在移植患者中治疗移植物抗宿主病

摘要

本发明涉及治疗针对血液恶性肿瘤经受利用外周血动员的干细胞的造血干细胞移植(HSCT)的患者以及重度急性移植物抗宿主病(GVHD)的风险相当大的患者的方法。

说明书

本发明涉及治疗针对血液恶性肿瘤经受利用外周血动员的干细胞的造血干细胞移植(HSCT)的患者以及重度急性移植物抗宿主病(GVHD)的风险相当大的患者的方法。

背景

急性移植物抗宿主病(GVHD)可以在同种异体造血干细胞移植后发生并且通常为供体免疫细胞对抗宿主组织的反应。活化的供体T细胞通常在以预治疗方案开始的炎性级联后损伤宿主上皮细胞。在统计学上，约35％–50％的造血干细胞移植(HSCT)受者/患者可发展为急性GVHD。确切风险通常取决于干细胞源、患者年龄、处理(conditioning)以及所用的GVHD预防/治疗。

患者通常可涉及三种器官例如皮肤(皮疹/皮炎)、肝(肝炎/黄疸)和胃肠道(腹痛/腹泻)。

急性GVHD通常通过涉及器官的数量和程度来分期和分级(0-IV级)。患有III/IV级急性GVHD的患者往往具有较差结果(危及生命的)。通常，患者可通过优化免疫抑制和例如通过添加甲泼尼龙来治疗。约50％的患者可具有对甲泼尼龙的实体响应。如果患者在3天后发展或在7天后未得以改善，则他们将得到补救(二线)免疫抑制性治疗，不幸的是对于其不存在标准护理治疗。

因此，对具有其它用于预防和/或治疗GVHD的药学上有效的药物有高度未满足的医学需求。

在实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防经受HSCT的患者的GVHD的方法，该方法包括：

1.给患者施用有效量的式(I)化合物或其可药用盐；

2.处理所述患者从而基本上破坏骨髓和免疫系统，其中所述的处理包括用有效量的化学治疗剂例如环磷酰胺治疗所述患者和/或通过用高剂量化学放射疗法治疗所述患者；以及

3.将造血干细胞从供体移植至所述患者。

在如上所述的方法中，式(I)化合物或其可药用盐是

其中

R₂是H、卤素、三卤代甲基、C_1-4烷氧基、C_1-7烷基、苯乙基或苄基氧基；

R₃是H、卤素、CF₃、OH、C_1-7烷基、C_1-4烷氧基、苄基氧基、苯基或C_1-4烷氧基甲基；

R₄和R₅各自独立地是H或式(a)残基

其中R₈和R₉各自独立地是H或任选被卤素取代的C_1-4烷基；

并且n是1至4的整数；并且

R₆是氢、卤素、C_1-7烷基、C_1-4烷氧基或三氟甲基。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防经受HSCT的患者的GVHD的方法，其中在式(I)化合物或其可药用盐中，R₃是氯，并且其中剩余变量如上文所定义。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防经受HSCT的患者的GVHD的方法，其中在式(I)化合物或其可药用盐中，R₂是H，R₃是氯，并且R₆是氢，并且其中剩余变量如上文所定义。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防经受HSCT的患者的GVHD的方法，其中在式(I)化合物或其可药用盐中，R₂是H，R₃是氯，R₆是氢，R₄和R₅各自独立地是H或式(a)残基

并且其中R₈和R₉各自是H，并且其中剩余变量如上文所定义。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防经受HSCT的患者的GVHD的方法，其中(I)化合物或其可药用盐是式(II)化合物

或其可药用盐，或

或下列式(IIa)、(IIb)的其磷酸酯衍生物：

或其可药用盐。

在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防经受HSCT的患者的GVHD的方法，其中式(I)化合物或其可药用盐是2-氨基-2-[4-(3-苄基氧基苯基硫代)-2-氯苯基]乙基-丙-1,3-二醇。

在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)化合物或其可药用盐，其用于治疗和/或预防首先如上所述进行处理，然后接受来自供体的造血干细胞移植(HSCT)的患者的GVHD。

如本文所用，2-氨基-2-[4-(3-苄基氧基苯基硫代)-2-氯苯基]乙基-丙-1,3-二醇和/或其盐酸盐也可称为KRP203。

如本文所用，术语“卤素”或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。

如本文所用，术语“烷基”是指完全饱和的支链或非支链烃部分，其具有1至7个碳原子或1至4个碳原子。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基等。取代的烷基是含有一个或多个、例如一个、两个或三个选自卤素、羟基或烷氧基的取代基的烷基。

如本文所用，术语“烷氧基”是指烷基-O-，其中烷基是上文所定义的。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊基氧基、己基氧基、环丙基氧基-、环己基氧基-等。通常，烷氧基具有1-7或1-4个碳原子。

取代的烷氧基是含有一个或多个、例如一个、两个或三个选自卤素、羟基或烷氧基的取代基的烷氧基。

术语“可药用盐”是指保持本发明化合物的生物有效性和性质，并且通常不是生物学或其他方面不需要的盐。在很多情况下，本发明化合物由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团而能够形成酸和/或碱盐。

可药用酸加成盐可以与无机酸和有机酸形成，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。

可由其衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。

可由其衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可药用碱加成盐可由无机碱和有机碱形成。

可由其衍生盐的无机碱包括例如铵盐和来自周期表的I族至XII族的金属。在某些实施方案中，所述盐由钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜衍生；特别适合的盐包括铵、钾、钠、钙和镁盐。

可由其衍生盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星青霉素、胆碱盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。

本发明的可药用盐可由碱性或酸性部分通过常规化学方法合成。一般而言，此类盐可通过使游离酸形式的这些化合物与化学计算量的适当碱(例如Na、Ca、Mg或K氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或通过使游离碱形式的这些化合物与化学计算量的适当酸反应来制备。此类反应通常在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中进行。一般而言，在可行的情况下期望使用非水性介质例如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等。另外的适合的盐的举例可记载于例如“Remington’s PharmaceuticalSciences”，第20版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1985)；和Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)中。

如本文所用，术语“处理”或“处理的”在需要HSCT的患者处理的情形下通常意指通过例如以下的适合方法来基本上破坏骨髓和免疫系统：

降低强度处理(RIC)或骨髓摘除处理，例如Mini-Seattle处理，例如通常为30mg/m2/天的氟达拉滨或另外的化学治疗剂三天，接着通常为1×200cGy/天的全身辐射(TBI)；

或者

骨髓摘除处理，

例如高剂量化学疗法和全身辐射(TBI)通常根据适于机构实践的国家指导方针来进行，并且包括氟达拉滨、白消安、甲氨蝶呤、环孢菌素A和环磷酰胺的施用。下列给药方案作为实例给出：

1)氟达拉滨25mg/m2/天，静脉内×3天(约2-3天)，总剂量为75mg/m2。

2)白消安0.8mg/kg/6小时(约2至4天)

3)环磷酰胺60mg/kg/天，静脉内×2天(约2天)，总剂量为120mg/kg。为了减少CYC-诱导的出血性膀胱炎的风险，患者还将接受高体积流体冲洗和美司钠。

4)TBI将在约第8至10天(相对于HSCT为第-8天和第-1天)出现。推荐的TBI剂量为200cGy，每天给予两次，总剂量为1200cGy。

发明概述：

实施方案1描述了治疗和/或预防经受造血干细胞移植(HSCT)的患者的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括：

(i)给患者施用有效量的式(I)化合物或其可药用盐；

(ii)处理所述患者从而基本上破坏所有骨髓和免疫系统；以及

(iii)向所述患者移植来自供体的造血干细胞；

其中所述式(I)化合物或其可药用盐是

其中

R₂是H、卤素、三卤代甲基、C_1-4烷氧基、C_1-7烷基、苯乙基或苄基氧基；

R₃是H、卤素、CF₃、OH、C_1-7烷基、C_1-4烷氧基、苄基氧基、苯基或C_1-4烷氧基甲基；

R₄和R₅各自独立地是H或式(a)残基

其中R₈和R₉各自独立地是H或任选被卤素取代的C_1-4烷基；

并且n是1至4的整数；并且

R₆是氢、卤素、C_1-7烷基、C_1-4烷氧基或三氟甲基。

实施方案2描述了根据实施方案1的方法，其中式(I)化合物是式(II)化合物

或其可药用盐；

或下列式(IIa)、(IIb)的其磷酸酯衍生物：

或其可药用盐。

实施方案3描述了根据实施方案1的方法，其中式(I)化合物是式(II)化合物

或其可药用盐。

实施方案4描述了如实施方案1中所定义的式(I)化合物或其可药用盐，其用于治疗和/或预防首先如实施方案1中所述进行处理，然后接受来自供体的造血干细胞移植(HSCT)的患者的GVHD。

实施方案5描述了根据实施方案4所用的化合物，其中所述化合物是如实施方案2中所定义的式(II)、(IIa)和/或(IIb)的化合物或其可药用盐。

实施方案6描述了根据任何前述实施方案例如实施方案1-3或4-5的方法或化合物，其中所述处理选自例如降低强度处理(RIC)或骨髓摘除处理：

RIC：

例如Mini-Seattle处理的特征在于使用通常为30mg/m2/天的氟达拉滨或其它化学治疗剂3天，接着进行通常为1×200cGy/天的全身辐射(TBI)；

或

骨髓摘除处理：

通常，高剂量化学疗法和全身辐射(TBI)通常根据适于机构实践的国家指导方针来进行，并且包括氟达拉滨、白消安、甲氨蝶呤、环孢菌素A和环磷酰胺的施用。

实施方案7描述了根据任何前述实施方案例如实施方案1-3或4-5的方法或化合物，其中所述处理是包含一种或多种选自氟达拉滨、白消安、甲氨蝶呤、环孢菌素A和环磷酰胺的活性剂的高剂量化学疗法。

实施方案8描述了根据任何前述实施方案例如实施方案1-3或4-5的方法或化合物，其中所述处理为根据国家指导方针的全身辐射(TBI)。

实施方案9描述了根据任何前述实施方案例如实施方案1-3或4-5的方法或化合物，其中在处理后，例如在处理后即刻，或在处理后0-1天，或在处理后1-8天，或在处理后1-10天进行造血干细胞移植(HSCT)。

实施方案10描述了根据任何前述实施方案例如实施方案1-3或4-5的方法或化合物，其中在处理前5天，特别是在处理前3天并且特别是在处理前1天开始用实施方案1中所定义的式(I)化合物治疗患者。

临床研究-HSCT方法的描述：

群体(合格性)

研究群体(n＝约10)将包含已通过筛选评估，符合纳入/排除标准，并且已提供书面同意书的下列群体。男性或女性患者必须为18至65岁(含)，以使他们诊断为有其中可获得人白细胞抗原(HLA)匹配的干细胞源的标准同种异体HSCT的资格。研究者必须确保被认为用于研究的所有个体满足下列合格性标准。没有额外的标准应该被研究者应用，以便研究群体将代表所有合格的个体。个体的选择将通过在筛选和基线时的所有纳入/排除标准来检查。合格性标准的相关记录(例如检查表)必须与源文件一起存储在研究站点。

来自任何准入标准的偏差排除招募的个体进入研究。

纳入标准

有资格纳入本研究的个体必须符合所有下列标准：

必须在进行任何评估之前获得书面知情同意书。

1.患者年龄为18至65岁(含)；

2.患者必须具有血液恶性肿瘤，其按照标准的医疗实践需要骨髓摘除处理(包括短期骨髓摘除减少强度处理)，接着同种异体造血干细胞移植。此类恶性肿瘤包括但不限于急性髓样白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、边缘区和滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、成淋巴细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和其它高级别淋巴瘤；套细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤；幼淋巴细胞性白血病或多发性骨髓瘤。

3.受者必须具有定义为Karnofsky评分≥60％的良好一般健康。

4.适合的干细胞源必须根据由适于机构标准的JACIE*所定义的移植物选择算法使用去除T细胞的外周干细胞作为移植物来源而可得的。(*JACIE：欧洲联合认证委员会(The Joint Accreditation CommitteeEurope)包含国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy)和欧洲血液与骨髓移植组织(European Group for Blood and MarrowTransplantation))。

5.供体必须为与使用分子HLA匹配技术的受者9/10或10/10匹配的。

6.女性和男性患者必须符合此类研究的标准前提条件，例如涉及生育、怀孕、性行为等。

7.患者必须能够与研究者进行良好的沟通，理解和遵守研究的要求，以及理解和签署书面知情同意书。

排除标准

符合任何下列标准的个体没有资格纳入本研究：

1.在研究的时间段或后续排除期内怀孕、计划怀孕和/或哺乳的女性或计划当父亲的男性。

2.在筛选前四周或更长时间(如果由地方性法规要求，以及基于地方性法规对参与的任何其它限制)内参与利用研究药物的任何介入性临床研究。

3.多种标准心血管病症：

4.多种标准肺病症：

5.诊断有黄斑水肿或有黄斑水肿史

6.如由研究者评估的未控制的糖尿病或并发有器官损害的糖尿病例如糖尿病性肾病或视网膜病变。

7.未控制的癫痫障碍

8.未控制的抑郁或自杀企图/意念史

9.被研究者认为是活跃的且临床显著性的未治疗的或未控制的全身性细菌、病毒或真菌感染(包括在30天内被曲霉菌属或其它霉菌感染)

10.诊断有分别被阳性HIV抗体、乙型肝炎表面抗原或丙型肝炎抗体试验定义为AIDS、乙型肝炎或丙型肝炎感染。

11.单纯性疱疹病毒(HSV)和/或水痘-带状疱疹病毒(VZV)免疫球蛋白(Ig)G抗体阳性患者，其出于任何理由不能接受病毒预防治疗(对于经受骨髓摘除和HSCT的患者的标准实践)

12.在筛选时对水痘-带状疱疹病毒IgG抗体为阴性

13.严重肝病或肝损伤或已知的酒精滥用史、慢性肝或胆疾病

14.任何下列异常试验值：

a.血清肌酸酐大于2.0mg/dL(176μmol/L)

b.AST或ALT或ALP大于5倍正常上限

15.在5年内活跃的非血液性恶性肿瘤，但成功治疗的基底细胞癌除外。

16.由主要治疗医生评估的不稳定的或当参与研究时可能以任何方式危害患者的任何医学病症。

17.与本发明化合物不相容的任何药物

18.在3个月内在先使用阿仑珠单抗(Campath)或抗胸腺细胞球蛋白(ATG)。

19.在起始用本发明化合物的治疗之前2个月内已接受任何活疫苗或减毒活疫苗(包括对于水痘-带状疱疹病毒或麻疹的)

20.在先骨髓摘除的同种异体移植

21.脐带血或单倍体相同的移植的受者

22.实体器官移植的受者

23.对研究药物或对具有与式(I)化合物类似的化学结构的药物的超敏性的历史。没有额外的排除可由研究者应用，以便确保研究群体将代表所有符合条件的患者。

治疗方法

1.用于治疗GVHD的药物

提供了药物，式(I)化合物，特别是式(II)化合物，特别是包含1、2、3或5mg的2-氨基-2-[4-(3-苄基氧基苯基硫代)-2-氯苯基]乙基-丙-1,3-二醇或其可药用盐的胶囊。

治疗通常包括：

A：筛选期(第-50至-2天)，基线(第-1天)，

B：第1天至第111天的药物治疗期和至多365天的随访期(自移植)，其中药物是式(I)化合物或其可药用盐。

C：骨髓摘除处理将按照护理标准使用化学疗法(例如氟达拉滨、白消安、环磷酰胺、甲氨蝶呤)和全身辐射(TBI)在第2天和第10天之间进行，参见下文)。

D：移植(输注干细胞)即HSCT将在第11天进行。标准活动(除研究性治疗之外)还可以根据机构实践包括标准GVHD预防、移植前后的支持性护理和随访评估。

2.治疗组(Arms)

患者将被分配到下列治疗：

单一组：每天一次3mg的2-氨基-2-[4-(3-苄基氧基苯基硫代)-2-氯苯基]乙基-丙-1,3-二醇，达111天

3.治疗分配

将向符合条件的个体以递升顺序的次序分配个体编号(详见下文)。

4.治疗盲法

这是开放标签式研究并且所有个体将接受相同治疗。

5.个体筛选编号

经过筛选的每个个体被分配唯一的筛选编号。

6.分配研究治疗

必须保持个体特异性分配过程的适当文件化。分配个体的研究药物并且其由研究主办者供应。药品标签遵守进行研究的国家的法律要求并且将以当地语言印刷。药品标签上包括研究药物的储存条件。

7.开处方和采取研究治疗的说明

在住院期间研究药物将由研究中心人员用约180-240mL水施用。必须认真监督并且控制研究药物的分配。开处方并且分配至个体的所有剂量和在研究期间的所有剂量变化必须在剂量施用记录CRF(CRF＝用于临床读出评估的公司)上记录。

8.允许的剂量调整和研究治疗中断

可以允许研究药物剂量调整并且基于研究者的判断允许药物中断。可基于研究者判断和整体临床评估而导致研究药物中断的条件/事件包括：

·报道的严重不良事件

·涉及或不涉及使用排除的联合用药的紧急医疗条件

·临床显著性试验值或异常试验或检查结果

·患者的非依从性

为了避免研究药物中止和再启动对患者安全性的负面影响，研究者和主办者之间的讨论将在个案基础上发生。这是为了通过考虑中止的时间和持续时间的理由来决定是否继续治疗。这也为了当再启动研究药物时，例如如果中断足够长以保证心脏监测的话确定是否需要额外的安全性措施。在值得注意的不良事件、安全问题的情况下和/或基于在研究期间的药动学数据，可以考虑低于计划剂量即3mg/天的剂量的施用。对于不能耐受协议指定的给药方案的患者，允许剂量调整和中断以使患者继续用于研究药物。这些变化必须记录在剂量施用记录CRF上。

联合治疗

在研究开始之前和研究期间在进入标准中定义的时间框内施用或服用的所有处方药物、OTC药物和显著性非药物疗法(包括物理治疗和血液输注)必须记录在CRF的联合用药/显著性非药物疗法部分上。药物条目应特定于商品名、单一剂量和单元、施用的频率和途径、起始和中止日期以及治疗的理由。目前，对于利用处理、GVHD预防、HSCT和整体围移植(peritransplant)护理没有统一协议，任何或所有这些可在不同位点显著变化并且也可在同一位点在患者之间变化。因此，将根据机构实践使用此类联合治疗。

下列联合治疗在需要时通常是可得的：

有效的CYP3A4抑制剂例如选自阿扎那韦(Atazanavir)、茚地那韦(Indinavir)、奈非那韦(Nelfinavir)、利托那韦(Ritonavir)、沙奎那韦(Saquinavir)、胺碘酮(Amiodarone)、西咪替丁(Cimetidine)、克拉霉素(Clarithromycin)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、地尔硫卓(Diltiazem)、红霉素(Erythromycin)、氟伏沙明(Fluvoxamine)等。按照护理标准可向患者施用这种有效的CYP3A4抑制剂。为了减轻与治疗药物的可能药物间相互作用的风险，将在持续基础上分析PK样品。

对患者的处理

减少强度的处理：

例如，利用氟达拉滨的Mini-Seattle处理将以30mg/m2/天使用三天，接着全身辐射(TBI)(1×200cGy/天)

骨髓摘除处理

高剂量化学疗法和全身辐射(TBI)根据适于机构实践的国家指导方针来进行，并且可以包括氟达拉滨、白消安、甲氨蝶呤、环孢菌素A和环磷酰胺的使用。下列给药方案作为实例给出：

1)氟达拉滨25mg/m2/天，静脉内×3天(约2-3天)，总剂量为75mg/m2。

2)白消安0.8mg/kg/6小时(约2至4天)

3)环磷酰胺60mg/kg/天，静脉内×2天(约2天)，总剂量为120mg/kg。为了减少CYC-诱导的出血性膀胱炎的风险，患者还将接受高体积流体冲洗和美司钠。

4)TBI将在约第8至10天(相对于HSCT为第-8天和第-1天)出现。推荐的TBI剂量为200cGy，每天给予两次，总剂量为1200cGy。

预防GVHD

通常，式(I)化合物将作为向患者给予的正常治疗药物的附加治疗给予以预防GVHD。用于预防GVHD的护理标准具有很多副作用并且在高百分比的患者中不预防GVHD。

因此，患者可按照机构实践使用例如环孢菌素A(CsA)、麦考酚酯或甲氨蝶呤来接受预防。例如，患者在第8天(相对于HSCT的第-3天)每12小时开始服用CsA，以2.5mg/kg静脉内的起始剂量历时2小时。可在毒性和具有150-400mg/L的目标谷水平的CsA水平的基础上进行剂量调整。一旦患者可耐受口服药物，就通常将CsA换成经口服(p.o.)形式。起始口服给药可以为每天给予两次的目前静脉内(i.v.)剂量。CsA给药通常至少每周一次监测并且在临床上酌情可改变。

可根据机构的内部标准适应甲氨蝶呤时间表和给药(例如第11天为10mg/kg，第13天和第16天为6mg/kg)。通常可根据机构实践给予麦考酚酯(例如在mini-Seattle处理后2×100mg/天)。可基于临床副作用进行剂量调整。

造血干细胞移植(HSCT)

外周动员的干细胞将根据机构实践来使用。适合的干细胞源必须根据由适于机构标准的JACIE*所定义的移植物选择算法使用去除T细胞的外周干细胞作为移植物来源而可得的。(*JACIE：欧洲联合认证委员会包含国际细胞治疗协会和欧洲血液与骨髓移植组织)。此外，供体必须为与使用分子HLA匹配技术的受者9/10或10/10匹配的。

小鼠的致死性移植物抗宿主病(GvHD)

我们根据Transplantation 11(4)(1971)：378-382中所述的先前报道进行小鼠的致死性GvHD。

雌性BALB/cAnNCrj小鼠和雌性Crj:BDF1小鼠购自CHARLESRIVER JAPAN并且在10周龄时分别用作供体和受者。

从供体BALB/c小鼠收集脾。将脾置于RPMI-1640培养基(GIBCO)中并且用两片载玻片轻轻按压以制得单细胞悬浮液。将单细胞悬浮液通过细胞过滤器(70um，FALCON)。将滤液离心以收集细胞沉淀。将沉淀重新悬浮于RPMI-1640培养基中。通过使用Turk氏溶液染色来计算悬浮液中有核细胞的数量。用RPMI-1640培养基适当地稀释所述悬浮液，最后制得2×10⁸个细胞/mL的悬浮液。该悬浮液用作脾细胞悬浮液。

第0天，受者BDF1小鼠用环磷酰胺(SHIONOGI&CO.,LTD.)以300mg/kg的剂量腹膜内治疗。在环磷酰胺治疗后一天，将BDF1小鼠用0.25mL(5×10⁷个细胞/小鼠)的来自BALB/c小鼠的脾细胞悬浮液静脉内注射以诱导致死性GvHD。

用化合物(对照/CsA/KRP203)治疗

从第1天(刚注射脾细胞后)至第20天每天一次口服施用化合物。观察小鼠直到第70天。

结果示于表1中。环孢菌素A抑制小鼠的致死性GVHD。然而，在戒断环孢菌素A(在第20天停止治疗)后观察到致死性GVHD的发作。KRP-203以0.03mg/kg口服施用完全预防小鼠的致死性GVHD。KRP-203显示在中止治疗后维持功效(相比于环孢菌素A)。

表1：KRP-203和环孢菌素A(CsA)对小鼠的致死性GvHD的影响(治疗至多第20天)