一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体保存方法

摘要

本发明公开一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体保存方法。该培养基在现有植物组织培养基的基础上添加水解酪蛋白、水解乳蛋白等营养成分配制而成。本发明所述培养基用薜荔籽凝胶粉代替琼脂糖凝胶；能够为葡萄叶绿素缺乏突变体提供天然植物营养，该营养更容易直接被吸收利用；且该培养基辅助葡萄叶绿素缺乏突变体试管苗快速形态建成，形成不定根和新的茎和叶；后30d，温度调整为16-18℃，降低试管苗生长速度，在保持试管苗有限生长的条件下，延长试管苗保存时间；整个培养体系，实现葡萄叶绿素缺乏突变体的长期试管保存，其成苗率和成活率达100％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种突变体保存方法，属于组织培养领域，具体地说是一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体保存方法。

背景技术

叶绿素缺乏突变体是植物常见的一种突变类型。研究者通过自然突变、化学诱导突变、T-DNA插入、基因沉默等方法和技术手段，已在烟草、拟南芥、番茄、胡萝卜、豌豆、向日葵、小麦、玉米、大麦、水稻等作物中发现大量的叶绿素缺乏突变体，叶色表现出从黄化到白化等不同程度的叶绿素缺乏类型。尽管大部分植物叶绿素缺乏突变体属于无义突变，但这些突变体的存在为研究高等植物叶绿体结构和发育、光合作用机理、叶绿素合成代谢、光合作用相关基因的发掘和功能鉴定、植物光形态建成等方面提供了优异的种质资源。

但是由于叶绿素缺乏，突变体植株叶色近似白化，叶绿体类囊体膜片层少，结构简单，叶片皱缩，严重影响了植物体正常的光合作用，在自然条件下难以成活，导致这一特殊种质利用常规方法难以实现长期保存。

发明内容

本发明的目的在于提出一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体培养基，以及一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体保存的方法，用来解决葡萄叶绿素缺乏突变体由于叶绿素缺乏，生长虚弱，无法在大田正常生长，达到实现葡萄叶绿素缺乏突变体能够长期保存的效果。

为实现上述目的，本发明所述一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体培养基，其中：每升培养基由以下重量份组成：

(1)大量元素：

硝酸钾1260mg/L、硝酸铵1320mg/L、二水氯化钙440mg/L、七水硫酸镁250mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙酸钠37.3mg/L；

(2)微量元素：

二水硫酸锰10mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、碘化钾0.83mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L；

(3)有机物：

水解酪蛋白150mg/L、水解乳蛋白150mg/L、肌醇22.3mg/L、甘氨酸2.0mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L；

(4)植物生长调节剂：吲哚乙酸0.1-0.3mg/L、激动素0.1mg/L；

(5)薜荔籽凝胶粉26-35g/L；

(6)糖：蔗糖10g/L、葡萄糖15g/L、果糖5g/L；

余量为蒸馏水。

本发明所述一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体培养基的制备方法，实现步骤如下：

①在1L容器中加入200ml蒸馏水，后将各组分按照1L比例的量分别加入该烧杯中，待用；

②在2L容器中加500mL蒸馏水，进行加热直至沸腾，后用电子天平精确称取蔗糖10g、葡萄糖15g、果糖5g加入容器中的沸水中，并充分搅拌至蔗糖、葡萄糖、果糖完全溶解；

③将所述①中的培养基溶液倒入②中，并添加50mL蒸馏水冲洗烧杯3次，将洗液合并倒入②中；

④在③中按照1L比例的量添加吲哚乙酸和激动素，并充分搅拌混匀，最后将培养基混合液晾至室温加入26-35g薜荔籽凝胶粉，用蒸馏水定容至1L；

⑤将④中制作好的培养基分装，进行巴氏灭菌，制得。

所述薜荔籽凝胶粉的制备方法：将薜荔种子、薜荔果皮、薜荔宿存花粉碎至粒径为2-5mm，将上述粉碎物中加入4-8℃清水，加清水的重量为粉碎物重量的2-3倍，将上述混合液置于2500-3000r/min下离心10-20min，过滤出清液；将清液于22-28℃环境下制备成干粉。

本发明所述一种葡萄叶绿素缺乏突变体的选择与接种方法：

一、选择葡萄叶绿素缺乏突变体试管苗基部带叶单芽茎段作为外植体；

二、在超净工作台上，将葡萄叶绿素缺乏突变体带叶单芽茎段的基部插入培养基，插入深度按茎段长度1/2为准，充分露出叶和芽。

本发明所述一种葡萄叶绿素缺乏突变体的继代培养和培养条件：

一、在控温和光照的光照培养箱内进行，每2个月继代1次，采用变温培养；

二、接种后前30d，培养条件为温度为20-25℃，相对湿度70-80％，光照强度为35-40μmol·m^-2·s^-1，光周期中光期16h、暗期8h；继代培养30d后，将温度调节为16-18℃，其他条件不变。

所述薜荔中含有熊果醇、白桦醇、豆甾-5,24(28)-二烯-3β-醇、5α-豆甾-3,6-二酮、β-谷甾醇、白桦酸、胡萝卜苷、羽扇豆醇、豆甾醇、正二十六烷醇等物质，低温制备得到的薜荔籽凝胶粉营养物质含量充分且养分损失少，因此用薜荔籽凝胶粉代替琼脂糖凝胶；能够为葡萄叶绿素缺乏突变体提供天然植物营养，该营养更容易直接被吸收利用。

本发明所述一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体保存方法，其有益效果在于：本发明所述培养基用薜荔籽凝胶粉代替琼脂糖凝胶；能够为葡萄叶绿素缺乏突变体提供天然植物营养，该营养更容易直接被吸收利用；且该培养基辅助葡萄叶绿素缺乏突变体试管苗快速形态建成，形成不定根和新的茎和叶；后30d，温度调整为16-18℃，降低试管苗生长速度，在保持试管苗有限生长的条件下，延长试管苗保存时间；整个培养体系，实现葡萄叶绿素缺乏突变体的长期试管保存，其成苗率和成活率达100％。

具体实施方式

实施例1

一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体培养基的制备方法，实现步骤如下：

①在1L容器中加入200ml蒸馏水，再分别加入硝酸钾1260mg、硝酸铵1320mg、二水氯化钙440mg、七水硫酸镁250mg、磷酸二氢钾170mg、七水硫酸亚铁27.8mg、乙二胺四乙酸钠37.3mg、二水硫酸锰10mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、二水钼酸钠0.25mg、碘化钾0.83mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、水解酪蛋白150mg、水解乳蛋白150mg、肌醇22.3mg、甘氨酸2.0mg、盐酸吡哆醇0.5mg、烟酸0.5mg、盐酸硫胺素0.1mg/L，待用；

②在2L容器中加500mL蒸馏水，进行加热直至沸腾，后称取蔗糖10g、葡萄糖15g、果糖5g加入容器中的沸水中，并充分搅拌至蔗糖、葡萄糖、果糖完全溶解；

③将所述①中的培养基溶液倒入②中，并添加50mL蒸馏水冲洗烧杯3次，将洗液合并倒入②中；

④在③中按照1L比例的量添加吲哚乙酸0.1mg、激动素0.1mg，并充分搅拌混匀，最后将培养基混合液晾至室温加入26g薜荔籽凝胶粉，用蒸馏水定容至1L；所述薜荔籽凝胶粉的制备方法：将薜荔种子、薜荔果皮、薜荔宿存花粉碎至粒径为2mm，将上述粉碎物中加入4℃清水，加清水的重量为粉碎物重量的2倍，将上述混合液置于2500r/min下离心10min，过滤出清液；将清液于22℃环境下制备成干粉；

⑤将④中制作好的培养基分装，进行巴氏灭菌，制得。

所述培育葡萄叶绿素缺乏突变体的方法：实现步骤如下：

1、外植体选择：选择通过葡萄杂交胚挽救培养获得的叶绿素缺乏突变体试管苗基部带叶单芽茎段作为外植体；在超净工作台上将葡萄叶绿素缺乏突变体带叶单芽茎段的基部插入培养基，插入深度按茎段长度1/2为准，充分露出叶和芽；

2、培养条件：

在能够控温和光照的光照培养箱内，调节温度为22℃，相对湿度70％，光照强度为35μmol·m^-2·s^-1，光周期中光期16h、暗期8h；

3、继代培养：

在上述培养体系下，每2个月继代1次；后续继代培养中，培养基制备、外植体选择与接种方法和培养条件均按上述程序进行。

实施例2

一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体培养基的制备方法，实现步骤如下：

步骤①至③同实施例1；

④在③中按照1L比例的量添加吲哚乙酸0.3mg、激动素0.1mg，并充分搅拌混匀，最后将培养基混合液晾至室温加入35g薜荔籽凝胶粉，用蒸馏水定容至1L；所述薜荔籽凝胶粉的制备方法：将薜荔种子、薜荔果皮、薜荔宿存花粉碎至粒径为5mm，将上述粉碎物中加入8℃清水，加清水的重量为粉碎物重量的2.5倍，将上述混合液置于3000r/min下离心200min，过滤出清液；将清液于28℃环境下制备成干粉；

⑤将④中制作好的培养基分装，进行巴氏灭菌，制得。

所述培育葡萄叶绿素缺乏突变体的方法：同实施例1。

实施例3

一种葡萄叶绿素缺乏突变体离体培养基的制备方法，实现步骤如下：

步骤①至③同实施例1；

④在③中按照1L比例的量添加吲哚乙酸0.2mg、激动素0.1mg，并充分搅拌混匀，最后将培养基混合液晾至室温加入30g薜荔籽凝胶粉，用蒸馏水定容至1L；所述薜荔籽凝胶粉的制备方法：将薜荔种子、薜荔果皮、薜荔宿存花粉碎至粒径为2mm，将上述粉碎物中加入4℃清水，加清水的重量为粉碎物重量的3倍，将上述混合液置于2800r/min下离心10min，过滤出清液；将清液于26℃环境下制备成干粉；

⑤将④中制作好的培养基分装，进行巴氏灭菌，制得。

所述培育葡萄叶绿素缺乏突变体的方法：同实施例1。

实施例4

对比试验：

1、培养基a：同实施例1培养基；培养基b.不添加水解酪蛋白150mg/L、水解乳蛋白150mg/L，蔗糖10g/L、葡萄糖15g/L和果糖5g/L，其余同实施例1培养基；

培养基a能显著促进不定根分化和生长，不定根开始分化时间为6.2d,在离体培养30d时平均根数为3.6条，根长5.6cm,与对照培养基b相比，不定根开始分化时间提早3.2d，不定根数平均多1.9条，根长增加3.1cm。

2、培养基c：同实施例1培养基；培养基d：不添加吲哚乙酸0.2mg/L和激动素0.1mg/L，其余同实施例1培养基；

培养基c能显著促进腋芽的萌发、叶片和茎的生长，腋芽开始萌发的时间为6.8d,在离体培养30d时平均叶片数为4.3片，株高6.5cm,与对照培养基d相比，腋芽开始分化时间提早3.8d，叶片数平均多1.4条，株高增加2.6cm。

实施例1培养基，不定根开始分化时间为6.1d，腋芽开始萌发的时间为6.7d,在离体培养30d时平均根数为3.8条，平均根长5.5cm,平均叶片数为4.2片，株高6.9cm。

通过以上实施例对葡萄叶绿素缺乏突变体在此培养基和培养条件下，接种4-6d后，葡萄叶绿素缺乏突变体单芽茎段启动生长，腋芽萌发；10-12d后，不定根和新的茎段形成，第一片新叶展开，进入快速生长期；25d可成苗，不定根数2-3条，根长3-5cm，株高6-8cm，叶片数3-4个，植株生长势好；30d后试管苗整体生长减缓，60d时进行下次继代培养。在这个培养过程中，采用变温培养，接种后前30d，温度为20-25℃，有利于葡萄叶绿素缺乏突变体试管苗快速形态建成，形成不定根和新的茎和叶；后30d，温度调整为16-18℃，降低试管苗生长速度，在保持试管苗有限生长的条件下，延长试管苗保存时间。