一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物，其结构式如式A所示：本发明的一种来源于海洋真菌的Azaphi？lones类衍生化合物是从一种海洋真菌中分离得到，海洋微生物种类繁多，数量庞大，从微生物提取化合物的方法简单，步骤简便，使得Azaphi？lones类衍生化合物来源丰富，成本低廉；且该Azaphi？lones类衍生化合物在抑菌或抗癌方面具有良好的效果，因此其在药物领域应用前景广阔。

说明书

技术领域

本申请涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种来源于海洋真菌的 Azaphilones类衍生化合物及其制备方法和应用。

背景技术

海洋中蕴含着丰富的微生物资源，其特殊复杂的海洋环境(高盐度、高压 力、低温、光照等)赋予海洋微生物特殊的代谢方式，代谢物的化学结构具有 极大的复杂性和多样性。尤其是海洋微生物中提取的含有特异性结构及生物活 性强的新型化合物具有显著的药理稳定性和强效性，并且毒副作用相对较小， 对防治心脑血管病、癌症、艾滋病、老年病等疑难病症具有独特效应，已成为 开发新药、特药的主要方向之一。

而且，海洋微生物具有繁殖快、易培养、代谢易于调控，菌种较易选育等 优点，结合发酵工艺可进行该药物化合物的工业化生产。

因此，从海洋生物代谢物提取的新型药物化合物的开发研究意义重大，本 发明提供了一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物及其制备方法和应 用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型结构的来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生 化合物，解决了现有技术中未存在该结构化合物的不足。

本发明提供了一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物，其结构式 如式A所示：

另一方面，本发明还提供了一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合 物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将海洋真菌菌核青霉Penicillium sclerotiorum M-22菌株接种于种子培 养基，摇床培养，得到种子培养液；

S2、将种子培养液接种于发酵液体培养基中，摇床培养得到发酵物；

S3、将发酵产物用甲醇浸泡提取，甲醇提取液浓缩后经乙酸乙酯萃取、浓 缩、得到浸膏，再经层析分离，得到结构式如式A的化合物。

本发明还提供了一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物在制备抑 菌药物中的应用。

本发明还提供了一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物在制备抗 肿瘤药物中的应用。

本发明的一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物是从一种海洋真 菌中分离得到，海洋微生物种类繁多，数量庞大，从微生物提取化合物的方法 简单，步骤简便，使得Azaphilones类衍生化合物来源丰富，成本低廉；且该 Azaphilones类衍生化合物抑菌或抗癌效果良好，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明的一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物的核磁共 振氢谱图；

图2为本发明的一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物的核磁共 振碳谱图；

图3为本发明的一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物的核磁共 振HSQC二维谱图；

图4为一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物对4种指示菌株病 原菌的抑制实验效果图：a：对金黄葡萄球菌的抑制作用；b：对克雷氏肺炎菌 的抑制作用；c：对铜绿假单孢杆菌的抑制作用；d：对大肠杆菌的抑制作用。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

在本发明中，一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物，从海口西 海岸沿海的漂浮腐叶生真菌菌核青霉P.sclerotiorum M-22中分离得到。该菌株 已保存在海南医学院热带病重点实验室中保藏，保藏日期为2012年11月28日， 保藏号是HNKTM-Z-F-022。保藏单位地址为：海南省海口市学院路海南医学院 热带病重点实验室。经鉴定，P.sclerotiorum M-22和专利号为CN201410072154.1 的中国发明专利已公开的的真菌菌核青霉P.sclerotiorum.SJ 0167为同一种菌株。

一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物，其结构式如式A所示：

本发明还提供了一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物的制备方 法，包括以下步骤：

S1、将海洋真菌菌核青霉P.sclerotiorum M-22菌株接种于种子培养基，摇 床培养，得到种子培养液；

S2、将种子培养液接种于发酵液体培养基中，摇床培养得到发酵物；

S3、将发酵产物用甲醇浸泡提取，甲醇提取液浓缩后经乙酸乙酯萃取、浓 缩、得到浸膏，再经层析分离，得到式(1)化合物。

步骤S1种子培养基组分为：葡萄糖8～12g，蛋白胨1.5～2.5g，酵母膏0.8～ 1.5g，海盐20～30g，水0.8～1.2L。步骤S1摇床培养条件为：温度22～28℃， 转速100～150rmp，发酵时间2～6d。

在上述制备方法中，步骤S2发酵培养的培养基的组分为：葡萄糖8～12g， 蛋白胨1.5～2.5g，酵母膏0.8～1.5g，海盐20～30g，水0.8～1.2L。步骤S2 摇床培养条件为：温度22～28℃，转速100～150rmp，发酵时间10～25d。

实施例一：

一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物的具体制备步骤如下：

S1：种子培养液的获得：

S11配制种子培养基：将葡萄糖8g，蛋白胨1.5g，酵母膏0.8g，海盐20g， 自来水800mL配好溶液，分别装于8个250mL锥形瓶，在121℃、0.1MPa 的条件下灭菌20min。

S12种子培养液的制备：将海洋真菌菌核青霉P.sclerotiorum M-22菌株接 种于种子培养基，在22℃的温度下，置摇床上以150rpm的转速，培养6天， 制得种子培养液。

S2：发酵培养：将200mLS11制得的种子培养基装入500mL的锥形瓶中， 经121℃、0.1MPa的条件下灭菌20min后，无菌操作将5mL步骤S12得到的 种子培养液接种至装有发酵培养基的锥形瓶中，共接种100瓶，在25℃的条件 下，置于摇床上以100rpm的转速培养10～25d制得发酵物。

S3：Azaphilones类衍生化合物的提取分离：将步骤S2发酵好的发酵物以每 瓶100mL的甲醇，摇匀后放置1d(期间摇匀4～5次)后，用布氏漏斗过滤， 滤液浓缩一半后用1/2体积的乙酸乙酯萃取4次后浓缩，得到乙酸乙酯粗提浸膏； 发酵菌丝加入等质量的50％甲醇溶液提取4次后合并提取液，提取液浓缩一半 后用1/2体积的乙酸乙酯萃取4次后浓缩，得到乙酸乙酯粗提浸膏，合并2次获 得的粗提物浸膏，累计得18.9g粗提物浸膏。浸膏用200～300目的硅胶进行层 析分离，硅胶进行层析分离时分别用10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、 2:8、1:9和0:10的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，将8:2、7:3和6:4的石油醚-乙酸 乙酯梯度洗脱液合并，用体积比为2:1:1的石油醚-二氯甲仿-甲醇为洗脱液进一 步洗脱，再经过制备型HPLC，用体积比为7:3的甲醇-水为洗脱液纯化，即得 21.3mg Azaphilones类衍生化合物。分离提取的Azaphilones类衍生化合物为黄 色粉末，对其进行核磁共振分析鉴定的谱图如图1～3所示。

Azaphilones类衍生化合物结构测试的理化性质数据如下：1H-NMR(溶剂 为氘代氯仿)和13C-NMR(溶剂为氘代甲醇)具体数据见表1。

表1

从核磁共振的结构分析检测结果可以确定Azaphilones类衍生化合物的分子 式为C₂₀H₂₉O₇Cl，结构式如式A所示：

实施例二：

一种来源于海洋真菌的Azaphilones类衍生化合物的具体制备步骤如下：

S1：种子培养液的获得：

S11配制种子培养基：将葡萄糖12g，蛋白胨2.5g，酵母膏1.5g，海盐30 g，自来水1200mL配好溶液，分别装于8个250mL锥形瓶，在121℃、0.1MPa 的条件下灭菌20min。

S12种子培养液的制备：将海洋真菌菌核青霉Penicillium sclerotiorum M-22 菌株接种于种子培养基，在28℃的温度下，置摇床上以150rpm的转速，培养 2天，制得种子培养液。

S2：发酵培养：将200mLS11制得的种子培养基装入500mL的锥形瓶中， 经121℃、0.1MPa的条件下灭菌20min后，无菌操作将5mL步骤S12得到的 种子培养液接种至装有发酵培养基的锥形瓶中，共接种100瓶，在25℃的条件 下，置于摇床上以150rpm的转速培养10d制得发酵物。

S3：Azaphilones类衍生化合物的提取分离：将步骤S2发酵好的每瓶发酵物 加入100mL的甲醇，摇匀后放置1d(期间摇匀4～5次)后，用布氏漏斗过滤， 滤液浓缩一半后用1/2体积的乙酸乙酯萃取4次后浓缩，得到乙酸乙酯粗提浸膏； 发酵菌丝加入等质量的50％甲醇溶液提取4次后合并提取液，提取液浓缩一半 后用1/2体积的乙酸乙酯萃取4次后浓缩，得到乙酸乙酯粗提浸膏，合并2次获 得的粗提物浸膏，累计得18.9g粗提物浸膏。浸膏用200～300目的硅胶进行层 析分离，硅胶进行层析分离时分别用10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、 2:8、1:9和0:10的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，将8:2、7:3和6:4的石油醚-乙酸 乙酯梯度洗脱液合并，用体积比为2:1:1的石油醚-二氯甲仿-甲醇为洗脱液进一 步洗脱，再经过制备型HPLC，用体积比为7:3的甲醇-水为洗脱液纯化，即得 21.3mg Azaphilones类衍生化合物。分离提取的Azaphilones类衍生化合物。经 核磁谱图分析鉴定，本实例所制备的Azaphilones类衍生化合物结构式与实施例 1所制备的Azaphilones类衍生化合物相同，如式A所示。

实例三：本发明的Azaphilones类衍生化合物的抑菌效果测试

测试一：采用纸片扩散法，先测试实例1分离到的Azaphilones类衍生化合 物对4种病原菌能否具有抑菌作用，其实验步骤如下：

将金色葡萄球菌、克雷氏肺炎菌、铜绿假单孢杆菌、大肠杆菌共四种指示 病原细菌，分别划线接种到已经倒好LB固体培养基的平皿上，置于37℃恒温 培养箱中培养14h。

从平皿上挑出单克隆的菌落，接种至已灭菌的装有10mL LB液体培养基的 50mL的三角瓶之中，置于37℃、220rmp的摇床中震荡培养14h。

最佳涂布浓度的确定：用普通LB培养基进行各活化新鲜指示病原菌菌液 10^-1～10^-3的10倍递增稀释，取各稀释度菌液100μL涂布琼脂平板，各重复稀 释浓度3次，置37℃条件培养12h后观察菌株生长状况。

灭菌的的LB固体培养基融化后适量地倒入已灭菌的培养皿中，待培养基凝 固后，每个培养皿中加入100μL的最佳涂布浓度的新鲜指示病原细菌，并用 无菌玻璃棒均匀涂布平皿的培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养20min，烘 干培养基上多余的水份。

加入无菌滤纸小片。无菌滤纸小片制作方法：将定量滤纸用打孔器打成直 径约为6mm的圆形小片，然后121℃高压灭菌20min，烘干即得。每个平皿均 匀加4个滤纸小片，并将滤纸小片轻轻地平铺在已加了病原菌的培养基上。

在无菌条件下，在每个滤纸小片上加入5μL的10mg/mL本发明的 Azaphilones类衍生化合物。

将已加入本发明的Azaphilones类衍生化合物的培养皿置于37℃恒温培养 箱中培养12～16h，然后测量其抑菌圈的大小，拍照并做好相关的记录。如图4 所示，其中，每个培养皿划分四个区域，前三个区域的中心处加入本发明的 Azaphilones类衍生化合物，右下角的区域为空白对比试验，如表2所示，前三 个区域的抑菌圈的平均直径越大，说明本发明的Azaphilones类衍生化合物对该 种病原菌抑菌效果越好。

测试二：测试本发明分离到的Azaphilones类衍生化合物对金色葡萄球菌、 克雷氏肺炎菌、铜绿假单孢杆菌、大肠杆菌共四种不同指示病原菌的MIC测定。

通过纸片扩散法确定化合物对某一病原菌有抑制作用后，采用2倍稀释法 测定其最小抑菌浓度(MIC)，其实验步骤如下：

从培养皿上挑出单克隆的菌落，接种至已灭菌的装有10mL的LB液体培养 基的50mL的三角瓶之中，置于37℃、220rmp的摇床中震荡培养14h；

取11支试管编号为1～11，1～10号管每支均装入1mL LB肉汤。在1号 试管内加1mL浓度为2000μg/mL的药液，混匀后吸取1mL至2号试管，依 次类推，1至9号试管吸取1mL弃去。10号管为不含药液的2mL LB培养基对 照，11号试管为不含肉汤的2mL药液对照。

分别测量每只试管菌液的OD值，从试管中取出一定量的菌液置于石英比 色皿之中，以LB液体培养液作为空白，然后在紫外分光光度下测定600nm的 光吸收值。

做好记录，计算出最小抑菌(MIC)浓度，如表2所示，其中，最小抑菌浓 度MIC越小，说明其对该种病原菌抑菌效果越好。

表2

实施例四：本发明的Azaphilones类衍生化合物的抗肿瘤活性测试

采用MTT法对本发明的Azaphilones类衍生化合物抗肿瘤活性。

准备材料：四甲基偶氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylterazolium  bromide，商品名为噻唑蓝，简称MTT]：用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS) 溶解MTT，配制浓度为5浓度为mg/mL的四甲基偶氮唑盐溶液，用0.22μm 孔径的滤膜过滤除菌，分装后在-20℃避光保存。

细胞培养基：RMPI-1640(Roswell Park Memorial In-stitute 1640)培养基，加 入10％已灭活(56℃温浴30min)的小牛血清及1％的三抗(青霉素、链霉素和卡 那霉素)，混匀后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。

PBS缓冲液(pH7.4)：Na₂HPO₄1.44g、KH₂PO₄0.24g、KCI 0.2g、NaCl 8 g，加蒸馏水定容至1000mL，在121℃、0.1MPa条件下高压灭菌20min。

细胞株选用：黑色素瘤B-16、人胃癌细胞SGC-7901、肝癌细胞HepG-2、 正常乳腺上皮细胞M10。

操作步骤：

收集对数生长期的3种癌细胞，调整细胞悬液浓度为1×104个/mL，往96 孔板的每孔加入100μL，空白加200μL完全培养基，置CO₂培养箱中，37℃、 5％CO₂培养4h。用色谱纯甲醇溶解的样品，后用完全培养基进行稀释，每孔 加入100μL带有不同浓度药品的培养基，共设置6个梯度，使每孔最终浓度分 为500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL和15.63μg/mL， 阴性对照加完100μL全培养基。每个梯度分别设3个重复，继续培养30h后取 出。药物作用结束后，每孔加入40μL浓度为5mg/mL的MTT，培养4h。终 止培养，轻轻地吸去孔内培养液。每孔加入150μL的DMSO。摇床低速振荡 10min。之后用酶标仪检测OD，OD值为490nm下各孔的吸光度值(A)。细胞抑 制率的计算抑制率：抑制率＝(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组 OD值-空白对照组OD值)×100％。抑制率为50％时样品的浓度为IC₅₀。计算出 IC50值，结果用平均值±标准偏差表示。

本发明的Azaphilones类衍生化合物在对3种癌细胞活性测试中均表现抑制 作用，但对正常细胞M-10无明显抑制作用，其中，IC₅₀值越小，就说明本发明 的Azaphilones类衍生化合物对该癌细胞抑制效果越好。测试结果如表3所示。

表3

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认 定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。