单细胞的机械表型化：高通量定量检测和分选

摘要

本发明提供了用于高通量表征细胞或颗粒的机械性质的方法和装置。在某些实施方案中，所述装置包括微流体通道，包括：在所述通道第一侧的振荡元件；和与所述振荡元件相对的在所述通道第二侧的检测元件，其中所述检测元件被配置成检测由所述振荡元件通过细胞或微粒传送的力。在某些实施方案中，所述装置包括微流体通道，包括在所述通道的一个第一侧的集成振荡器和传感器元件，其中所述传感器被配置成检测由所述振荡器通过细胞或微粒传送的力。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请涉及2013年3月13日提交的USSN 13/802,684的权益和优先权，USSN 13/802,684要求2012年11月5日提交的USSN61/722,689的优先权，两者都为所有目的通过引用整体并入本文。

政府支持的声明

[不适用]

背景

细胞是软的、粘弹性的材料，其主要结构组成部分是蛋白和膜，并且其机械表型可以在病理转化期间显著改变。例如，在瘤形成进展期间，细胞骨骼重组导致细胞机械模量(更常称为硬度)的可测量的增加(Suresh(2007)Acta Biomaterialia,3：413-438；Cross等人(2007)Nat.Nanotechnol.,2：780-783)。药物治疗还可以导致改变的细胞机械表型：用某些化疗药物治疗的人类白血病细胞表现出增加的模量(Lam等人(2007)Blood,109：3505-3508)。我们实验室的初步结果也显示，我们可以检测卵巢癌细胞在用将癌表型转向健康表型的微RNA治疗之后的机械转化，如通过常规增殖和细胞凋亡测定所评价的；以统计学显著的边际，经治疗的细胞比基础卵巢癌细胞较不可变形。因此，用于评价癌症治疗的有希望的新远景是开发细胞的机械签名。

而认为完全开发细胞的机械特征(例如，针对癌症或其他应用)是定量测量大量细胞(例如每天之内>10²，或>10³，或>10⁴，或>10⁵个细胞)以便统计学上显著分析细胞亚群所需要的。据信，这一般需要以 之前方法不能提供的通量来处理大量细胞。目前用于机械表型化的方法，例如原子力显微术(AFM)，提供了全部细胞群的小子集的详细且准确的细胞模量测量。然而，由于缓慢的检测速度，使用提供定量数据的目前系统，样品大小通常限于小于100个细胞/天(参见例如，图1)。相反，用于细胞表征的常见且有效的技术，荧光激活细胞分选术(FACS)，以每秒大约10⁴个细胞的检测速率操作，并且提供了通过荧光标志物评估的特定蛋白水平的群体统计。

概述

本文提供了允许基于各种机械(或其他)参数(例如，弹性模量、剪切硬度、粘度、变形后松弛、各种电性质等)而快速定量筛选大量细胞的装置和方法。在某些实施方案中，仪器和方法有利于促进诱导细胞死亡或恢复细胞转移表型的化合物的鉴别。在某些实施方案中，提供了鉴别靶向细胞亚群的治疗的仪器和方法，所述细胞亚群包括恶化前的、药物抗性的或者可能引起癌症复发的那些。

在某些实施方案中，提供了用于机械表征细胞或微粒、微生物、或细胞器的装置，其中所述装置包括微流体通道，包括：在所述通道第一侧的振荡元件；和与所述振荡元件相对的在所述通道第二侧的检测元件，其中所述检测元件被配置成检测由所述振荡元件通过细胞或微粒传送的力。在某些实施方案中，提供了用于机械表征细胞或微粒的装置，其中所述装置包括微流体通道，所述微流体通道包括：在所述通道的一个第一侧的集成振荡器和传感器元件，其中所述传感器被配置成检测由所述振荡器通过细胞或微粒传送的力。在某些实施方案中，振荡元件以范围从约5Hz、或从约20Hz、或从约15Hz、或从约20Hz、或从约30Hz、或从约40Hz、或从约50Hz、或从约60Hz或从约80Hz、或从约100Hz、或从约200Hz、或从约300Hz、或从约400Hz、或从约500Hz至约4kHz或至约3kHz、或至约2kHz、或至约1kHz的频率振荡。在某些实施方案中，振荡元件以范围从约5Hz、或从约20Hz、或从约15Hz、或从约20Hz、或从约30Hz、 或从约40Hz、或从约50Hz、或从约60Hz或从约80Hz至约100Hz、或至约150Hz、或至约200Hz、或至约250Hz、或至约300Hz、或至约350Hz、或至约400Hz、或至约450Hz、或至约500Hz的频率振荡。在某些实施方案中，振荡元件以范围从约200Hz至约600Hz的频率振荡。在某些实施方案中，振荡元件以约400Hz的频率振荡。在某些实施方案中，通道的宽度足以通过单细胞(例如，一次一个单细胞)。在某些实施方案中，通道的宽度足以通过微米级水凝胶或小生物体(例如，秀丽隐杆线虫(C.elegans)、细菌等)。在某些实施方案中，通道的宽度范围从约1μm、或从约5μm、或从约10μm至约300μm、或至约200μm、或至约100μm、或至约90μm、或至约80μm、或至约70μm、或至约60μm、或至约50μm.。在某些实施方案中，通道的宽度范围从约5μM至约100μm。在某些实施方案中，通道的宽度范围从约5μM至约70μm。在某些实施方案中，振荡元件包括梳驱动。在某些实施方案中，检测元件包括梳。在某些实施方案中，振荡元件被配置成响应于变化的电势而振荡。在某些实施方案中，检测元件被配置成通过检测梳电容变化来检测梳指的位移。在某些实施方案中，包括所述振荡元件的梳和/或包括所述检测元件的梳还包括使梳指返回中性位置的横梁弹簧。在某些实施方案中，所述装置包括运载去离子水和/或蒸馏水跨越所述梳和/或相关电子仪器的第二通道或流体管线。在某些实施方案中，所述装置包括运载具有比第一通道中的流体更低介电常数的流体(例如，油)的第二通道或流体管线。在某些实施方案中，所述装置包括在其中形成、嵌入或模制所述通道的制造块体。在某些实施方案中，从其制造所述装置的块体材料选自由以下组成的组：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚烯烃塑性体(POP)、全氟聚乙烯(PFPE)、聚氨酯、聚酰亚胺、和交联的(酚醛聚合物)树脂、硼硅玻璃、SF11玻璃、SF12玻璃、聚苯乙烯、Pyrex 7740、PMMA和聚碳酸酯。在某些实施方案中，所述装置或包含所述装置的系统包括移动细胞和/或试剂穿过或进入所述微通道和/或所述微腔的泵或压力系统。

在某些实施方案中，提供了机械表征细胞、颗粒、微生物或细胞器的方法，其中所述方法包括：使所述细胞、颗粒、微生物或细胞器穿过本文描述和/或本文要求保护的装置的微流体通道；操作所述振荡元件以应用力至所述细胞、颗粒、微生物或细胞器；和检测所述检测元件中的电容变化，以提供细胞、颗粒、微生物或细胞器对所述力的响应的量度，其中所述响应提供所述细胞、颗粒、微生物或细胞器的机械性质的量度。在某些实施方案中，所述装置以约400Hz的基本频率和约0.5MHz的运载频率操作。

在某些实施方案中，可以通过高速成像监测细胞(或颗粒)对力的响应，以检测细胞(或颗粒)的轮廓和松弛行为。

定义

术语梳驱动指致动器(例如，电容致动器)，常用作线性致动器，其利用在两个电传导梳之间作用的静电力。梳驱动致动器通常以微米或纳米级操作，并且一般通过本体微机械加工或表面微机械加工硅片基底来生产。当在静态的梳和移动的梳之间应用电压时产生吸引的静电力，使得它们吸引在一起。在纵向设计中(例如，如本文所述的0°取向)，电容随梳位移而线性变化，但力是电压的函数。在横向设计中(例如，如本文所述的90°取向)，力具有与位移的立方关系，以及在电容和位移之间的反比关系。混合设计，如本文描述的20°混合设计，具有更复杂的关系。通常安排梳使得它们从不接触(因为会没有电压差异)。通常，安排齿使得它们可以相互滑过，直至每个齿占据相对梳中的狭缝。在某些实施方案中，可以添加恢复弹簧、杠杆和曲柄轴以提供恢复力，和/或如果梳驱动的线性操作转换为旋转或其他运动。

附图简述

图1示例说明本文描述的系统与其他机械测量系统相比较的检测频率和模量检测范围。如本图所示例说明的，本文描述的MaPS系 统明显提高了检测频率，并因此能够有效筛选大的药物文库并实现基于机械表型的细胞分选。关键词：原子力显微术(AFM)(Cross等人(2007)Nat.Nanotechnol.,2：780-783)、全细胞拉伸(WCS)(Thoumine等人,(1999)J.Biochem.Biophys.Meth.,39：47-62)、微量移液器抽吸(MA)(Liu等人(2007)In IEEE International Conference on Robotics and Automation,Roma,Italy,第1930-1935页)、微流变(MR)(Lam等人(2007)Blood,109：3505-3508；Tseng等人(2002)Biophys.J.83：3162-3176)、光学镊子(OT)(Sraj等人(2010)J.Biomed.Optics,15：047010；Guck等人(2000)Phys.Rev.Letts.84：5451-5454)和磁力扭转细胞计量术(MTC)Fabry等人(1999)J.Magnetism Magnetic Mat.194：120-125。细胞变形器和FACS不测量细胞模量，但是在场外显示供对比。

图2A-2C示例说明使用细胞变形器微流体测定来区分过表达核支架蛋白、核纤层蛋白A与模拟对照的HL60细胞的初步研究的结果。

图3示例说明可以如何使用MaPS来高效筛选药物文库。用药物治疗的细胞预期表现出增加的模量，例如在Lam等人(2007)Blood,109：3505-3508中所示。

图4示例说明在微流体通道网络内集成了MEMS振荡器和传感器的MaPS装置。

图5示例说明了在MAPs装置中微流体通道网络内MEMS振荡器和传感器的集成。

图6示例说明了在较大MaPS系统内的有源MEMS装置结构。振荡驱动在穿过探针接口时探测细胞。力传递至传感器探针，作为细胞模量的函数。图7给出更多细节。

图7示例说明图5和图6的复合，具有更多细节。

图8，图版A-E示例说明根据本文描述的装置的某些方面的MaPS 系统。如图版A中示例说明的，微流体网络具有三个平行通道。两个去离子水通道隔离电子组件，并且细胞介质通道递送细胞至MEMS装置。细胞介质通道具有分离细胞聚集物的滤器以及将细胞排列成单行的集中回路。MEMS装置由振荡器和测量位移的传感器探针组成。振荡器和传感器分别由梳阵列驱动和感测。图版B-E示例说明了MAP系统的各个元件。图版B：细胞集中阵列。图版C：MEMS振荡器和传感器。图版D：横梁弹簧系统。图版E：振荡器梳驱动。

图9示例说明了MEMS振荡器和传感器的简化模型。

图10，图版A-D示例说明MaPS装置的频率响应研究结果。图版A：振荡器频率响应，k₂＝0.5N m^-1。图版B：传感器频率响应，k₂＝0.5N m^-1。图版C和D：适应宽范围的k₂值以选择传感器弹簧常数k₂的设计研究的模拟证明。图版C：对于一定范围的预期传感器阻尼系数和设计的弹簧常数，在健康肺细胞和肿瘤肺细胞之间以500Hz致动频率的位移分层。图版D：来自图版C的水平组。

图11显示传感器电容是某些设计形式(例如设计形式2)的传感器位移的线性函数。然而，在某些构型/设计中，所述关系不需要是线性的。

图12提供了用于控制和感测MaPS中事件的一个集成系统的示意图。

图13示例说明了幅度调节的强制函数。

图14，图版A-C示例说明了MaPS装置的一个示例性但非限制性的实施方案的制造的MEMS组件。图版A：在单一100mm玻璃晶片上制造的380个单独MEMS装置。图版B：蚀刻穿至玻璃的Si元件的反射光显微镜图像。图版C：MEMS装置的扫描电子显微镜图像，说明了完整装置和关键特征。

图15A和15B示例说明硅基底上的氧化硅蚀刻掩膜。蚀刻掩膜 防止区域蚀刻；随后深度蚀刻去除硅，揭示了图6所示的特征。15A的初步结果显示于图16。图15A：设计1的蚀刻掩膜。图15B：设计3的蚀刻掩膜。

图16A和16B示例说明硅中蚀刻的高纵横比特征。图16A：图15的掩膜区域界定了非蚀刻区域。图16B：蚀刻区域比掩膜区域低～42微米；通过代表性特征的轮廓测定法评价。在实际制造方案中，粘附至玻璃的薄的(50μm厚)的Si晶片被蚀刻穿过。湿润蚀刻释放从玻璃释放移动元件，允许MEMS装置移动。

图17示例说明了设计A1(图版a)和A2(图版b)的MEMS装置层模式。

图18示例说明了设计A3(图版a)和A4(图版b)的MEMS装置层模式。

图19示例说明了设计A5(图版a)和A6(图版b)的MEMS装置层模式。

图20A和20B示例说明了可获自不同梳角度的梳驱动阵列的力的分析。θ＝0°取向等同于纵取向，并且90°是横取向。我们选择了30°取向，因为这能够使90度位移加倍，还可以实现比0度设计多很多倍的力，跨越位移范围(y轴)。图20A：所有梳角度0-90°的研究。锯齿边缘是达到最大位移的地方。图20B：0°、30°和90°设计的水平组。

图21显示了振荡探针的重力偏转(单位mm)。最大偏转是小的(<50nm)，并且不会降低性能。

图22显示了在2641Hz的第一共振结构方式。通过FEA评估的该值良好匹配动力学的第一原理分析(数据未显示)。该系统通常不受接近2600Hz的信号的驱动，所以未激发共振方式。

图23示例说明了减小尺寸的模型梳驱动系统的指之间的静电场强度。场强度作为立方函数衰减，因此闭合梳产生了比仅远离一点的梳显著更大的场强度。

图24A和24B示例说明了梳驱动系统的代表性频率响应曲线(以dB的幅度)。该曲线提供了针对不同的细胞模量，静电强制信号和传感器探针位置之间的频率响应。100％是健康细胞，不同的水平组是健康模量的百分比。图24B是图24A部分的放大。驱动信号具有在大约400Hz处的第一谐振频率以及来自场外0.5MHz运载频率的第二谐振频率，并且将显著衰减。

图25示例说明了如本文描述的MEMS装置的一个制造方案。

图26示例说明了如本文描述的MEMS装置的简化制造方案。简化程序不具有蚀刻进入玻璃基底的通道。在某些实施方案中，可以提供玻璃中的通道以从玻璃基底释放MEMS装置的移动特征(这将允许HF酸更快速地移动进入腔并蚀刻玻璃/Si界面)。

图27示例说明了振荡器的第一共振方式的FEA预测(DV1)。

图28示例说明了振荡器力作为振荡器位置函数的第一原理和相应的FEA预测(DV1)。

图29显示了MEMS振荡器在128Hz处的周期(DV1)。

图30，图版A和B显示了MEMS振荡器频率响应数据(DV1)。图版A：128Hz的基本驱动频率所需的时间信号的傅里叶转化，具有2A＝3.5V的正弦幅度。图版B：测试的每个基本频率的傅里叶转化的最大频率分量的幅度。数据通过F(ω)∝V²(ω)标准化。系统是非常线性的，如通过对由单一曲线参数化的所有操作幅度的数据证明的。

图31，图版A和B示例说明了旁路阵列细胞集中设计的数据。图版A：对于不同流速，旁路阵列入口和出口中沿通道宽度的细胞位置。在9μL/小时，分布显著狭窄(N＝样品大小；s＝标准偏差)。* 指示标准偏差的统计学显著差异；通过Levine检验，p<0.05。图版B：测量的细胞速度。平均细胞将接收每次通过1.5振荡器击中；平均μ＝4921μm/sec。

图32示例说明用于实现传感器灵敏度和传感电容范围的各个设计参数。表2给出每个设计的尺寸。注意，参数“叶”规定了振荡器或传感器每侧的叶(横梁对)的数目。在示例性实例中，振荡器和传感器每侧具有2叶。设计B5对于传感器具有三叶。

图33，图版A-C示例说明候选测试材料和预测的传感器频率响应。图版A：癌症测试材料和预期传感器位移的实例。图版B：MSC和分化谱系。图版C：聚合物测试材料。注意，y轴在图版C中的对数级。表3给出a–c来源。

图34示例说明了幅度调节的余弦波，具有脉冲函数运载波。

图35示例说明了粘性介质中角度梳驱动的模型。基本的质量-弹簧-阻尼器振荡器模型通过外源静电力作用。静电力F(x,t)是时间和位置的函数，其中所述力的方向为广义坐标x(t)。F(x,t)分解为作用于梳的切向F||和垂直F⊥力分量。垂直于F(x,t)的力理论上等于零，因为驱动围绕中心线是对称的。

图36A和36B。粘性介质中振荡器的线性动力学。图36A)阻尼系数、ζ和无量纲带宽之间存在大致反相关。曲线被重作为对数-对数曲线以证明两个可操作范围。空气或真空中的振荡器在弱阻尼区域内操作良好，其中ζ＜10^-1和带宽对ζ极大不敏感。水下振荡器在ζ∈(5，15)范围内操作，其中ζ有害地影响可操作的频率范围。图36B)弹簧常数和带宽之间存在大致线性关系。粘性阻尼改变了线性关系的斜率。逻辑上，当阻尼最小时更容易实现较大带宽。实施例中详细描述的设计具有b～1.25x 10^-3μN secμm^-1的阻尼。

图37A和37B示例说明了位移最大化的非线性静态力优化。图37A)其中k-10μNμm^-1并且θ＝20°的设计的(6)的平衡的证明。弹簧力与位移大致线性比例，而静电力作为三次多项式成比例。对于存在两个平衡，一个稳定并且一个不稳定。随着电压向 V_max增加，两个平衡集中于单个位移x_max，其是给定设计的理论最大的静态位移。图37B)存在对于任何给定k最大化位移x_max的最佳θ_max。随着弹簧常数增加，梳驱动必须产生在约束之内的较大力，并且因此θ必须较大。

图38示例说明了对于模拟的所有候选设计的方程(9)的参数大小范围。

图39A-39C示例说明了水下振荡器(9)的运动方程的傅里叶系列溶液。图39A)振荡器以不同的频率ω响应于应用的电压 时间轴通过频率标准化。图39B)水下振荡器作为频率函数的最大位移和相位移。幅度和频率的标准定义不适用于非线性系统；这里，我们利用来自图39A的最大位移和标准化时间位移(x_max(ω)和θ(ω)。图39C)可以通过以高频率调节来维持跨大频率范围的大位移。我们证明了可以高频率(>1kHz)实现大位移(>9μm)的特定水下振荡器设计。

图40A和40B示例说明在大于1kHz的频率大于5μm的位移的设计参数k和θ的优化。图40A)给定k和致动频率ω的可实现的x_max位移。图40B)给定k和致动频率ω的最佳驱动角度θ_max。

图41示意说明MEMS制造中的主要石印步骤。1)将Si晶片阳极结合至玻璃晶片。2)将Si侧变薄至50μm。5)设置金接触垫。7)设置SiO₂蚀刻掩膜。8)DRIE蚀刻Si元件。10)释放具有定时HF蚀刻的移动元件。

详述

为了给大群体内个体细胞的机械表型带来前所未有的检测速度和全面的群统计，提供了机械表征和分选(MaPS)平台。该微流体平台具有基于探针的检测，用于快速测量流动下的细胞。在某些实施方案中，MaPS集成了微流体网络与原位机械探针和传感器，用于直接测量个体细胞的弹性模量。而其他机械表型化装置需要计算机密集的图像分析，细胞粘附至基底，或者仅提供定性的对比的“变形性”数据， 本文描述的MaPS装置是即插即用装置，具有不需要荧光标记的定量读出器。因此，MaPS具有定量测定个体细胞水平的癌症治疗效力的极大潜力。重要的是，MaPS可以适于考察细胞的其他物理属性，例如其电性质或响应于施加的变形的松弛行为。

在某些实施方案中，本文描述的MaPS装置中的检测机制是基于模拟信号加工，并因此非常快速。活动分选机制可直接整合进入该装置，以通过基于细胞的变形性/模量而做出决定并然后快速地适当激活分选器而将细胞快速分选进入多个亚群之一。除了筛选化疗药物文库之外，最近结果表明，细胞变形性/弹性模量可用于分级卵巢癌细胞系的转移潜力(Xu等人(2012)PLoS ONE 7(10)：e46609；Swaminathan等人(2012)Cancer Res.71(15)：5075-5080)。较软的恶性细胞比较硬的恶性细胞更具侵入性(同上)。不受特定理论束缚，认为这些发现具有直接的功能关联，因为较软的细胞可以更容易穿过曲折的血管和淋巴网络而接种在第二部位。

对于横穿滤器的细胞以及随后通过显微镜评价，侵入测定通常需要至少数个小时。相反，使用本文描述的MaPS装置评价相同样品体积需要仅数分钟。MaPS还独特地能够评价赘生物内个体癌症细胞的机械性质的不均一性。此类表型多样性可以提供预测力(Calbo等人(2011)Cancer Cell,19：244-256)。而且，已经显示对病理学例如疟疾(Bow等人(2011)Lab on a Chip,11：1065-1073)和镰状细胞性贫血(Higgins等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104：20496-20500)的不同机械签名。干细胞在分化期间还经历了其分子组成的显著变化，并且这些变化是通过其机械性质可测量的(Pajerowski等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104：15619-15624)。存在极大前景：描述的MaPS也用于诊断和评价这些病理和生理转化。

高通量的机械表型化

在各个实施方案中，本文描述的MaPS系统允许以每秒大于约 10²个细胞/秒、或大于约10³个细胞/秒、或大于约10⁴个细胞/秒的速率机械表型化。通量可以放大，例如通过使用多个通道，并且认为大于约10⁵个细胞/秒、或大于约10⁶个细胞/秒、或大于约10⁷个细胞/秒、大于约10⁸个细胞/秒的能力是可实现的。这有利于快速且有效评价机械表型是不同环境中细胞的生理和病理状态的标志物的程度。

为了实现该目的，在某些实施方案中，MaPS将活动微电子机械系统(MEMS)与振荡器和传感器探针集成进入微流体装置(参见例如，图4和图8)。本文描述的方法构建于探测细胞弹性模量的现有方法的强度。然而，本文描述的MaPS系统实现了个体细胞的灵敏的力探针测量和通过连续流动细胞经过微流体网络内的力探针而探测大量细胞的能力。现有的基于探针的方法，例如AFM，用于获得固定就位的个体细胞的力变形响应的精确测量。另一方面，微流体装置能够具有更高检测速率，但是缺乏机械测量中的定量精确度。例如，可以通过流动细胞经过微流体装置的狭窄束缚(Rowat等人(2013)J.Biol.Chem.doi：10.1074/jbc.M112.441535)(参见例如，图2A-2C)，或者通过使它们以升高的流动惯性经受流体相互作用产生的力(Hur等人(2011)Lab on a Chip,11：912-920)，而探测超过500细胞的变形性。虽然基于流动的方法可以实现超过10²个细胞/秒的检测速率(同上)，但是这些方法取决于不可实时实现的计算机密集的图像加工。

相反，MaPS开发了细胞通过微流体装置通道的流动，以及处理模拟信号数据的基于MEMS的测量系统，并且可以因此以10³个细胞/秒的显著更高的检测频率操作。以与FACS相当的检测速率，该新的机械表型化方法在癌症预后和治疗以及其他环境中具有广泛应用性。

开发微流体通道中的流动以操控细胞

MaPS开发了通过微流体通道的流动以前所未有的速率移动细胞经过力和传感器探针。MaPS的主要流体管线是细胞流动通道(参见例 如，图4)。经过流动通道的细胞流动和振荡器探针和传感探针(例如，如下所述)测量了细胞对所应用力的机械响应。

可以通过测量校准的结构的位移来计算软材料例如细胞的顺从性，具有与测试材料接触相似的顺从性。在静态接触中，细胞的相对位移δ_c和校准的结构δ_s实现为位移除法器：

$\frac{{\delta }_c}{{\delta }_s}=\frac{k_s}{k_c}$

其中位移比率是两种材料的有效弹簧常数k_c和k_s的反比。弹簧常数采取几何和材料模量。校准的横梁结构具有用于有效弹簧常数计算的良好确定的模型。细胞是较不直接向前的。在一个示例性方法中，线性化的赫兹接触模型(Landau和Lifshits,Theory of Elasticity：Pergamon Press,1965)(与平板接触的弹性球)从细胞模量推导有效的弹簧硬度，并且还假定细胞响应取决于接触速度，采取kelvin-voigt模型的形式(图9)。

类似于许多常见的机械表型化方法，MaPS通过使细胞偏离校准的探针而检测细胞机械表型。主要的检测机制是微电子机械系统(MEMS)探针。通过模拟不同的设计参数，在某些实施方案中，选择的MEMS设计加入了置于微流体通道相对侧的两个探针(参见例如，图4)。在一侧，振荡探针以大约200Hz至2kHz、或从约300Hz至约1kHz、或从约400Hz至约600Hz以及在某些实施方案中以大约500Hz的频率和从约4至约25μm或从5至约10μm以及在某些实施方案中约10μm的位移振荡。直接相反，转向对强制输入例如对500Hz强制输入敏感的位移传感器测量了迫使细胞进入传感器的振荡器所施加的位移。当参考这些分量时，本文使用振荡器和传感器。

在各个实施方案中，振荡器探针以如下频率振荡：使得穿过细胞在细胞流经探针接口期间在简短的～10msec时间段内被探测多(例如，大约1-5)次。在缺乏任何细胞时，进入流体填充的通道的振荡器 探针的位移将简单地迁移流体。然而，当细胞穿过探针接口时，移动的振荡器探针产生的力将通过细胞传递至相对的传感探针；传感探针的得到的位移将取决于穿过细胞的弹性模量。

可以通过使用注射器(或其他)泵调节悬浮细胞密度和流体流速来调节细胞检测频率。操纵细胞通过微米级通道的流动也提供了对MEMS装置的探针接口的供检测的细胞位置的精密控制。在某些实施方案中，鞘流动可用于将细胞汇集成单一流线，供本文描述的系统中检测。

kHz检测速率的力探针

在某些实施方案中，用于驱动和感测的两个探针使用交错的梳指或梳驱动的阵列。为了致动探针，跨梳对施加电压(电势)以产生吸引力。为了作为位置传感器操作，位置依赖性电容可以跨梳对测量。驱动探针和传感器探针都可以通过细长的横梁弹簧返回其中性位置(参见例如，图4-8)。横梁构造可以被设计为仅允许沿着运动方向并且不明显以垂直框移动。在各个实施方案中，完整MEMS装置可以从单个裸片的(例如掺杂硅)微机械加工。为了实现快速检测，振荡器的位置可以例如如上所示500Hz的基本频率驱动。

完整的振荡器、传感器和细胞系统可以通过假定振荡器和传感器各自用作质量、弹簧、阻尼器系统并且细胞用作kelvin-voigt材料而模拟(参见例如，图9)。振荡器和传感器各自通过其各自弹簧固定于固体基底，并且通过应用的外部力驱动振荡器。振荡器和传感器的弹簧常数和质量可以通过调节探针几何来设计。在预期的驱动频率范围评价振荡器/细胞/传感器系统的频率响应以指导设计。

MaPS的一个考虑的应用是高通量诊断赘生细胞(肿瘤或非肿瘤癌细胞)。在该背景下，一个重要的量度是在大约例如500Hz的频率下健康细胞和赘生细胞之间传感器位移信号的估计的分层(Cross等人(2010)Nature Nanotechnology,2：780-783)。图10，图版A示例说 明了k₂＝0.5N m^-1的振荡器频率响应，而图10，图版B示例说明了k₂＝0.5N m^-1的传感器频率响应。图10，图版C和D示例说明了如从之前设计重复经验确定的预期阻尼系数范围内弹簧常数k₂的设计空间。传感器位移是小的，并且因此传感器保真度是重要的。k₂＝0.50N m^-1的传感器弹簧常数产生了足以分辨细胞机械表型的频率带宽和测量分层。

MEMS组件

振荡器和传感器

在一个示例性实施方案中，振荡器和传感器是结合至玻璃基底的低电阻硅的单个裸片的蚀刻形式。可移动的结构被穿孔以允许移动元件通过下面的玻璃基底的定时酸蚀刻而从玻璃基底释放。大的单块结构(例如，>20μm特征尺寸)维持结合至玻璃。在一个实施方案中，每个弹簧包括从硅切割的八个细长横梁，并且横梁系统被设计具有指定的弹簧常数。

振荡器和传感器可以被梳指形式的平行板阵列驱动和感测。阵列例如这些所谓的梳驱动是MEMS致动器和传感器中常见的(Dong等人(2007)J.Micromechanics Microengineering,17：154-1161；Sun等人(2002)Sensors and Actuators A,102：49-60；Sun等人(2002)J.Micromechanics Microengineering,12：832-840)。通过跨梳对施加电压电势而驱动致动器，以产生吸引的静电力；通过测量电容变化而感测位移。有两个基本设计：1)纵向设计(θ＝0°，图8，图版E)其中移动的梳横跨平行于梳面，和2)横向设计(θ＝90°，图8图版E)其中移动的梳横跨垂直于梳面。特征上，纵向驱动应用比横向驱动相对较弱的力，但实现了相对较高的位移。在某些实施方案中，MaPs装置中使用的振荡器设计是纵向和横向设计的杂合体，θ范围从约5°至约40°、或从约10°至约30°、或从约15°至约25°。在一个示例性但非限制性实施方案中，θ＝20°(图Error！Reference source not found.，图 版E)。该构型实现了大位移(比横向设计近3x更大的范围)和高力(在中性位置比纵向设计2.5x更大，并且在完全位移时25x更大)。而且，导致横向设计中有害的“拉入”不稳定性的位移依赖性非线性显著减少(Sun等人(2002)Sensors and Actuators A,102：49-60)。

传感器可以具有纵向梳阵列设计，因为在某些实施方案中，传感器弹簧k₂被设计为比振荡器更弱的幅度级别以感测软的细胞材料，并且电容测量回路利用的信号(例如，100kHz方波信号)可以在某些实施方案中对传感器施加小力。纵向设计最小化所述力。传感器电容是传感器位移的线性函数(参见例如，图11)。一个示例性的电容传感器(MS3110BDPC-USB,Irvine Sensors,Irvine,CA)具有大约89aF的分辨率，提供了大约1400个管线的分辨率，用于区分癌细胞与健康细胞，通过图11和图10，图版B中的分析图。

微流体网络

MEMS振荡器和传感器通常集成入微流体网络。设计微流体网络进行两个功能：1)将单行细胞流递送至MEMS装置供测量，和2)将振荡器和传感器电子仪器浸入水(例如，去离子水)中，伴随水和细胞介质的最小混合。在某些示例性但非限制性实施方案中，微流体网络主要由PDMS(或其他软石印材料)“帽”组成，具有在MEMS装置周围密封的减轻的通道构造。流体网络的小部分可以通过蚀刻的硅元件确定。

细胞介质通道

如图8示例说明的，在某些实施方案中，细胞介质通道由入口、解聚细胞团块并滤掉残渣的细胞滤器、细胞集中区、递送细胞至MEMS探针接口的收敛管道和出口组成。细胞集中回路使用运载流体作为实际的鞘流(Aoki等人(2009)Microfluidics and Nanofluidics,6：571-576)。多个平行的旁路通道提取网络第一半中的运载流体而非较大的物体例如细胞，然后将提取的流体轴向再注射入网络的第二半。 该旁路设计有效减少了均一分布的细胞流周围的流体速度，然后通过垂直撞击细胞流的低速流体流序列集中细胞。有关说明细胞流集中的实验结果，参见图31。

去离子水通道

为了提供生理相关的测量结果，装置可以在如上所述的水环境中操作。然而，细胞介质通常具有大约～150mmol的离子浓度，并且如果MEMS装置以简单DC或低频率(例如，<10kHz)正弦电压操作则可以引起严重的充电效应。然而，如果采用对溶解离子比可以物理重排的离子更快地倒转偏移的信号传导方案，静电梳驱动可以在离子溶液中操作(Mukundan等人(2009)J.Micromechanics and Microengi neering,19：065008；Mukundan和Pruitt(2009)J.Microelectricalmec hanical Systems,18：405-413；Sounart等人(2005)J.Microelectrical mechanical Systems,14：125-133；Sameoto等人(2004)J.Micromech anics and Microengineering,14：1359-1366)。在某些实施方案中，对于高离子浓度流体，信号极性以大约～10–100MHz的速率转换，这接近常规函数生成器的限值。研究者已经证明了在150mmol浓度下严重降解的静电力。相反，浸入去离子水的MEMS装置可以有效地以低得多的频率例如～100–500kHz操作，而没有力降低(参见例如，Mukundan等人(2009)J.Micromechanics and Microengineering,19：065008)。

相应地，在某些实施方案中，MaPS设计集成提供了具有至少两个流体通路(流体管线)的微流体网络。电子组件浸入基本上纯(例如，DI)的水的稳定流中的蒸馏水或去离子(DI)水通路，其中最佳频率是仅～0.5MHz，以及含有细胞的细胞介质通路。水和细胞介质通路会在力探针区域附近混合，然而，本文考虑的微流体网络通常以分层流动方式操作，并且混合仅通过扩散而发生。结果，去离子水和细胞介质将不会明显在MaPS内的流体驻留时间刻度上混合。

突出特征

存在辅助MaPS性能的几个微流体设计细节。PDMS“帽”在二水平元模上模制，具有确定主要特征的主要水平和提供移动MEMS元件与PDMS墙之间额外清洁的薄(例如，～5μm高)减轻水平。减轻用于有效降低图9中的粘性阻尼项b₁和b₂。

在不同实施方案中，电触头(例如，片)通过PDMS中冲击的孔伸出。触头可以弹簧负载以维持电接触，并且孔的大小可以调整以适合将触头容纳就位并不泄露流体。

MPaPS系统

包括示例性而非限制性的MaPS系统实施方案的高水平组件的概况显示于图12。在大规模上，MaPS对接计算机(微处理器)，具有数据获取(DAQ)板、高频率信号生成器、电容传感硬件和可控制的泵(例如，注射器泵)。在小规模上，MaPS由分离、集中和递送细胞至检测位置的微流体网络和用于机械表型化作为运载流体的细胞介质中运送的细胞的振荡MEMS致动器和传感器组成。与细胞介质运送流平行，蒸馏水或去离子(DI)水流可用于隔离电子组件与高离子浓度细胞介质。该系统以分层流动方案放大/操作，从而最小化对流混合以维持隔离的流。

电子系统和外围设备

具有小规模特征的MaPS与大规模硬件对接以驱动电子信号和流体。电子信号被特别设计为驱动具有浸入水性介质中的荷电表面的系统。类似于Mukundan和Pruitt(2009)J.Microelectricalmechanical Systems,18：405-413，MaPS可以使用高频率信号方案来掩蔽离子效应。然而，替代具有不变幅度的正弦波，在某些实施方案中，MaPS使用了幅度调节(AM)信号传导方案，其中以高频率(大约500Hz)运载频率调节基本频率(大约500Hz)：

$V\left(t\right)=A(\frac{1}{2}+\frac{1}{2}\sin \omega t){\mathrm{sin\omega }}_{c}t---\left(1.1\right)$

其中A是信号幅度，并且ω和ω_c分别是基本频率和运载频率(图13)。

力与电压平方大致成比例(F(t)∝V(t)²)。扩展V(t)²至正弦波之和，方程(1.1)对DC分量、ω下的高幅度分量、具有ω下幅度的四分之一的2ω下的分量和接近2ω_c的五个不连续的高频项(H.F.T.)作图。

$F\left(t\right)\propto A^2(\frac{3}{16}+\frac{1}{4}\sin \omega t+\frac{1}{16}\sin (2\omega t-\frac{\Pi }{2})+H.F.T)$

基本频率在振荡器带宽之内，并且振荡器将立即响应于该较低频率信号，具有基本上零相滞后(图10，图版C)。运载频率足够高于振荡器和传感器带宽并且将完全衰减。

电容传感器(例如，Irvine Sensors MS3110BDPC-USB,Costa Mesa,CA)应用100kHz方波至传感器阵列。尽管预期测量阵列电容，这也应用吸引力至阵列。在该实例中，DC分量对梳力作图，具有0.125μN的幅度，其偏移阵列0.25μm，并且处于和高于100kHz的谐波全部衰减。

操作

在各个实施方案中，振荡器/传感器测量系统基于模拟和数字信号处理。来自MEMS装置动态模拟的初步结果指示，电容测量系统能够检测细胞之间模量的相对差异。具有～2kPa弹性模量的“健康”人细胞的测量信号是癌细胞(例如，人类早幼粒细胞白血病细胞(例如，HL-60细胞))的大约4倍，～0.5kPa(Suresh(2007)Acta Biomaterialia,3：413-438)。在各个实施方案中，可以用与商业软件系统集成的电容传感板(例如，Irvine Sensors MS3110BDPC)测量传感器位移。其他MaPS组件也可以与计算机软件对接以统一控制。在某些实施方案中，振荡器可以由信号生成器(例如，Tektronix AFG3251)驱动。该完全灵 活的电压源能够使用户可互换地且同时探测不同深度，例如如下所述。在某些实施方案中，注射器泵(Harvard Apparatus)或其他泵或流体递送装置可用于控制流体流速。在某些实施方案中，压力驱动的流动可用于调节流体流速。可以使用数据获取系统(例如，NI 9235)获取数据并对数化。软件包(例如，写于)可以提供图形用户界面，其允许完全控制集成的系统(参见例如，图12)。

在某些示例性实施方案中，装置可以用例如400Hz或500Hz的基本频率和0.5MHz的运载频率操作。该信号方案与幅度调节的(AM)无线电信号基本相同。重要的是，可以调制强迫信号的DC补偿以调节探针偏移距离(例如，通过～0μm至～6μm的范围)。这使得用户能够探测进入细胞的不同深度，例如，以测量细胞支架或细胞核机械性质。控制探针深度的能力也可以适应比限制于预定通道构造的静态微流体装置更大范围的细胞(或颗粒)尺寸(例如，大约1μm至约1mm，或约1μm或约2μm，或约3μm，或约4μm，或约5μm至约500μm，或至约250μm，或至约150μm，或至约100μm，或至约50μm，或至约40μm，或至约30μm，或至约20μm，或至约15μm，或至约5μm)。

为了实现更高的检测速率，可以将多个MEMS探针集成进入具有分支构造的单个微流体网络。在此类实施方案的某些构型中，细胞在一个入口移行，然后分出至不同的MEMS传感器。

在某些实施方案中，所有MEMS振荡器可以由平行构造分布的相同驱动信号来驱动。传感器电容标准度量可以独立测量。可以使用已知的弹簧硬度，将来自传感器探针的集成梳指的位移测量对传送的力作图。传感器盒数据通过计算机对数化，并用简单的用户界面显示以用于解释；例如，类似于FACS的直方图形式是显示对>100个细胞/sec获得的模量测量的常规方式(图12)。在某些实施方案中，软件包特征为统计工具，以评估群体均值和方差。个体细胞大群体的机械性质的此类全面统计分析是使用目前机械表型化技术所不可能实现 的。因此，本文描述的MaPS系统和装置代表了诊断能力上的显著进步。

制造MaPS。

在各个实施方案中，MaPS装置集成了MEMS致动器在微流体通道内。MEMS装置可以通过一系列标准石印过程制造，以产生微米级移动结构，其位置可以用100nm空间分辨率调节以探测个体细胞。超过200个单独MEMS装置可以在单个四寸硅晶片上制造。蚀刻MEMS特征的一个示例性蚀刻掩膜(图6中灰色显示)显示于图15，并且来自蚀刻实验的示例性结果显示于图16。

在一个示例性方法中，MaPS以两个平行工序制造，两个平行工序都利用了石印微机械加工。玻璃上固定的MEMS装置和微流体网络独立制造，然后在最后制造步骤对齐和结合以完成MaPS装置。示例性的MEMS、微流体和MEMS/微流体集成制造方法在下文描述。

MEMS制造

MEMS制造的一个示例性且非限制性方法示意描述于图41，并且在下文详细描述：

1)具有<1-0-0>取向的低阻抗(0.005–0.020Ω-cm)p型硅晶片(Ultrasil,Hayward,CA)被阳极结合(例如，使用Karl-Suss结合剂)至Pyrex 7740玻璃晶片(Plan Optik,Elsoff,Germany)(参见例如，图41中的步骤1)。

2)将Si侧变薄至例如50μm，研磨并抛光至工业标准光洁度(RMS～1nm；由Aptek Industries,San Jose,CA进行)(参见例如，图41中的步骤2)。

3)通过电子束蒸发将Cr/Au膜沉积在硅表面上(CHA溶液；8.5nm Cr,392nm Au)。

4)通过用光致抗蚀剂(例如，SPR700-1.2)旋转涂布，暴露于UV，并展开以开放待蚀刻的特征，来模式化蚀刻掩膜。注意，该装置取向使得振荡器和传感器平行于<1-0-0>平面移动。

5)以定时的酸蚀刻选择性蚀刻Cr/Au膜(TFA Gold Etchant(Transene,Danvers,MA)，随后CR-7S(Cyantek,Fremont,CA))。

6)通过PECVD(Plasmatherm 790)沉积750nm SiO₂膜。

7)通过光刻法和干燥蚀刻来制造装置层蚀刻掩膜。

8)DRIE硅特征穿至玻璃(Unaxis DRIE)(参见例如，图41中的步骤8)。

9)通过片切割来分离个体裸片。

10)通过玻璃层的定时HF湿润蚀刻从玻璃层释放可移动的MEMS元件(1：1HF：H₂O，以100rpm搅拌的溶液)。该步骤还去除了剩余的SiO₂蚀刻掩膜(参见例如，图41中的步骤10)。

11)通过关键点干燥来干燥MEMS装置。

制造图像说明通过设计的工序可实现的高制造保真性(图14)。重要的是，已经主要针对高分辨率集成回路生产而开发了微机械加工，因此细胞长度规模级别上的特征可通过标准清洁室中的工具容易实现。如通过光学和扫描电子显微术测量的，所有特征可以在设计的特征尺寸半个微米内制造(参见例如，图14，图版C)。由DRIE指导蚀刻的硅元件具有最小的扇状征。来自离子轰击和之后在Si/玻璃界面反射出玻璃表面的纳米级缺陷可以通过SEM观察。然而，给定与特征尺寸相比的缺陷的长度级别，这些表面缺陷影响MEMS性能是不可能的。

PDMS微流体通道制造

在各个实施方案中，密封装置并确定微流体网络构造的PDMS(或其他软石印材料)“帽”可以通过标准软石印方法制造(Rogers和Nuzzo(2005)Materials Today,8：50-56)。简言之，SU-8(MicroChem Corp.,Newton,MA)阴性光致抗蚀剂在Si晶片上旋转至所需厚度；光致抗蚀剂形成微流体通道的阴极，因此所需的厚度是所需的通道高度。光致抗蚀剂选择性暴露于UV光以交联聚合物，然后在暴露后烘烤中加热。将未暴露的光致抗蚀剂溶解于显影的溶液，其余的光致抗蚀剂用硬烘烤完全硬化。PDMS预聚合物和交联剂(Sylgard 184,Dow Corning,Midland,MI)倾倒在微制造的阴极上，脱气，然后烘烤至交联。从倾倒的PDMS块切割个体PDMS裸片，并且使用活检穿孔器在PDMS中冲击访问孔。

在某些实施方案中，MaPS设计利用了双层PDMS裸片。主要层高度50μm，确定了微流体网络构造，而较短的10μm层产生高于可移动MEMS元件的凹口以促进其运动。双层构造可以使用两次光致抗蚀剂应用和暴露来制造(参见例如，Doll(2009)Lab on a Chip,9：1449-1454)。

虽然前述讨论引用PDMS作为软石印材料，许多其他材料也是适合的，并且本文描述的装置不限于特定材料或构型。就这点而言，注意其他弹性体是适合的。此类弹性体包括但不限于烷基化的氯代磺化聚乙烯(例如，)、聚烯烃弹性体(例如，)、氯代磺化聚乙烯(例如，),全氟弹性体(例如，)、氯丁橡胶聚氯丁烯、乙烯-丙烯-二烯三聚体(EPDM)、氯化的聚乙烯(例如，)、各种硅氧烷聚合物(例如，聚二甲基硅氧烷等)等。

校准MaPS。

可以使用例如已知表现出在药物治疗后机械模量差异的人类早幼粒细胞白血病(HL60)细胞来验证MaPs系统(Lam等人(2007)Blood,109：3505-3508)。为了开发模型细胞机械和测量的传感器数据之间 更详细、经验的关系，可以使用聚合体“模型细胞”校准MaPS。

可以购买或制造具有与细胞类似的确定的弹性模量(例如，～0.1至～10kPa)和尺寸(例如，～10至～30μm)的聚丙烯酰胺颗粒。可以使用分开的微流体制造模型细胞以产生油包水乳液滴：水相含有形成聚丙烯酰胺凝胶的必要前体。通过增加聚丙烯酰胺颗粒内的化学交联剂的密度，模型细胞可以用增加的弹性模量产生。通过调节通道宽度和流速，可以调节粒径(Seiffert和Weitz(2010)Soft Matter,6：3184-3190)。这种制造方法可用于产生包括各种生物聚合物的微凝胶颗粒，所述生物聚合物例如血纤蛋白、胶原、或可以更好概括细胞的粘弹性性质的藻酸盐。此类凝胶还可以提供针对MaPS的重要的校准步骤。虽然水凝胶的整体性质与微米级凝胶颗粒的机械性质良好相关(同上)，还可以使用例如AFM(CNSI)和微量移液器抽吸来验证模型细胞机械性质。

各种示例性构型

使用本文提供的教导，本领域技术人员可获得装置和方法的许多变化形式。例如，实施例中示例说明了许多不同的设计。在各个实施方案中，MEMS装置的晶片用其上MaPs的许多构型来制造。

在某些实施方案中，振荡器和传感器可以集成为单个组件。不同于其中探针和传感器在通道的对侧的图15图版A和图17图版A中的构造，其中振荡器和传感器集成为一体的示例性设计显示于图15图版B、图18(设计A3)图版a和图19图版B(设计A6)。15图版A中显示的蚀刻掩膜产生的结果示例说明于图16)。

在集成振荡器/传感器实施方案中，替代测量通过细胞传送的力，测量了通过细胞破坏由振荡器驱动信号驱动的正常振荡模式的程度。可以通过集成传感器来测量位置模式，并且可以用数据获取软件分析输出信号的基本频率分量。在某些实施方案中，振荡模式的测量可以通过锁相扩增器或小波分析来进行。

可以设计细胞探针接口处的许多等效探针形状。在某些实施方案中，选择略微凹陷但相当平的设计，但是本文描述的装置不需要限于这样的形状。

此外，梳角度可以变化。在某些实施方案中，示例说明了振荡器梳的30度角度和传感器梳的90度角度。选择这些设计以提供某些特定应用的最佳性能，但是其他梳取向也是可行的。这些已经被考虑并进行分析，参见例如图20A和20B。

在各个实施方案中，探针头可能是应用至细胞的其他类型的测量或刺激。例如，还可以在探针与细胞接触时测量细胞阻抗。细胞阻抗已经用于分类细胞类型，提供了额外的检测功能(Chen等人(2011)Lab on a Chip,11：3174-3181)。在本文描述的MaPS装置的某些实施方案中，移动体是接地的，并且由掺杂(电导性)的硅制成。然而，存在选择性掺杂硅以产生沿着某些路径的电阻抗的石印方法。本文描述的生产方案可以加入选择性掺杂未掺杂的硅晶片，以指导电信号并允许细胞阻抗的探测。而且，可以向硅表面添加金属层以指导电信号。几乎相同地，除了使用更高的电压差，个体细胞可以被电穿孔以增加细胞的电导性和穿透性。MaPS提供了比目前技术更有效的电穿孔选定个体细胞的方法(Khine等人(2005)Lab on a Chip,5：38-43)。

主要驱动信号的～400Hz和运载频率的0.5MHz的所述频率反映了有效的起始值。要理解，这些可以变化。装置的频率模拟预测，200Hz至700Hz范围内的主要驱动信号是可行的，并且对于运载频率超过10⁴Hz的频率会允许水介质中的致动，并且不影响机械组件的移动，参见图24和表1中的频率分析。

表1.设计组和模拟的输出值。

此外，上述驱动频率例如～400Hz的描述假定了正弦信号形状。考虑其他驱动信号形状。例如，因为吸引力是非线性的，通过具有非规则但是周期的信号形状，使用相反动力学，补偿该非线性行为可能是有利的。已经为开发适当驱动信号形状的目的而确定了位置依赖性力的FEA测量。在某些实施方案中，可以相对于仅单个正弦驱动信号而使用双模式探测波形(形状)。这可用于探测交替循环的交替深度。这将是复合正弦，其中400Hz驱动信号将探测一个循环的一个深度以及下一个循环的另一个深度，然后重复。同时，在某些实施方案中，去离子水用作低离子含量流体来浸没驱动电子仪器。在某些实施方案中，非水性选项是可用的。此类选项包括但不限于油和溶剂。

前述变体预期是示例性而非限制性的。使用本文提供的教导，许多其他构型、材料和操作方式是本领域技术人员无需过度实验而可获得的。

其他示例性用途

MaPS具有成为多用途工具的潜力，在机械表型化中起改革作用。MaPS可以前所未有的通量和效率进行机械表型的定量、高通量评估。认为MaPS将打开开发用于从药物和天然化合物文库以及微RNA组合筛选治疗的机械表型化的新道路。因为人类卵巢癌细胞的侵染力程度在细胞机械表型变化中显现(Swaminathan等人(2012)Cancer Res.71(15)：5075-5080)，MaPS应该具有基于细胞的转移效率而筛选的潜力。而且，MaPS具有揭示大群体内个体细胞机械性质中的异质性以及可能的功能暗示的潜力(Calbo等人(2011)Cancer Cell,19：244-256)。随着流式细胞计量术和FACS的到来而出现类似转化，其大量个体细胞的评价以及群体内的易变性。此类研究会提供对癌症细胞群体内异质性的遗传和后天来源的观察，包括药物抗性以及预后分层。而且， MaPS是良好平衡的，配有基于机械表型而分选细胞的能力，由此实现对例如表现出药物抗性的细胞亚群的实验；此类高通量功能性在目前的机械表型化技术中是不可实现的。

前述用途和实施方案是示例性而非限制性的。例如，虽然上述一个应用是细胞力学的表型化和基于该标准的分选，但是其他应用包括但不限于微粒表征和分选、微生物或植物细胞表征、流体粘度测量等。在各个实施方案中，表征可以基于机械、电子、物理性质等。

其他示例性但非限制性的应用包括以下：例如。MAPs可用于评价辐射暴露。白血细胞的机械性质在暴露于γ照射后改变(参见例如，Selim等人(2009)Romanian J.Biophys.,19：171-185)。使用MaPs检测血细胞的机械性质可以提供检测暴露幅度和时间的无标记方法。类似地，红血细胞的机械性质变化随糖尿病而发生(参见例如，Goldstein等人(2004)Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol.242：937-943；Cho等人(2008)J.Diabetes Sci.Technol.,2：1130-1138；Mantskava等人(2006)Clin.Hemorheol.Microcirc.35：307-310；Singh和Shin(2009)Indian J.Exp.Biol.47：7-15)。认为MaPS可以因此用作筛选糖尿病的筛选工具。MaPS也提供了检测和分离干细胞的手段。高质量干细胞是治疗应用所必需的。多能干细胞可以通过其机械性质而与分化的细胞相区分(参见例如，Gossett等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,109：7630-7635；Engler等人(2006)Cell,126：677-689；Pajerowski等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104：15619-15624)，并且MaPS可用于检测这些差异。

红血细胞的机械性质变化在恶性疟原虫感染后发生(参见例如，Marinkovic等人(2009)Am.J.Physiol.Cell Physiol.296：C59-64)。MaPS因此可用于筛选疟疾，具有鉴别早期感染的潜力。

红血细胞减少的变形性随着镰状细胞病而发生(参见例如，Higgins等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104：20496-20500)。使 用MaPS机械分型可以提供对筛选基因疗法方法的读出，其可以抑制细胞脱氧之后的硬化。

还认为MaPS可用于提供临床环境下的实时癌症诊断。例如，个体细胞的机械顺从性可用于测定卵巢癌细胞的入侵潜力(参见例如，Xu等人(2012)PLoS One,7：e46609,2012；Swaminathan等人(2012)Cancer Res.71：5075-5080)。而且，卵巢癌的药物抗性变体与药物敏感变体的机械性质存在不同差异(Lam等人(2007)Blood,109：3505-3508)。有区别的药物抗性癌症亚型通常由分子(蛋白、基因表达)分析来实现。然而，在许多案例中，患者接受他们不响应的化疗治疗；对于患者和医护系统而言，造成的成本高。MaPS可用于鉴别此类药物抗性癌症亚型，并相应地调整治疗方案。

通过其实时机械分型能力，MaPS可用于评价临床环境下的人类活检的组成。手术过程中的主要挑战是不确定肿瘤已经彻底清除以及边缘细胞不是恶性的。原子力显微术揭示了跨人类乳腺活检样品的不同的机械签名，内部癌症细胞比外周细胞更软(参见例如，Plodinec等人(2012)Nat.Nanotechnol.7：757-765)。MaPS可以实现离散成单细胞悬液的活检样品的实时分析，用于指导手术决定。目前方法通常依赖于细胞的组织学、增殖或生化分析。

在某些实施方案中，本文描述的MaPS系统可用于癌症治疗和药物筛选。癌症细胞用药物治疗之后机械性质的改变表明机械分型指导治疗决定的潜力。例如，白血病细胞显示用化疗剂治疗之后过渡时间的10倍增加？(参见例如，Lam等人(2007)Blood,109：3505-3508)。最近结果还以显示微RNA治疗过表达之后改变的细胞变形性的证据。如通过互补测定证明的，这些结果与减少的细胞增殖相关。MaPS具有提供实时机械分型的潜力，其可以提供临床环境下对治疗决定的互补指导。

在某些实施方案中，认为本文描述的MaPS系统可用于评价阿尔 茨海默病。淀粉样蛋白前体蛋白(APP)是β淀粉样蛋白的前体，β淀粉样蛋白是其聚集导致淀粉样蛋白斑形成的肽，常见于阿尔茨海默病患者的脑中。如通过原子力显微术测定的，用淀粉样蛋白-β42(Aβ42)蛋白寡聚体治疗的神经元细胞显示了显著的细胞硬化(参见例如，Lulevich等人(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107：13872-13877)。目前没有针对阿尔茨海默病有效治疗的良好筛选。筛选细胞的高通量方法可用于鉴别防止β淀粉样蛋白聚集或者甚至导致β淀粉样蛋白形成的APP裂解的化合物。

本文描述的MaPS系统可用于设计和制定药物递送系统和生产此类系统过程中的质量控制。水凝胶微胶囊已经广泛用于药物治疗剂的控制递送。水凝胶中的溶质扩散取决于水凝胶溶胀程度，其是聚合物组成和网络交联密度/筛尺寸的函数。例如，较硬的壳聚糖包衣的微胶囊显示了较低的药物释放速率(参见例如，Veiga等人(2011)J.Appl.Polymer.Sci.,123(2)：842-849)。因此，使用MaPS对水凝胶胶囊的机械表征可用于指导药物递送系统的设计和制定，以及监测其制造过程中的质量。

除了涉及测量细胞硬度/变形性的应用，本文描述的MaPs装置还可用于直接操纵单细胞。在某些实施方案中，力探针(例如，梳)可用于迁移目标，例如固体颗粒或液体。例如，探针的良好控制的空间振荡可用于迁移流体，从而分选细胞。当探针刚好置于流体通路结合处(例如，微流体通道中的Y结合处)上游时，流动下的流体、固体颗粒或细胞的垂直位移可以将目标/流体/细胞迁移进入单独通道。当响应于给定输入条件而激活时，这种构型可用于主动分选颗粒或细胞。

MaPS装置还可用于单细胞电穿孔。在某些实施方案中，可以设计制造方案，使得电线路选择性掺杂在硅MEMS振荡器内。这使得MaPS能够机械探测细胞，并施加电场以选择性电穿孔细胞。由于模拟信号通路在MEMS装置中是快速的，可以选择性应用电场，使得仅一些细胞被电穿孔，而其他细胞没有。这允许生物学家人工异质化 细胞群。

在各个实施方案中，本文描述的MaPS装置可用于细胞捕获。在某些实施方案中，MaPS可以转变成低通量装置，并且振荡器和传感器可用作可以轻易捕获和释放细胞的细胞捕获装置。在捕获期间，细胞可以短暂暴露于刺激。可以向较大的MaPS构造增加试剂管线，以向捕获细胞递送计量剂量的试剂。这允许给予群体中的个体细胞计量的剂量。因此，在某些实施方案中，MaPS可用于分级具有不同试剂剂量的细胞群。其他捕获实施方案可以包括扩展的机械测试以探索细胞群的蠕变和疲劳性质。

前述用途预期是示例性而非限制性的。因此，使用本文提供的教导，本领域技术人员可获得许多其他MaPS构型和用途。

实施例

提供以下实施例以示例说明而非限制要求保护的发明。

实施例

示例性实施方案

为了加快MaPS开发，开始设计了一组六个MEMS构造，并命名为A1至A6(参见例如，图17、18和19)。设计该组以跨预期细胞弹性模量的范围，并以略微差异的动态范围和传感器灵敏度来操作。为了表征这些MEMS装置设计的静态、动态和电方面，进行了有限的元件分析(FEA)计算机模拟。这些结果提供了对每个装置设计的动态范围和灵敏度的进一步洞察，并且还阐释了可能的合并(参见例如，图21、22和23)。例如，确定了重力不会使力探针偏移平面超过50nm(图21)，并且结构共振不会以希望的操作频率激发(图22)。除了这些模拟，制定了所有六个设计的制造工序(参见图25和26中的工序选项)。

实施例2

性能评价

MEMS有限的元件分析

已经使用预测MEMS性质的有限的元件分析(FEA)模型模拟了各个MEMS组件功能。FEA计算非常适合MEMS静态和动态性质的第一原理计算，给出了对未来成功操作的信任。通过FEA，振荡器和传感器的一个实施方案的弹簧常数分别是0.993N m^-1和0.205N m^-1，而通过第一原理分析的值是1N m^-1和0.2N m^-1。动态FEA证明第一共振方式对于振荡器是2641Hz(参见例如，图27)。第一原理分析预测了1887Hz(DV1)，其显著不同于FEA分析，然而，两个共振频率都明显高于预期的500Hz的操作频率，因此认为共振不是问题。设计版本2是具有5970Hz(通过第一原理分析)第一共振方式的设计，其甚至进一步远离操作频率。

静电力FEA模拟非常适合振荡器驱动梳阵列的静电力的第一原理计算(图28，设计变化1)。静电力、跨梳元件的电势和振荡器偏离之间的关系由非线性函数描述。特别重要的是确定静电力中非线性克服弹簧线性力特征的偏离；超过该偏离点，振荡器“拉入”并不释放，直至去除电势(Sun等人(2002)Sensors and Actuators A,102：49-60)。考虑模型中的强一致，可能预测并因此预防“拉入”。

MEMS振荡器频率响应

通过施加方程1.1中针对频率f＝2πω和恒定运载频率f_c＝2πω_c＝500kHz的范围给出的电压信号而致动MEMS振荡器侧。基本频率是f＝2πω＝[1,1.41,2,...,4096]。为了最好地模仿微流体环境，首先在甲醇(甲醇具有小于水的一半的表面张力)中润湿MEMS装置，然后用去离子水冲洗，使得装置完全浸没于完全的去离子水。图31说明了当系统以128Hz的基本频率驱动时振荡器的一个循环，如通过安装 于倒置显微镜孔的高速照相机(Phantom MiroEX1,Vision Research,Wayne,NJ)捕获的。

使用定制的图像相关程序从频率实验的高速图像提取振荡器位置的时间痕迹。该程序提供了像素作为时间函数的振荡器位置。根据该时间信号，应用基本信号处理工具—即快速傅里叶转换—以将移动分解成响应的频率分量(图30B)。每个测试的基本频率的频率分量的幅度绘制为基本频率的函数(图30A)。通过A²标准化幅度，因为驱动静电力与A²成比例。振荡器频率响应是过度阻尼的二级系统的典型。数据良好对应于质量-弹簧-阻尼器系统的第一原理模型，具有以下参数：质量＝4.75x10^-9kg；阻尼系数＝0.8x10^-3N sec m^-1；并且弹簧常数＝0.8N m^-1。根据系统理论原理，振荡器无相位延迟地“完美”响应于低于100Hz的输入信号，然后响应幅度降低，并且对于高于100Hz的驱动频率相位延迟。通过增加驱动正弦强度至2A＝5.625V，我们能够实现最多512Hz的基本频率的完全位移振荡。

细胞介质通道中的细胞集中

理想地，进入MaPS的探针接口位置的细胞流将在通道宽度内集中，并且沿着通道长度均匀间隔。但是注意，细胞介质通道刚好在探针接口一贯地递送细胞至探针位置之前收缩；尽管不清楚是否必须进行“后端”集中。已经实验测试了许多不同的“后端”细胞集中通道。如图8B所描述的，多个旁路通道设计有效迫使细胞朝向通道宽度的中心。进入旁路阵列的细胞沿通道宽度具有相当均一的其位置分布(图31A)。在3000μm从入口穿至出口的过程中，分布尖锐，并且细胞沿着宽度有效集中(图31A)。集中性能随流速增加，并且预期在测试的最高流速–9μL/小时附近操作。通过在具有高速照相机(Phantom MiroEX1,Vision Research,Wayne,NJ)的倒置显微镜上操作的流动测试来获取数据，所述照相机记录了旁路阵列入口和出口处沿通道宽度的细胞位置。另一个考虑是穿过细胞的速度。对于给定的振荡器频率，振荡器接触细胞的次数和细胞速度之间存在反相关。我们已经使用相 同的倒置显微镜/照相机设置测量了穿过细胞的速度。在500Hz振荡器频率和9μL/小时的介质流速下，我们预测所有细胞将被振荡器探测至少一次，并且平均细胞浆被振荡器探测1.5–2次(图31B)。

设计版本2的MEMS组件设计

图8说明了具有在大规模上与电系统对接的大接触点的完整MEMS装置。图32示例说明了参数设计B1-B5(设计版本2的)。每个设计的性质在表2中给出。

表2.设计版本2的示例性设计参数(参见图Error！Reference source not found.)。

选择生物和材料表征的MAPS的频率响应的模拟

候选测试材料和预测的传感器频率响应显示于图33。频率响应模拟的模型参数显示于表3。

表3.频率响应模拟的模型参数

实施例3

大位移、高频率原位水下MEMS振荡器

I.介绍。

过去二十年带来了用于表征和概括天然微环境的微系统的科学研究财富。尽管范围大，但是我们集中于在小规模主动施加力的机制的讨论。这些方法揭示了重要的生物现象；例如，探测细胞内细胞器的机械支持(mechanical constituency)，观察对机械刺激的物理和化学响应，并揭示癌细胞的恶性转化的生物机械签名。而且，已经利用主动机制定向细胞和裂解的细胞内成分，用于通过主动改变整体平行的微流体网络内的流动模式通过生化手段表征。

一个趋势是朝向水环境中更快、平行的表征和操纵。然而，通常，相互作用的表面(例如，探针头、注射器头、激光焦点)具有小规模，但是支持性基础结构具有中至大规模。一个重要实例是原子力显微术(AFM)，其具有能够能够精巧定位细胞拓扑结构的纳米级探针，但是由中规模的压力致动器驱动，并且因此不能有效地通过平行的致动器网络而多路传输，因为致动器具有大的足迹。AFM具有我们称为非原位致动器的一类致动器，其包括但不限于用于表面声波生成的压力喇叭、用于颗粒定位的光学镊子系统、和定位微量移液器和探针的微操作器等。

原位致动器包括具有在接触点或附近产生的移动表面或力的一类致动器。这些致动器通常由大的中规模来源(例如电或压力来源)提供动力。然而，装置内通道可以将能量递送至接触点的原位致动器，因此可以将多个平行的致动器集成入致动器网络。振动型式阀示例了原位致动，在单个微流体装置内集成了数百个阀。其他实例包括静电和热致动器。

该实施例考察了水环境中静电原位致动。之前研究者鉴别了致动水下静电致动器而不电解水或遭受电荷屏蔽作用的电信号传导方案，然而，该设计集中于静态偏离。我们想象微流体装置内整体平行的构造中集成的高速静电致动器。因此，该考察研究合成了致密足迹内大位移(>5μm)、高频率(>1kHz)致动的最佳致动器构造；我们目前的知识还未证明这些特征。

此类致动器的完全效用依然处于其初期。该实施例提出了对水下振荡器致动的研究。与空气或真空中的致动相比，粘性阻尼在水环境中是大的，并且低粘度条件下致动器设计的标准物理工具不用于水下致动器。相应地，提出了用于分析和预测性能的新的数学方法。静电水下低频率高位移致动和高频率低位移致动各自容易获得。为了实现高位移和高频率，新角度梳驱动被杠杆作用并优化。优化考虑了超过6000种不同的设计选项来预测性能。开发的数学方法提供了设计重 复的简单工具。我们证明了实际设计，实现了以1kHz频率超过9μm的最大位移。

II.设计。

当不同电势的两个表面彼此靠近时产生静电力。设计的微系统探索了静电力以通过控制应用的电压信号而产生小规模的可调移动。静电力F(X(t)，V(t))是电极隙x(t)和施加电压V(t)的函数。水下，两个有害的作用排除效用：由于电压差的水电解和从水分子极化的电荷屏蔽，因此屏蔽静电力。

电解以大致大于约8V的电压发生，由此限制应用的电压。可以使用比水分子再适应更快翻转电极极性的信号传导方案有效消除电荷屏蔽。幅度调节的信号传导方案(图34)，其中基本信号在致动器带宽之内，但是具有充分高于致动器带宽和水分子的运载信号，允许基本信号在水环境中应用。对于简单的致动器设计，静电力函数的位置和电压依赖性分量是可分的：

F(x(t)，t)＝f(x)V²(t)

$\begin{array}{c}F\left(x\right(t),t)=f\left(x\right)(\frac{1}{2}\bar{V}{(1+\cos \omega t\Pi t)}^2\\ =f\left(x\right){\bar{V}}^2(\frac{3}{8}+\frac{1}{2}\cos \omega t+\frac{1}{8}\cos 2\omega t+H.F.T.)\end{array}---\left(1\right)$

其中电压分量是平方的和脉冲函数脉冲函数产生了ω_c整数倍时余弦函数的无限之和，此时ω_c被选择为是机械系统带宽大三个数量级的幅度的频率。因此，这些项变成对振荡器性能不重要的高频率项(H.F.T.)的无限之和。总而言之，水下致动将最大瞬时电压限于大约8V，并强迫使用幅度调节信号传导方案。

A)基本的动态和静态方式

1)线性动态模型

具有单自由度的粘性介质中弹簧质量被简单模拟为线性质量-弹簧-阻尼器系统(图35)，具有以下运动方程：

$m\stackrel{··}{x}\left(t\right)+b\stackrel{·}{x}\left(t\right)+kx\left(t\right)=F(x,t)---\left(2\right)$

m是假定为点-质量的振荡器质量，b是粘性阻尼参数，k是弹簧常数，x(t)是广义坐标，并且F(x，t)是以广义坐标x的方向应用于点质量体的外力。如果我们假定F(x，t)是时间上纯的谐函数，F(x，t)＝1/2A(1+cosωt)，则方程(2)的稳态溶液也是谐调的：

$x\left(t\right)=\frac{1}{2}A(1/k+\frac{1/k}{\sqrt{{(1-\frac{{\omega }^2}{{\omega }_n^2})}^2+{\left(2\zeta \frac{\omega }{{\omega }_n}\right)}^2}}\cos (\omega t+\phi (\omega /{\omega }_n)\left)\right)---\left(3\right)$

其中和分别是二级弱阻尼振荡器的天然频率和阻尼系数，并且是频率依赖性相位移。空气或真空中的微共振器通常特征为其ω_n和Q因子。然而，对于大位移，水下振荡器，有益的是报告带宽ω_BW以表征可实现的频率范围。带宽被定义为当用DC信号驱动时输出信号具有输出信号能量一半的频率。带宽可以表示为无维参数ω_BW/ω_n，其是无维ζ的函数：

$\frac{{\omega }_{\mathrm{BW}}}{{\omega }_n}=\sqrt{1-2{\zeta }^2+\sqrt{4{\zeta }^4-4{\zeta }^2+2}}---\left(4\right)$

其中振荡器对于ζ＞1(或)是过阻尼的。标准化带宽与阻尼系数具有大致渐近线关系(图36B)，对于ζ＞0.5，带宽减半，阻尼系数加倍。振荡器阻尼产生于梳指之间的挤压模阻尼[1]和滑动振荡器与静态墙之间的拖拉损失[2][3]。作为一般规则，阻尼对于振荡器带宽是有害的，并且振荡器表面积应该最小化。然而，大位移振荡器需要在梳指和探针基础和大悬浮弹簧处足够的结构支持；因此，在具有大于4μm的位移的水下振荡器中没有证明弱阻尼响应[4].[5]。

虽然质量和阻尼系数值具有如结构强度要求指示的较低阈值，但是弹簧常数通过弹簧几何设计而可容易调节，在报告的振荡器中跨3 个数量级的幅度[6],[7]。带宽与过阻尼设计的弹簧常数成大致线性比例(图36B)；组成关系：

${\omega }_{BW}~\frac{b-\sqrt{b^2-4mk}}{2m};$对于$b>2\sqrt{mk}---\left(5\right)$

在大约k＝0的泰勒级数展开中具有主要的线性项。合起来，增加k增加ω_BW；然而，实现相同位移花费更大的必要力。

2)非线性静态模型

通过梳驱动阵列产生力F(x，t)。两个梳驱动是文献中常见的，横向和纵向，其中图35中，横向驱动对应于θ＝90°，并且纵向驱动对应于θ＝0°。对于相似尺寸的梳阵列，横向驱动实现了比纵向驱动更高的力，但是在公知的“拉入”不稳定性发生之前具有限于1/3梳隙(图35中的x₁)的位移[8],[9]。理论上，纵向驱动不是位移限制的，但是实现比较低的力。杂合设计实现了比纵向驱动更高的力和比横向驱动更高的位移θ∈(0°,90°)，图35)。这些特征产生了在致密足迹中产生大力和位移、因此更小表面积的驱动。驱动力是可变驱动位移x(t)和电压V(t)以及恒定几何和物理参数的函数。

(x(t)，V(t))＝F_||cosθ+F_⊥sinθ

$F\left(x\right(t),V(t\left)\right)=\left(\begin{array}{c}(\frac{1}{x_1-\sin \theta }+\frac{1}{x_2+x\sin \theta })\cos \theta \\ +\frac{1}{2}\frac{(L_0+x\cos \theta )(x_1+x_2)(x_2-x_1+2x\sin \theta )}{{(x_1-x\sin \theta )}^2{(x_2+x\sin \theta )}^2}\sin \theta \end{array}\right)\kappa \in hN{\bar{V}}^2---\left(6\right)$

其中F||是与梳面平行的力[6]，并且F⊥是与梳面垂直的力[8]。θ，L₀，x₁和x₂是几何参数(图35)，h是梳高度，N是梳对数目，κ是梳隙介质的介电常数(对于空气是1，对于去离子(DI)水是78)，并且∈＝8.854×10^-12s⁴A²m^-3kg^-1是自由空间的电容率；方程(6)在附录中推导。

通过在方程6中对x解非线性方程，计算作为应用电压的函数的静态振荡器位移。对于静态使得：

$F(x,\bar{V})=kx---\left(7\right)$

产生溶液，总是针对稳定的和一个不稳定的溶液(图37A)。由于增加至稳定和不稳定的溶液收敛至二重根x_max，其是振荡器设计的最大稳定位移。

方程(7)的溶液可以跨设计空间而在数字上解答，以最大化位移x_max。设计空间是图35中所有几何参数的范围，然而，我们限制搜索为影响位移的两个最重要的参数k和θ。水下振荡器是力限制的，因为如果电场也是强的，带电梳之间的水会电解[6]；电压限于8V。该设计空间提出约束的优化问题：

对于k∈(0，30)

发现θ，使得x最大化

满足

θ_max＝θ

x_max＝x

结束

对于每一个弹簧常数k的最佳梳角度θ_max沿着单调增加线而存在(图37B)。随着k增加，静电力必须较大以对抗弹簧力，并且因此最佳θ_max增加以产生较大的力，具有受电解边界约束的在低k下，有利的是具有更纵向的设计，因为这在拉入不稳定性发生之前产生较大位移。

B)非线性动态模型

1)差异方程设置

章节II-A的线性动态和非线性静态分析对于水下振荡器具有相冲突的设计推荐。较高的弹簧常数产生较高的带宽，但是导致较小的位移。由约束加剧权衡，其限制来自小θ设计的可发生的力。

通过分析完全非线性常规差异方程(1)和(5)而实现了额外的设计观察，F(x,t)＝F(X,V(t))并且电压是谐调的静电力与V²(t)成比例；$F(x,t)\propto \bar{V}(\frac{3}{8}+\frac{1}{2}\cos \omega t+\frac{1}{8}\cos 2\omega t).$驱动电压的DC项给予位置的DC补偿其可以通过数字方法解答。作为坐标的变化，x重写为补偿位置的偏差并且方程(1)扩展为泰勒级数至三级，以评价。

$m\widehat{\stackrel{··}{x}}+b\widehat{\stackrel{·}{x}}+k(\hat{x}-\hat{x})=F(\hat{x},V)+\frac{\partial F(\hat{x},V)}{\partial x}\hat{x}+\frac{1}{2}\frac{{\partial }^{2}F(\hat{x},V)}{\partial x^2}{\hat{x}}^2+\frac{1}{6}\frac{{\partial }^{3}F(\hat{x},V)}{\partial x^3}{\hat{x}}^3---\left(8\right)$

方程(7)通过驱动频率标准化时间来简化，τ＝ωt，并从系数项拉出这产生了非线性的参数变化的非齐次的常微分方程：

$\begin{array}{c}\widehat{\stackrel{··}{x}}+Q^{-1}\widehat{\stackrel{·}{x}}+(a_{10}+a_{11}\cos \tau +a_{12}\cos 2\tau )\hat{x}+(a_{20}+a_{21}\cos \tau +a_{22}\cos 2\tau ){\hat{x}}^2\\ +(a_{30}+a_{31}\cos \tau +a_{32}\cos 2\tau ){\hat{x}}^3=a_{01}\cos \tau +a_{02}\cos 2\tau \end{array}---\left(9\right)$

其中对的系数被除尽，并且种属系数α_(.)是恒定参数。除了对于α₁₀，对和项的所有系数小于0。因此，静电力用作衰减弹簧。随着移动梳接近固定弹簧，使振荡器返回中性位置的力衰减。

标准解答假定Q^-1<<1并且大部分α_(.)<<1并且通过扰动法解答(9)[10]。在空气或真空中操作的振荡器通常具有Q～O(10⁴-10⁵)，并且标准解答是有效的[11,12]。然而，在水下操作情况下，粘性阻尼强度大约6个数量级更大，而且，所有系数具有不可忽略的强度(参见，图38)。方程(9)是极硬的，因为参数和状态根据不同时间规模发展，因此暗示和明示的解答者太慢(～5小时解答时间)，以至于不能以最佳算法例如(II-A-2)有效权衡。

2)傅里叶级数解答

微分方程(9)是Duffing方程[10]的特定形式，其是由谐调函数参 数驱动和外部驱动的。基本的Duffing方程没有已知的分析解答[11],[12]，并且因此对(9)的解答需要计算机解答。在稳定的位移限内，对(9)的解答也是谐调的，并且可以通过假设谐调解答并解答未知参数[13]-[15]来解答。

x(t)＝A₀+A₁cosτ+B₁sinτ+A₂cos2τ+B₂sin2τ+...+A_NcosNτ+B_NsinNτ

(10)

假定解答等效陈述为矢量代数，x(τ)＝T(τ)X，其中：

T(τ)＝[1，cosτ，sinτ，cos2τ，sin2τ...，cosNτ，sinNτ]

X＝[A₀，A₁，B₁，A_２，B₂，...，A_N，B_N]^T   (11) 

是未知系数的矢量，并且是正交谐调基础矢量。正交基础被权衡以重写(9)为矩阵代数：

T(τ)Δ²X+Q^-1T(τ)ΔX+T(τ)(a₁₀+a₁₁C₁+a₁₂C₂)X+T(τ)(a₂₀+a₂₁C₁+a₂₂C₂)T(X)X+T(τ)(a₃₀+a₃₁C₁+a₃₂C₂)Γ²(X)X-T(τ)G=0

                                    (12) 

其中Δ是进行运算d/dτ的恒定矩阵，C₁和C₂是T(τ)X分别乘以cox τ和cos 2τ的恒定矩阵，Γ(X)是进行运算x²(τ)≈T(τ)Γ(X)X的未知数的矩阵，且G＝[0,α₀₁,α₀₂,0,...]。矩阵结构在实施例1的附录中详细描述。方程(12)被简化为非线性矩阵方程：

L(X)-F(X)-G＝0   (13)

解答矢量X通过Newton-Raphson方法解答：

$X_{n+1}=X_n-{(L+\frac{\partial F}{\partial X}(X_n\left)\right)}^{-1}({\mathrm{LX}}_n+F(X_n)-G)---\left(14\right)$

其中n是算法的重复指数。

给定稳定的操作电压，(14)在小于10个重复之内收敛至解答矢量X，在标准多核心计算机上需要约30秒的计算时间。不稳定的操作 电压不会收敛至解答或收敛至振荡器物理范围之外不可实行的解答。

在稳定操作范围内，水下振荡器用作二级过阻尼振荡器(图39A)。对于一组和振荡器设计，k＝10μNμm^-1并且θ＝20°，响应强度保持恒定，直至大约500Hz，之后强度随递增的频率而降低(图39A-39B)。相应地，相位移随递增的频率而增加；重要的是，高频率下的相位移能够使具有高硬度弹簧的振荡器在高频率下具有比低频率下更高的x_max。参数驱动项((8)左手侧的cosτ和cos2τ项)位移出具有非齐次驱动项的相，并且可以向梳驱动施加较高电压而不引入拉入不稳定性(图39C)。

3)动态优化。

与暗示和明示解答者不同，傅里叶级数解答能够实现设计变量k和θ的有效优化，以最大化位移和可实现的频率范围。更高级算法(15)解答微分方程(8)500-2000次以优化参数空间。在不到一天之内确定优化的参数。

对于k∈(0，15)和ω∈(2^-1，2¹²)a

发现θ使得x最大化

满足$\bar{V}\in \left[\mathrm{0,8}\right]---\left(15\right)$

θ_max＝θ

x_max＝x

结束

图37B中证明的静态优化用通过算法(15)实现的其他动态优化阐明(图40A和40B)。在低频率，最大位移x_max和最佳驱动角度θ与静态非线性案例大致相同。在较高频率，行为偏离静态案例；较高的弹簧硬度和较大的θ允许高位移、高频率致动。

弹簧常数k和驱动角度θ由设计设置，而电压强度是可调的。 给定位移和致动频率目标，图40A和40B提供了k和θ选择的图。对于一般高频率水下操纵应用，我们利用了在大于1kHz的频率下x_max>8μm的设计目标。而且，振荡器上的探针头会与流体跨流中的穿过颗粒相互作用，并因此对于颗粒-头相互作用以及流动随机性必须是加强的。相应地，我们选择具有对这些扰动不敏感的硬弹簧(k＝10μNμm^-1)和针对高于1kHz致动优化的驱动角度(θ＝20°)振荡器设计。

讨论。

该基于硅的静电致动器精确地实现了比聚合物致动器更高频率的致动，因为硅具有比聚二甲基硅氧烷(PDMS)大超过三个数量级强度的杨氏模量与密度比，聚二甲基硅氧烷(PDMS)是聚合物、压力驱动值的标准材料。由于振荡器的天然频率是其中k是弹簧常数并且m是振荡器质量，我们因此实现了比聚合物致动器大1.5数量级的幅度的致动器频率。我们想象在以下中的巨大效用：高频率阀以及颗粒和细胞操纵的致动器，高通量的细胞机械性质测量，水下原位发声器，和水下光学的高转换频率光学调节器。

实施例3的附录

A)矩阵形式：

1)矩阵构造：

$C2=2C_2^2-I---\left(18\right)$

2)Γ(X)的偏离：

给定未知谐调强度分量X＝[A₀,A₁,B₁,....,A_N；B_N],Γ(X)的矢量，使得x²(τ)≈T(τ)Γ(X)X是：

F是具有在X项中非线性的条目的矢量。

$F_0=X_0^2+\frac{1}{2}\underset{i=1}{\overset{2N}{\Sigma }}{X}_i^2$

$F_j=\underset{k=0}{\overset{N}{\Sigma }}{A}_k{A}_{k+j}+\underset{k=0}{\overset{N}{\Sigma }}{B}_k{B}_{k+j}+\frac{1}{2}\underset{k=1}{\overset{j-1}{\Sigma }}{A}_k{A}_{j-k}-\frac{1}{2}\underset{k=1}{\overset{j-1}{\Sigma }}{B}_k{B}_{j-k}$对于j偶数

$F_j=\underset{k=0}{\overset{N}{\Sigma }}{A}_k{B}_{k+j}-\underset{k=0}{\overset{N}{\Sigma }}{A}_{k+j}{B}_k+\frac{1}{2}\underset{k=1}{\overset{j-1}{\Sigma }}{A}_k{B}_{j-k}+\frac{1}{2}\underset{k=1}{\overset{j-1}{\Sigma }}{B}_{j-k}{B}_k$对于j奇数   (20)

(20)中的每个X_j项必须以基础X存在。超过该基础的项被截断：X_j＝0，对于_j>2N。因此，x²(τ)≈T(τ)Γ(X)X仅是大致解答。

B MEMS制造

通过基于[16]详细描述的程序的多步骤石印过程制造玻璃载硅微振荡器。对于目前设计，根据微流体装置研究的标准，我们需要具 有倒置显微镜的图像装置运动。然而，不需要透明基底的设计的制造工序可以通过利用标准的绝缘体片载硅而更有效进行。以下章节提供了一个示例说明的MEMS制造程序(图41)。

程序：

1)具有<1-0-0>取向的低阻抗(0.005–0.020Ω-cm)p型硅晶片(Ultrasil,Hayward,CA)被阳极结合(Karl-Suss SB6结合剂)至Pyrex7740玻璃晶片(Plan Optik,Elsoff,Germany)。

2)将Si侧变薄至例如50μm，研磨并抛光至工业标准光洁度(RMS～1nm；由Aptek Industries,San Jose,CA进行)。

3)通过电子束蒸发将Cr/Au膜沉积在硅表面上(CHA溶液；8.5nm Cr,392nm Au)。

4)通过用光致抗蚀剂(例如，SPR700-1.2)旋转涂布，暴露于UV，并展开以开放待蚀刻的特征，来模式化蚀刻掩膜。注意，该装置取向使得振荡器和传感器平行于<1-0-0>平面移动。

5)以定时的酸蚀刻选择性蚀刻Cr/Au膜(TFA Gold Etchant(Transene,Danvers,MA)，随后CR-7S(Cyantek,Fremont,CA))。

6)通过PECVD(Plasma-therm 790,St.Petersburg,FL)沉积750nm SiO₂膜。

7)通过光刻法和干燥蚀刻来制造装置层蚀刻掩膜(Oxford 80+；Oxfordshire,United Kingdom)。

8)DRIE硅特征穿至玻璃(Plasma-Therm SLR 770ICP,St.Petersburg,FL)。

9)通过晶片切割来分离个体裸片。

10)通过玻璃层的定时HF湿润蚀刻从玻璃层释放可移动的MEMS元件(1：1HF：H₂O，以100rpm搅拌的溶液)。该步骤还去除了剩余的SiO₂蚀刻掩膜。

11)通过关键点干燥来干燥MEMS装置(Tousimis 915B：Rockville，MD)。

实施例3的参考文献。

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要理解，本文描述的实施例和实施方案仅为了示例说明目的，并且鉴于其的各种调整或变化是本领域技术人员理解的，并且包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的据此通过引用整体并入。