一种多期多样本法检测光温敏核不育水稻不育性的方法

摘要

本发明公开了一种多期多样本法检测光温敏核不育水稻不育性的方法。将待检测不育水稻种子每隔7-15天，分多期播种；等待处理不育水稻首期播种的部分植株生育进程进入花粉母细胞减数分裂期即俗称叶枕平时期时，将连续3-4个播期不育水稻植株在一定处理环境下培育规定的天数取出；记载不育水稻植株从处理环境中取出时间，记载样本单穗抽穗日期，取样，套袋，镜检，成熟时考察其自交结实率；根据样本单穗处理结束后距离抽穗的天数、花粉镜检结果、套装自交结实结果，结合穗发育每一阶段距离抽穗的天数指标，确定光温敏核不育水稻不育性的两个重要指标即不育起点温度和育性转换敏感期。本方法易于操作，检测结果更加准确和完善。

说明书

技术领域

本发明属于水稻杂种优势利用中新材料的安全应用检测技术领域，具体涉及检测光温敏核不育水稻不育性的两个重要指标即不育起点温度和育性转换敏感期。

背景技术

具有稳定不育性的光温敏核不育水稻（S）的利用是两系杂交水稻推广的前提。光温敏核不育水稻对光温条件敏感，一般长日高温下不育，短日低温下可育，因为这种特殊的育性转换的特性，制种期间如育性敏感期遇到低于不育起点温度的天气，不育系会自交结实从而造成杂交制种失败，给生产照成巨大的损失。因而，准确鉴定新选育的光温敏核不育水稻的育性稳定性才能判断它们是否具有实用价值或育性质量是否达到实用标准，这是降低两系法杂交水稻制种风险的关键技术。

对于光温敏核不育水稻育性稳定性的检测，除了多点自然生态检测外，目前主要是利用人工气候室（箱）或人工控温冷水池进行检测。然而不论应用人工气候室（箱）还是人工控温冷水池，材料的处理方法和技术都有待进一步完善和提高。目前检测方法的缺陷，主要表现在材料的处理时期判断方法麻烦和一份材料只处理一个播期且只观察处理不育水稻穗发育Ⅴ-Ⅵ的穗子的处理结果，另外，光温敏核不育水稻的不育性具有两个重要指标即不育起点温度和育性转换敏感期，目前只检测其不育起点温度，对不育性的另一重要指标即育性转换敏感期的检测没有提及。如根据中华人民共和国国家标准（GB/T 29371.1-2012）颁布的两系杂交水稻种子生产体系技术规范中，不育系材料处理时期，籼稻为主茎幼穗分化进入Ⅳ期末时，粳稻为主茎幼穗分化进入Ⅲ期末时，移入人工气候箱进行处理，而这种处理方法，只能靠不断的剥蘖目测法判断穗发育进程，比较麻烦；另外，在处理结果部分，育性观察对象是人工气候箱结束时，挂牌标记剑叶和倒二叶的叶枕距为0cm-2cm的稻穗，标记穗始穗后取样镜检，这种方法只检查了穗发育Ⅴ-Ⅵ的穗子温度敏感性，忽略了其他可能的育性敏感期。光温敏核不育水稻育性稳定性检测时往往不止一份材料，因而，要想尽可能准确检测光温敏核不育水稻的不育性，必须处理好何时开始处理，并且要把不同材料的育性敏感期尽可能的涵盖在处理时间内。本发明即是对光温敏核不育水稻育性稳定性的检测方法进一步改进。

发明内容

为了实现对光温敏核不育水稻不育性的检测更加准确和全面，本发明提供一种多期多样本法检测光温敏核不育水稻不育性的方法。

一种多期多样本法检测光温敏核不育水稻不育性的具体操作步骤如下：

 （1）将光温敏核不育水稻种子分三期以上播种，相邻两期播种之间间隔7～15天；

（2）催芽、田间播种、5～6叶秧龄移栽于大田，当水稻进入穗发育，选取连续3～4个播期长势均匀、健壮的植株移栽于盆钵，每期1～2盆，每盆4～7株苗，按常规技术管理，得到水稻盆栽植株；

（3）当选取的首个播种期的水稻盆栽植株进入花粉母细胞减数分裂期（即俗称的叶枕平时期）时，将水稻盆栽植株于平均温度21～25℃条件下，在人工气候室或人工控温冷水池内培育3～10天，得到控温培育植株，记载控温培育植株的控温培育结束日期；

（4）待控温培育植株抽穗时，取3个以上单穗为样本，套袋，记载抽穗日期，镜检花粉育性，待套袋单穗成熟时，考察其自交结实率；

（5）根据3个以上单穗的控温培育结束日期至单穗抽穗日期之间的天数、镜检花粉育性结果和自交结实率，结合水稻穗分化发育进程判断方法，确定光温敏核不育水稻不育性的两个重要指标即不育起点温度和育性转换敏感期。

同时检测两种以上品种的光温敏核不育水稻不育性的具体操作步骤如下：

（1）将两种以上的光温敏核不育水稻种子分别分三期以上播种，相邻两期播种之间间隔7～15天；

（2）催芽、田间播种、5～6叶秧龄移栽于大田，当两种以上的水稻进入穗发育，分别选取穗发育相近的两种以上的水稻3～4个播期长势均匀、健壮的植株移栽于盆钵，每期1～2盆，每盆4～7株苗，按常规技术管理，得到水稻盆栽植株；

（3）当选取的每种水稻盆栽植株的首个播种期的盆栽植株进入花粉母细胞减数分裂期（即俗称的叶枕平时期）时，将水稻盆栽植株于平均温度21～25℃条件下，在人工气候室或人工控温冷水池内培育3～10天，得到控温培育植株，记载控温培育植株的控温培育结束日期；

（4）待控温培育植株抽穗时，取每种水稻3个以上单穗为样本，套袋，记载抽穗日期，镜检花粉育性，待套袋单穗成熟时，考察其自交结实率；

（5）根据每种水稻3个以上单穗的控温培育结束日期至单穗抽穗日期之间的天数、镜检花粉育性结果和自交结实率，结合水稻穗分化发育进程判断方法，确定每种光温敏核不育水稻不育性的两个重要指标即不育起点温度和育性转换敏感期。

本发明的原理为：光温敏核不育水稻育性转换敏感期即不育水稻的育性表达对环境温度与光周期敏感的时期，光温敏核不育水稻育性检测时最重要的条件是必须在不育水稻的育性转换敏感期进行光温处理才可达到准确检测不育系不育起点温度的目的。据研究，籼型光温敏核不育水稻的育性转换敏感期一般在幼穗发育的Ⅳ-Ⅶ期，最敏感期为Ⅵ期，粳型光温敏核不育水稻的育性转换敏感期一般在Ⅲ-Ⅶ期，最敏感期为Ⅳ-Ⅵ期，且育性敏感期比较复杂，不同材料有时是不同的，如何通过有限的几天处理达到准确的检测光温敏核不育水稻不育稳定性的目的是必须考虑的。

另外，水稻穗发育进程有一定相对稳定的形态和时间指标可依循，一般从穗发育至抽穗扬花约30天左右，幼穗分化第6期即花粉母细胞减数分裂期时水稻株叶外观形态上表现为倒1叶与倒2叶的叶耳对齐，即俗称叶枕平时期，这个时期不需要剥蘖，直接从水稻的外观上可以观察到，水稻穗分化发育进程具体的形态和时间指标见表1。

其次，同一品种同期播种不同单穗生育期相差一般为0-7天，相隔10天左右播种，相邻两期，穗发育进程一般情况下会相差5-7天，如此同一材料依次相隔10天播3期，生育期最大相差可达21天，另外，材料待处理第一个播期为穗发育六期时，距离抽穗还有10天左右（见表1），这样如材料第一个播期为穗发育六期时开始处理，一起处理连续3期的材料，可保证待处理材料从穗发育Ⅱ-Ⅶ期都有单穗经过处理，提高检测准确性。

目前检测光温敏核不育水稻不育性通用的材料处理方法是把所有待鉴定不育水稻种子分期播种，以保证不同不育水稻发育进度相同，能够同时处理，后移栽于大田，通过不断的剥蘖目测法观察幼穗发育进度，选取一个合适的播期进行处理，根据剥蘖法重点处理穗发育Ⅴ-Ⅵ的单穗，基本只考察Ⅴ-Ⅵ幼穗处理结果并据此判定不育水稻的不育起点温度这1个不育性指标。这种处理方法的弊端是一份材料只处理一个播期且重点只观察Ⅴ-Ⅵ的幼穗，忽略了不育水稻其他可能的育性敏感期，不准确，另外用剥蘖法判断材料开始处理时间，比较麻烦，判断上也可能有一定的失误，不准确也不方便。

本发明的有益技术效果体现在以下方面：

1.本发明把以前一个光温敏核不育水稻只选取一个播期进行处理的方式改变为一个光温敏核不育水稻选取相邻的3-4个播期作为处理对象，处理结束后，把以前调查对象只为Ⅴ-Ⅵ的幼穗改为调查所有尽可能多的处理单穗，即调查结果多样本法。通过这两点改进，扩大了不育水稻单穗间生育期差异，保证不育水稻从穗发育Ⅱ-Ⅶ期都有单穗经过处理，且处理结果都得到考察，尽可能的提高了光温敏核不育水稻不育性检测的准确性，特别是对一些育性最敏感期不在Ⅴ-Ⅵ的不育水稻，准确性提高了100%。另外，以前为保证调查对象为Ⅴ-Ⅵ的单穗，还需挂牌标记，费时费工不易掌握，本发明处理结果多样本调查法，调查尽可能多的处理单穗，易于把握。

2.本发明改进了光温敏核不育水稻不育性检测开始处理时间的判断方法。以前常规判断方法为剥蘖目测法，即把不育水稻植株的主茎（蘖）一层层小心剥开，直至剥到可看到完整的幼穗为止，据此判断幼穗发育进程是否达到要求而确定处理开始时间。本发明开始处理时间的判断是等到待处理首期播种水稻5～40%的植株穗发育到花粉母细胞减数分裂期即俗称的叶枕平时期时，将所有植株开始处理。这点利用水稻穗发育外在明显的株叶形态作为判断依据的改进，增强了实验的简易性和准确性。如每一个不育水稻通过剥蘖目测法剥10个植株，顺利的话至少需30分钟，而采用本发明方法至多观察5分钟即可确定，故可节省25分钟，提高了80%以上的效率。

3.应用以前的检测方法，结果只有不育起点温度1个指标，本发明根据结果确定光温敏核不育水稻不育性的不育起点温度和育性转换敏感期这2个重要指标，提高了实验结果的完善性，使对光温敏核不育水稻不育性的了解更加深入准确。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。

实施例1

一种多期多样本法检测光温敏核不育水稻不育性的方法的具体操作步骤如下：

（1）将待处理光温敏核不育水稻种子新安S于2014年5月11日、5月21日、6月1日和6月11日分别每隔10天播一期，共播种4期；

（2）催芽后，田间播种，5-6叶秧龄时，移栽于大田。观察第一期材料穗发育的进程，处理前15天，每个播期分别选取5株长势均匀、健壮的植株，各移栽于1个盆钵，待处理，常规技术管理；

（3）7月30日19点，5月11日播种的有20%的植株生育进程进入叶枕平时段，将5月11日、5月21日、6月1日和6月11日4个播期待处理植株一起放置于23.5℃恒温冷水池内连续培育6天取出，即8月5日19点停止处理，自身对照植株自然环境下生长；

（4）待控温培育植株抽穗时，取所有正常单穗为样本，取样，套袋，记载其抽穗日期，镜检其花粉育性，待套袋单穗成熟时，考察其自交结实率；

（5）根据调查单穗冷水处理结束后距离其抽穗的天数及其镜检和套装自交结实结果，结合每一阶段穗发育进程距离抽穗的天数指标，确定光温敏核不育水稻的不育性。

新安S植株8月5日冷水处理结束，花粉的育性变化主要发生在8月16日至8月19日，即处理结束后第11天至第14天抽穗的花粉育性由无花粉型变为典败花粉为主，典败花粉率100%，不育花粉率100%，自交结实率0%。同时期对照，典败花粉率0%，不育花粉率100%，自交结实率0%。根据穗发育进程推断，处理结束后第11天至第14天抽穗的单穗处理期为Ⅳ-Ⅵ期，故如以不育花粉率大于等于99.5%、自交结实率小于等于0.5%为不育性合格标准，则表明6天处理，新安S不育起点温度低于23.5℃，其育性相对敏感期在穗发育Ⅳ-Ⅵ期。

实施例2

一种多期多样本法检测光温敏核不育水稻不育性的方法的具体操作步骤如下：

（1）将待处理光温敏核不育水稻种子P88S 于2014年5月11日、5月21日、6月1日和6月11日分别每隔10天播一期，共播种4期；

（2）催芽后，田间播种，5-6叶秧龄时，移栽于大田。观察第一期材料穗发育的进程，处理前15天，每个播期分别选取5株长势均匀、健壮的植株，各移栽于1个盆钵，待处理，常规技术管理；

（3）7月30日19点，5月11日播种的有10%的植株生育进程进入叶枕平时段，将5月11日、5月21日、6月1日和6月11日4个播期的待处理植株一起放置于23.5℃恒温冷水池内连续培育6天取出，即8月5日19点停止处理，自身对照植株自然环境下生长；

（4）待控温培育植株抽穗时，取所有正常单穗为样本，取样，套袋，记载其抽穗日期，镜检其花粉育性，待套袋单穗成熟时，考察其自交结实率；

（5）根据调查单穗冷水处理结束后距离抽穗的天数及其镜检和套装自交结实结果，结合每一阶段穗发育进程距离抽穗的天数指标，确定光温敏核不育水稻的不育性。

P88S植株8月5日冷水处理结束，花粉的育性变化主要发生在8月16日至8月19日，即处理结束后第11天至第14天抽穗的花粉育性发生变化，典败花粉率83.29%，不育花粉率98.26%，自交结实率21.70%。同时期对照，典败花粉率99.47%，不育花粉率100%，自交结实率0%。根据穗发育进程推断，处理结束后第11天至第14天抽穗的单穗处理期为Ⅳ-Ⅵ期，故如以不育花粉率大于等于99.5%、自交结实率小于等于0.5%为不育性合格标准，则表明6天处理，P88S不育起点温度高于23.5℃，其育性相对敏感期在穗发育Ⅳ-Ⅵ期。

实施例3

一种多期多样本法检测光温敏核不育水稻不育性的方法的具体操作步骤如下：

（1）将待处理光温敏核不育水稻种子2301S 于2014年5月11日、5月21日、6月1日和6月11日分别每隔10天播一期，共播种4期；

（2）催芽后，田间播种，5-6叶秧龄时，移栽于大田。观察第一期材料穗发育的进程，处理前15天，每个播期分别选取5株长势均匀、健壮的植株，各移栽于1个盆钵，待处理，常规技术管理；

（3）7月26日17点，5月21日播种的有15%的植株生育进程进入叶枕平时段，将5月21日、6月1日和6月11日3个播期待处理植株一起放置于23.5℃恒温冷水池内连续培育5天取出，即7月31日17点停止处理，自身对照植株自然环境下生长；

（4）待控温培育植株抽穗时，取所有正常单穗为样本，取样，套袋，记载其抽穗日期，镜检其花粉育性，待套袋单穗成熟时，考察其自交结实率；

（5）根据调查单穗冷水处理结束后距离抽穗的天数及其镜检和套装自交结实结果，结合每一阶段穗发育进程距离抽穗的天数指标，确定光温敏核不育水稻的不育性。

2301S植株7月31日冷水处理结束，花粉的育性变化主要发生在8月9日至8月16日，即处理结束后第9天至第16天抽穗的花粉育性由无花粉型变为典败花粉为主，典败花粉率99.86%，不育花粉率99.97%，自交结实率0.03%。同时期对照，典败花粉率0.07%，不育花粉率100%，自交结实率0%。根据穗发育进程推断，处理结束后第9天至第16天抽穗的单穗处理期为Ⅳ-Ⅵ期，故如以不育花粉率大于等于99.5%、自交结实率小于等于0.5%为育性合格标准，则表明5天处理，2301S不育起点温度低于23.5℃，其育性相对敏感期在穗发育Ⅳ-Ⅵ期。

实施例4

一种多期多样本法检测光温敏核不育水稻不育性的方法的具体操作步骤如下：

（1）将待处理光温敏核不育水稻种子1892S于2014年5月11日、5月21日、6月1日和6月11日分别每隔10天播一期，共播种4期；

（2）催芽后，田间播种，5-6叶秧龄时，移栽于大田。观察第一期材料穗发育的进程，处理前15天，每个播期分别选取5株长势均匀、健壮的植株，各移栽于1个盆钵，待处理，常规技术管理；

（3）7月28日17点，5月11日播种的有10%的植株生育进程进入叶枕平时段，将5月11日、5月21日、6月1日和6月11日4个播期的待处理植株一起放置于23.5℃恒温冷水池内连续培育5天取出，即8月2日17点停止处理，自身对照植株自然环境下生长；

（4）待控温培育植株抽穗时，取所有正常单穗为样本，取样，套袋，记载其抽穗日期，镜检其花粉育性，待套袋单穗成熟时，考察其自交结实率；

（5）根据调查单穗冷水处理结束后距离抽穗的天数及其镜检和套装自交结实结果，结合每一阶段穗发育进程距离抽穗的天数指标，确定光温敏核不育水稻的不育性。

1892S植株8月2日冷水处理结束，花粉的育性变化主要发生在8月9日至8月19日，即处理结束后第7天至第17天抽穗的花粉育性由无花粉型变为典败花粉为主，典败花粉率98.82%，不育花粉率99.87%，自交结实率0.53%。同时期对照，典败花粉率100%，不育花粉率100%，自交结实率0%。根据穗发育进程推断，处理结束后第7天至第17天抽穗的单穗处理期为Ⅳ-Ⅶ期，故如以不育花粉率大于等于99.5%、自交结实率小于等于0.5%为育性合格标准，则表明5天处理，1892S不育起点温度高于23.5℃，其育性相对敏感期在穗发育Ⅳ-Ⅶ期。

实施例5

一种多期多样本法检测光温敏核不育水稻的不育性的方法的具体操作步骤如下：

（1）将待处理光温敏核不育水稻P88S、新安S、2301S和1892S于2014年5月11日、5月21日、6月1日和6月11日分别每隔10天播一期，共播种4期；

（2）催芽后，田间播种，5-6叶秧龄时，移栽于大田。观察每份种子植株穗发育的进程，处理前15天，从最早的播期开始进行筛选，选择每一份不育水稻种子穗发育相近的连续3个播期的长势均匀、健壮的植株移栽于盆钵待处理。2301S选取5月21日、6月1日和6月11日播种的植株，其它3份不育水稻种子均选取5月11日、5月21日、6月1日3个播期的植株。每期1盆，每盆5株苗，常规技术管理。

（3）7月28日，移栽的4份不育水稻每份水稻首期播种植株穗发育都达到了处理要求，即有5%-40%的单穗发育到了叶枕平时期，将所有移栽的待处理植株一起放入放置于23.5℃恒温冷水池内连续培育，每份不育水稻植株培育天数同其单独控温培育天数。

（4）记载控温培育不育水稻植株从冷水池取出的时间，记载所有正常单穗抽穗的日期，取样、镜检并套袋，成熟时考察其自交结实率；

（5）根据调查单穗冷水处理结束后距离抽穗的天数及其镜检和套装自交结实结果，结合每一阶段穗发育进程距离抽穗的天数指标，确定研究材料的不育起点温度和育性转换敏感期。

每份不育水稻的处理调查结果同具体实施方式1-4的结果。