓝型油菜还是芥菜型油菜：

用引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7分 别对待测油菜渐渗后代进行PCR扩增，分别得到待测油菜渐渗后代的7对引物对的 PCR扩增产物；检测待测油菜渐渗后代的7对引物对的PCR扩增产物的大小；

若7对引物对的PCR扩增产物满足如下1)-7)至少一种条件：

1)引物对1对应的PCR扩增产物含有大小为333bp的片段；

2)引物对2对应的PCR扩增产物含有大小为303bp的片段；

3)引物对3对应的PCR扩增产物含有大小为157bp的片段；

4)引物对4对应的PCR扩增产物含有大小为295bp的片段；

5)引物对5对应的PCR扩增产物含有大小为333bp的片段；

6)引物对6对应的PCR扩增产物含有大小为168bp的片段；

7)引物对7对应的PCR扩增产物含有大小为194bp的片段；

则待测油菜渐渗后代含有或候选含有C基因组，为或候选为甘蓝型油菜；

若7对引物对的PCR扩增产物均不满足上述1)-7)任一种，则油菜渐渗后代不 含有或候选不含有C基因组，为或候选为芥菜型油菜。

表2、本发明中利用试验材料进行引物筛选的结果

注：“+”表示出现扩增产物；“-”表示未出现扩增产物。

实施例2、鉴定油菜渐渗后代C基因组的引物的应用

1、供试材料

供试材料(表1)：甘蓝型油菜GT1、野芥菜(母本)与甘蓝型油菜GT1(父本) 杂交产生的杂种F1代、野芥菜(母本)与杂种F1代回交产生的回交BC1代、野芥菜 (母本)与回交BC1代回交产生的回交BC2代、野芥菜(母本)与回交BC2代回交 产生的回交BC3、野芥菜(母本)与回交BC3代回交产生的回交BC4，野芥菜(母本) 与回交BC4代回交产生的回交BC5。其中，回交BC1-BC5均为油菜渐渗后代，回交 BC1代经测序表明含有C基因组，而回交BC2代、回交BC3代、回交BC4代和回交 BC5代经测序表明不含有C基因组。上述各供试材料均选取10株植株用于PCR分析。

2、DNA的提取

选取步骤1的各供试材料的新鲜叶片，采用北京天根生化试剂有限公司的新型植 物基因组DNA提取试剂盒的操作说明进行总DNA提取。

3、PCR扩增

分别以步骤2获得的各供试材料的DNA为模板，分别采用实施例1中的7对引 物对进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物。

PCR反应体系(10uL)：上、下游引物各0.12uL(终浓度10umol/L)，2×MasterMix (北京天根生化试剂有限公司)12.5uL，总DNA模板1uL，用ddH₂O补至10uL。

PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，50℃～55℃退火1min (具体退火温度见表2)，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min。

4、电泳检测结果及鉴定

将PCR扩增产物采用2％琼脂糖凝胶电泳，染色采用美国Biotium公司的GelRed 核酸凝胶染料。通过统计电泳带型，对油菜渐渗后代是否含有C基因组进行鉴定。

电泳检测结果如图1、图2、图3和表3所示：7对引物对均可在甘蓝型油菜GT1、 杂交种F1代和回交BC1代中检测到相应的扩增产物，但回交BC2代、回交BC3代、 回交BC4代和回交BC5代中，均未检测到扩增产物。表明供试材料中的甘蓝型油菜 GT1、杂交种F1代和回交BC1代均含有C基因组，均为甘蓝型油菜；回交BC2代、 回交BC3代、回交BC4代和回交BC5代均不含有C基因组，均为芥菜型油菜。与供 试材料中的油菜渐渗后代的测序结果一致。

表3、本发明中供试材料的PCR鉴定结果

注：“+”表示出现扩增产物；“-”表示未出现扩增产物。

说明本发明提供的7对引物对可快速、准确鉴定油菜渐渗后代是否含有C基因组 及油菜渐渗后代为甘蓝型油菜还是芥菜型油菜。