肽在视网膜神经退行性疾病，特别是在糖尿病视网膜病变早期和神经退行性变起重要作用的其它视网膜疾病的局部治疗中的应用

摘要

本发明涉及用于视网膜神经退行性疾病，特别是糖尿病视网膜病变的局部治疗和/或预防的肽，所述肽的序列长度为13-50个氨基酸，所述肽的N-端主要包含序列HXaa1EGTFTSDXaa2SXaa3Xaa4(SEQ？ID？NO：1)，其中：Xaa1是选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；Xaa2是选自缬氨酸和亮氨酸的氨基酸；Xaa3是选自丝氨酸和赖氨酸的氨基酸；Xaa4是选自酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；且组氨酸是N-末端残基。本发明也包括用于这些疾病的局部治疗和/或预防的局部用药物组合物。

说明书

本发明涉及可能导致部分或全部失明的眼部疾病的医治方法领域。 本发明提供可局部用于眼部的有用工具，包括肽和这些肽的类似物。

发明背景

视网膜神经退行性疾病指以渐进的神经元丢失为特征的视网膜病 况。糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性、青光眼和色素性视网膜炎被 认为是神经退行性变在其中起重要作用的视网膜疾病。

可以从Schmidt et al.,“Neurodegenerative Diseases of the Retina and  Potential for the Protection and Recovery”,Current Neuropharmacology– 2008,Vol.No.6,pp.:164-178摘选对这些疾病、它们的关键部位的深入分 析以及保护的可能方法和恢复的方法。

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的并发症，并且在发达国 家仍是工作年龄个体失明的主要原因。现有的DR的治疗如激光光凝术、 皮质类固醇或抗-VEGF药剂的玻璃体内注射的病征在该疾病的太晚期阶 段才显示，并与显著的副作用有关。

糖尿病视网膜病变(DR)通常被认为是视网膜微循环疾病。然而， 有些数据显示视网膜神经退行性变是DR发病机理中的早期事件，其参 与在DR中发生的微循环异常，这可以从代表“糖尿病视网膜病变早期 治疗的欧洲联盟”(EUROCONDOR)的Simó et al.“Neurodegeneration is an  early event in diabetic retinopathy:therapeutic implications”,Br.J.Ophthalmol.–2012,vol.96,pp.1285-1290中推理得出。

在DR中，神经退行性变(有效神经元的丢失)发生在疾病的早期 阶段，并引起功能异常如辨色力和对比灵敏度的丧失。这些改变可通过 对糖尿病患者的电生理学研究来检测，即使其患糖尿病的时间少于两年， 即在可通过眼科检查检测到微血管损伤之前。此外，延迟的多焦ERG(视 网膜电图)隐式时间(mfERG-IT)预测了早期微血管异常的发生。而且， 神经视网膜退变启动和/或激活了一些代谢和信号转导通路，这些通路将 参与微血管病过程以及血视网膜屏障的破坏(DR发病机理的关键部分)。

目前，并未对与发病机理有关的视网膜神经退行性疾病或神经退行 性变的早期阶段进行治疗，尽管其能够防止早期病变，如导致视网膜新 血管化的微循环问题。因此在早期阶段，特别是DR，没有进行治疗，而 是进行患者的标准随访。

另一方面，当把这些视网膜神经退行性疾病(特别是DR)的早期阶段 作为治疗目标时，建议积极的治疗(例如激光光凝术或玻璃体内注射) 将是不可想象的。迄今为止，不认为滴眼液的使用是施用药物以预防或 阻止DR的好途径。这是因为如Urtti A et al.,“Challenges and obstacles of  ocular pharmacokinetics and drug delivery”.Adv.Drug.Deliv.Rev.2006,vol. 58,pp.1131-1135中声明的：通常认为它们不能到达眼后段(即玻璃体和 视网膜)。尽管存在少量证据证明，在角膜中施用的组合物能够到达视网 膜，但是它们代表的是孤立事件，并且对应于低分子量的组合物，如Aiello  et al.,“Targeting Intraocular Neovascularization and Edema–One Drop at a  Time”,N.Eng.J Med–2008,vol.359,pp.967-969中提到的那些。Aiello et  al.显示，在两个不同的测试中，一种由吡咯烷衍生来的化合物(名为 TG100572，4-氯-3-(5-甲基-3-{[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯基]氨基}-1,2,4- 苯并三嗪-7-基)苯酚)，一旦以滴眼液的形式施用就能够到达视网膜靶点， 该化合物具有作为涉及新血管产生和视网膜水肿的激酶的抑制剂而发挥 作用的能力。尽管如此，这一小分子化合物不能与其它天然存在的化合 物进行比较，如具有高分子量的肽或蛋白。

糖尿病是具有高血糖症特征的一组慢性疾病。为了预防糖尿病并发 症，使用血糖降低剂降低高血糖是必不可少的。因此，任何葡萄糖降低 药物对预防或阻止糖尿病并发症(包括DR)都可能在理论上是有益的。 然而，缺少关于抗糖尿病剂不依赖于其对血糖水平的降低作用而对DR 有直接效果的信息。通过举例说明的方式，使用被称为艾塞那肽(Byeta, Amylin Pharmaceuticals)和利拉鲁肽(Victoza,Novo Nordisk)的胰高血 糖素样肽-1激动剂，通过促进血糖水平的降低来治疗2-型糖尿病。此外， 已知这些激动剂引起代谢综合症相关疾病如肥胖和高血压的改善。专利 申请文件WO2007062434也公开了一种鼻内施用的药物组合物，其中递 送同样的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)来治疗代谢综合症和糖尿病并发症， 包括DR。

根据以上所述，由于疾病的主要原因或起因，特别是血液中高水平 的葡萄糖，在最终的实例中得到了改善，因而已知施用此种胰高血糖素 样肽-1激动剂也可改善或减轻DR症状。尽管如此，这些治疗并未消除 系统性副作用。此外，如果这些物质必须以治疗有效浓度到达视网膜就 需要高剂量，因而增强了副作用。

在Zhang et al.,“Intravitreal injection of exendin-4 analogue protects  retinal cells in early diabetic rats”,Invest Ophthalmol Vis Sci.-2011,vol.52(1), pp.278-85中公开的一项研究显示，在体内模型中由GLP-1R激活介导了 神经保护。作者报道，在患有链脲霉素(STZ)引起的糖尿病的大鼠中， 玻璃体内施用毒蜥外泌肽-4(艾塞那肽)预防了与神经退行性变有关的视 网膜电图(ERG)异常和形态学特征。然而，不能轻易地将Zhang et al. 研究中的结果推测到人DR(或具有视网膜神经退行性变的其它疾病)。 首先，由于在STZ-DM模型中，对结果的解释可能受STZ神经毒性作用 的影响。第二，尽管在大鼠视网膜中发现了GLP-1R的表达，但是这在 人视网膜中还未有在先报道。最后，如上文提到的，对在眼底检查中仅 有极少(如果有)微血管异常的患者实施玻璃体内注射是不合适且有侵袭 性的。

目前，对于视网膜神经退行性疾病没有特定的治疗方法。具体以DR 为例，这意味着对于背景性视网膜病变或非增殖性DR，没有特定的治疗 方法，也没有保护神经视网膜免受损伤(导致神经元丢失)的具体方法。 因此，当神经退行性变看上去要开始时，需要新的药物治疗方法用于该 疾病早期阶段。在减缓向需要积极治疗(如外科手术)晚期阶段的发展 中，DR的早期治疗将是有效的。

发明概述

发明人发现了一些肽(所有这些肽均在N-端区域具有相同的特定序 列)以及包含所述肽的组合物，尽管它们分子量很高，但当在眼部局部 施用时(即在角膜或结膜穹窿)它们能够到达视网膜，并且也能保护和 预防视网膜退变。这些化合物作为视网膜(特别是神经视网膜，它是视 网膜的一部分，包括神经元但不包括视网膜的色素上皮)的局部神经保 护剂起作用。

应当强调局部施用根据本发明的应用的肽，不仅到达了视网膜，也 达到了阻止糖尿病视网膜病变发展的有效浓度。

因此，在第一方面，本发明涉及序列长度为13-50个氨基酸的肽，其 应用于视网膜神经退行性疾病的局部治疗和/或预防，所述肽的N-端区域 主要包含下述序列：

HXaa¹EGTFTSDXaa²SXaa³Xaa⁴(SEQ ID NO:1)，其中：

Xaa¹是选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；

Xaa²是选自缬氨酸和亮氨酸的氨基酸；

Xaa³是选自丝氨酸和赖氨酸的氨基酸；

Xaa⁴是选自酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；和

组氨酸是N末端残基；

局部治疗和/或预防是局部眼部治疗和/或预防，由于当局部施用于眼 部时所述肽能够到达视网膜这一事实，因而是在眼部表面(即在角膜或 结膜穹窿)。这适用于本发明公开的任何实施方案和实施方案的组合。

发明人惊奇地发现胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1Rc)存在于人视 网膜中，并且与所有在先假设相反，它们能够证明分子量为3.35kDa-4.18 kDa的天然存在的肽物质，当局部施用于眼部(即，在角膜)时，能够 到达视网膜。因而，发明人建议局部施用(局部眼部施用)包含30-40 个氨基酸且包含SEQ ID NO：1的肽，该序列被认为负责GLP-1Rc的激 活，并且也存在于哺乳动物GLP-1中。

鉴于现有技术，分子量大于1kDa的分子一旦被局部施用于角膜表 面将能够到达视网膜，这是出乎意料的。

GLP-1(胰高血糖素样肽-1)是在应答食物时由胃肠道L细胞分泌的 内源性促胰岛素肽(“肠促胰岛素反应”)。GLP-1通过与它的受体 (GLP-1Rc)彻底反应，对葡萄糖依赖性胰岛素分泌、胰岛素基因表达、 胰岛β细胞再生、胃肠蠕动、能量平衡和食物摄取有强大的影响。GLP-1 受体(GLP-1Rc)是肽激素结合类B1(分泌素样受体)家族的成员，该 家族具有七个跨膜异源三聚体G蛋白偶联受体(GPCRs)。GLP-1Rs分布 广泛，它们被发现存在于胰腺、脂肪组织、肌肉、心脏、胃肠道和肝脏 中。此外，GLP-1Rs被发现遍及中枢神经系统(即，下丘脑、纹状体、 脑干、黑质和室管膜下层)，并且也有一些证据证明，在中枢和周围神经 系统中受GLP-1刺激的GLP-1R发挥神经保护作用。

人GLP是具有37个氨基酸残基的肽，其来源于在回肠末端L细胞、 胰腺和脑中合成的前胰高血糖素原。人前胰高血糖素原鉴别于UniProt 数据库，登录号P01275，2007年2月6日；第3版。对前胰高血糖素原 进行处理以产生GLP-1(7-36)氨基化合物、GLP-1(7-37)和GLP-2主 要发生在L细胞。使用一个简单的系统来描述肽的片段和类似物。因此， 例如，Gly⁸-GLP-1(7-37)代表GLP-1的一个片段(类似物)，其通过缺失 Nos.1-6位的氨基酸残基以及用Gly取代第8位的天然存在的氨基酸残基 (Ala)而形式上衍生自GLP-1。类似地，Lys³⁴(N^ε–十四烷酰基)-GLP-1 (7-37)代表GLP-1(7-37)，其中在34位的Lys残基的ε-氨基被十四烷 酰化。

因此，与所有偏见相反，发明人通过将其局部施用或作为局部组合 物(即局部眼用组合物)的组分，提供可以到达视网膜并在此发挥神经 保护作用的肽，解决了眼科领域的长期需要。此外，这些组合物的局部 施用将它们的作用局限于眼部，并将相关的系统性副作用降低至最小。

由于该肽的神经保护作用，本发明的这一方面也可表述为肽在制备 视网膜神经退行性疾病的治疗和/或预防(指局部眼部治疗和/或预防)， 特别是对于视网膜神经退行性疾病早期阶段视网膜的治疗和/或预防，特 别是DR早期阶段的治疗和/或预防的药物中的应用，其中所述肽序列长 度为13-50个氨基酸，并且在其N端区域包括如上所述的主要包含 HXaa¹EGTFTSDXaa²SXaa³Xaa⁴(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。本发明也 涉及视网膜神经退行性疾病的治疗和/或预防的方法，特别是视网膜神经 退行性疾病早期阶段的神经保护，特别是DR早期阶段的治疗和/或预防 的方法，所述方法包括向需要的对象(包括人)施用(指在眼部局部施 用)治疗有效量的肽和药物可接受的赋形剂和/或载体，所述肽序列长度 为13-50个氨基酸，且其N端区域包括如上所述的主要包含 HXaa¹EGTFTSDXaa²SXaa³Xaa⁴(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。

附图说明

图1表示特定视网膜神经退行性疾病—糖尿病视网膜病变(DR)(早 期阶段和晚期阶段)以及根据现有技术用于每个阶段的治疗方法的示意 图。水平箭头代表时间(任意单位)，血液中葡萄糖水平随其的增加是可 检测的(糖尿病或高血糖水平)。“非DR”指正常眼部检查(没有微动脉 瘤、微量出血或渗出物)；“NPDR”指非增殖性糖尿病视网膜病变；“DMO” 指糖尿病黄斑水肿；“CapOc”指毛细血管闭塞，“PDR”指增殖性糖尿病 视网膜病变；“PHC”指光凝术；“IVTR”指玻璃体内注射；“VTR”指 玻璃体切除术。术语新生血管指新生成的血管。

图2显示人体组织样本中GLP-1受体的表达。图A是柱形图，其中 通过定量实时PCR分析GLP-1受体mRNA的相对量。在图B中，人神 经视网膜切片的光学显微镜图像(20×)清楚地暴露了在光感受器段(PR) 受体的存在(用粗箭头表示)。“ONL”指外核层；“INL”指内核层；“GCL” 指神经节细胞层，它们全部是神经视网膜的基本部分。

图3涉及糖尿病视网膜病变(DR)，是视网膜切片(载玻片(slide)) 的显微图像(Olympus显微镜)，其中将胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的 存在作为胶质细胞激活的指示因子进行评估。它显示用GLP-1(7-37)类 似物(是GLP-1R激动剂)(左图，测试，T)处理的糖尿病小鼠和用媒 介物处理的糖尿病小鼠(右图，对照，C)的代表性样本之间在视网膜中 的GFAP免疫反应性的比较(箭头)。将细胞核用DAPI标记。ONL：外 核层；INL：内核层；GCL：神经节细胞层。

图4也涉及糖尿病视网膜病变(DR)，是柱形图，显示了TUNEL检 测的结果。图A显示了用GLP-1(7-37)类似物(是GLP-1R激动剂)(测 试，T，n＝10)处理的糖尿病小鼠和用媒介物处理(对照，C，n＝10)的 糖尿病小鼠神经节细胞层(GCL)中TUNEL阳性细胞的百分比(％)。 图B显示了来用GLP-1R激动剂(T)处理的糖尿病小鼠和用媒介物(对 照，C)处理的糖尿病小鼠的全部神经视网膜中TUNEL阳性的免疫荧光。 A.U.：任意单位。结果为平均值±SD。*p<0.05。

图5也涉及糖尿病视网膜病变(DR)，是柱形图，显示来自用GLP-1R 激动剂(T)处理的糖尿病小鼠和用媒介物(对照，C)处理的糖尿病小 鼠的全部神经视网膜中谷氨酸免疫荧光(图A)和GLAST免疫荧光(图 B)的结果。A.U.：任意单位。结果为平均值±SD。*p<0.05。

发明详述

为了理解，包含下述定义。

在本发明中，术语“神经保护”指可使用的任何种类的治疗或预防 方法，所述方法使组成神经视网膜的神经元处在保护中并且相对于健康 对象动物(包括人)而言处于生理状态。“神经视网膜”是视网膜的一部 分，包括神经元且不包括视网膜色素上皮。神经视网膜负责视觉循环。

表述“在糖尿病视网膜病变早期阶段的神经保护”涉及在确定DR 晚期阶段(前增殖性或增殖性DR)之前实施的任何治疗或预防方法。

对于“糖尿病视网膜病变的早期阶段”，其应被理解为下述时间，在 该时间，由于糖尿病的存在，眼部可以检测到功能异常(即辨色力、对 比灵敏度和视网膜电图异常)，但还不能完全确定DR微血管的变化模式， 即不能观察到前增殖性或增殖性DR的典型损伤。

“人胰高血糖素样肽-1(7-36)酰胺(GLP-1(7-36)酰胺)”和“人 胰高血糖素样肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))”涉及衍生自人胰高血糖素原 的片段，其分别包括所述人胰高血糖素原氨基酸序列的氨基酸7-36或氨 基酸7-37。

作为“人GLP-1(7-37)类似物”，其应被理解为一种肽，其中GLP-1 (7-37)的一个或多个氨基酸残基被其它的氨基酸残基取代，和/或其中 GLP-1(7-37)的一个或多个氨基酸残基缺失，和/或其中一个或多个氨基 酸残基被加至GLP-1(7-37)。

本文使用的表述“治疗有效量”指当施用化合物时，足够阻止被处 理疾病的一种或多种症状的发展或将其减轻至一定程度的化合物的量。 根据本发明施用的化合物的具体剂量当然由围绕该事件的具体情况确 定，包括所施用的化合物、给药途径、所治疗的具体病况和类似的考虑。

本文使用的术语“药物可接受的”包括化合物、材料、组合物和/或 在合适的医学判断范围内的剂型，所述剂型适合与对象(如人)的组织 接触使用，且没有显著的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症， 其与合理的效果/风险比相当。从与药物组合物其它材料相容的意义来说， 每种载体、赋形剂等也必须是“可接受的”。它也必须适合与人体或动物 组织接触使用，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或与合 理的效果/风险比相当的其它问题或并发症。合适的载体、赋形剂等可以 从标准医学教材中找到，并且以举例说明的方式，其包括防腐剂、粘着 剂、湿润剂、润肤剂和抗氧化剂。

“N-端区域”或“N-端”(也被称为氨基端、NH2-端、N末端或胺端， 在此它们全部作为可互换的表述使用)指以含有自由胺基(-NH2)的氨 基酸终止的蛋白或多肽的起点。书写肽序列的习惯是将N-端置于左侧， 且从N-端至C-端书写序列。当蛋白由信使RNA翻译时，它从N-端至 C-端生成。

对于“N-端残基”，其应被理解为肽中的残基，其含有自由的或者至 少未被其它氨基酸残基酰化的氨基(例如，它可以被酰化或甲酰化)，这 被称为N-端残基(N-terminal)；它位于N-端(N-terminus)。含有自由的 或至少未将其它氨基酸残基酰化的羧基的残基(例如，它可以酰化氨以 生成–NH–CHR–CO–NH₂)被称为C-端残基。

如上所述，发明人第一次提出视网膜神经退行性疾病(神经退行性 变起重要作用的视网膜疾病)的治疗方法，其除了不具有侵袭性外，可 应用于这些疾病早期阶段的治疗，特别是DR早期阶段的治疗。

在一个具体实施方案中，根据本发明在局部治疗和/或预防中使用的 肽具有30-50个氨基酸的序列长度。

另一个实施方案是序列长度为30-40个氨基酸的肽，其应用于视网膜 神经退行性疾病的局部治疗和/或预防，所述肽的N-端区域主要包含下述 序列：

HXaa¹EGTFTSDXaa²SXaa³Xaa⁴(SEQ ID NO:1)，其中：

Xaa¹是选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；

Xaa²是选自缬氨酸和亮氨酸的氨基酸；

Xaa³是选自丝氨酸和赖氨酸的氨基酸；

Xaa⁴是选自酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；和

组氨酸是N末端残基。

但是在另一个具体实施方案中，肽序列的长度为13-40个氨基酸。

这意味着具有任意所述特定序列长度的任何肽，都可应用于制造视 网膜神经退行性疾病的治疗和/或预防(指局部眼部治疗和/或预防)的药 物，特别是视网膜神经退行性疾病早期阶段视网膜的治疗和/或预防，特 别是DR的早期阶段。因此，在具体实施方案中，本发明也涉及视网膜 神经退行性疾病(指局部眼部治疗和/或预防)治疗和/或预防的方法，特 别是视网膜神经退行性疾病早期阶段的神经保护，特别是DR的早期阶 段。所述方法包括施用(指在眼部局部施用)治疗有效量的肽，该肽具 有以上所述特定的任何序列长度。

特别地，根据本发明所述肽在局部治疗和/或预防中的应用(指在局 部眼部治疗/或预防中的应用)是视网膜神经退行性疾病的治疗和/或预 防，所述视网膜神经退行性疾病选自：DR、老年性黄斑变性、青光眼和 色素性视网膜炎。

在一个优选实施方案中，根据本发明所述肽在局部治疗和/或预防中 的应用是DR的治疗和/或预防。

进一步，在另一个优选实施方案中，根据本发明所述肽在局部治疗 和/或预防中的应用是DR早期阶段的治疗和/或预防。

具体地，在这些早期阶段，当DR还未确定时，局部施用的本发明 的肽，作为神经视网膜的保护剂发挥作用，从而发挥神经保护作用。这 意味着保护神经元免受损伤和功能丧失，并且将其维持在健康生理状态。 同样的论证适用于其它的视网膜神经退行性疾病。的确，所述肽可以因 为它的神经保护特性而被使用。

糖尿病视网膜病变发展的图示可以参见图1。简要地，由高血糖症触 发的代谢途径和高血糖症自身导致DR，但是在DR能够通过眼底检查被 诊断之前还需至少五年的时间。可以观察到的第一阶段为背景性视网膜 病变或非增殖性糖尿病视网膜病变(NPDR)(其由微动脉瘤、微出血和 硬渗出物组成)。在这一阶段，除了糖尿病对象的标准随访，没有进行特 定的治疗。从这一阶段开始，疾病的自然过程可以沿两个互不排斥的方 向发展。其中之一为临床显著的糖尿病黄斑水肿(DMO)的发展，其最 重要的致病因素是血视网膜屏障(BRB)的损坏。此种情况在2-型糖尿 病患者中发生更为频繁。另一个方向是朝增殖性糖尿病视网膜病变 (PDR)方向发展，这在1-型糖尿病中更频繁。在后一种情况下，毛细 血管闭塞在引起血管生成和抗血管生成因子之间的不平衡中起至关重要 的作用，这最终刺激新血管生成(PDR的标志)。然而，甚至在眼科检查 中能够检测到NPDR之前，视网膜神经退行性变就已经存在。如图1所 示，当DMO和PDR确诊时，实施积极治疗。所述治疗包括光凝术(PGC)、 玻璃体内注射皮质类固醇和/或抗血管内皮生长因子(IVTR)和玻璃体切 除术(VTR)。

根据本发明随着所述肽用于DR的局部治疗和/或预防，如果在疾病 的早期阶段，当能够检测到功能异常时(即，辨色力、对比灵敏度和视 网膜电图异常)，对象接受能够帮助视网膜神经保护的化合物，就可避免 一些这样的积极治疗方法。因此，如果保护视网膜免受慢性血糖水平的 影响，就可以将主要的并发症最小化，或随着糖尿病患者生活质量的真 正改善甚至不再出现。向眼部局部施用所述肽表现出了真正的优势，避 免了进一步的积极治疗。

在一个实施方案中，应用于视网膜神经退行性疾病(特别是DR)的 治疗和/预防的肽具有一定的序列长度，所述序列长度选自：31、32、33、 34、37、36、37、38和39个氨基酸。在另一实施方案中，所述序列长度 选自14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、37、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48和49个氨基酸。

在本发明的一个实施方案中，应用于视网膜神经退行性疾病的局部 (眼睛)治疗和/或预防的肽是那些在N-端包括主要包含SEQ ID NO：1 的氨基酸序列的肽，其中Xaa¹为丙氨酸，Xaa²为缬氨酸，Xaa³为丝氨酸， 且Xaa⁴为酪氨酸。即，它们包括氨基酸序列SEQ ID NO：5 (HAEGTFTSDVSSY)。特别地，这些肽应用于DR的局部治疗和/或预 防，其应用于DR的局部眼部的治疗和/或预防。

在另一个实施方案中，根据本发明使用的肽是哺乳动物胰高血糖素 样肽-1。该肽在其N-端(N-端区域)包含如SEQ ID NO：5所述的序列， 该序列在大部分的哺乳动物中都存在，例如人、猪和猴子。此外，这是 被GLP-1Rc主要识别的序列。

因此，在一个优选实施方案中，应用于视网膜神经退行性疾病(DR) 局部(眼睛)治疗和/预防的肽包含氨基酸序列为SEQ ID NO：2的人胰 高血糖素样肽-1和这一人类肽的变体，该序列对应于 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。所述变体涉及对象之间 的突变，同时这些突变不影响其与GLP-1Rc的相互作用，并且不剥夺所 述肽通过该受体发挥作用(特别是作为导致神经保护或降低血糖水平的 后续信号转导通路的激动剂或激活剂)。“突变”应被理解为一个或两个 氨基酸的缺失以及一个保守氨基酸的替代或插入。

在另一个实施方案中，根据本发明使用的肽具有氨基酸序列SEQ OD  NO：3(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG)，其中赖氨酸(K) 包含通过酰胺连接与赖氨酸侧链的氨基相连的亲脂性取代基N^ε–(γ-谷酰 基(N^α–十六烷酰基))。即，所述肽主要包含SEQ ID NO：3。

SEQ ID NO：3对应于被称为利拉鲁肽的活性成分(也被称为 Arg³⁴Lys²⁶(N^ε–(γ-谷酰基(N^α–十六烷酰基)))-GLP-1(7-37))，它被认为是那 些在至少一个氨基酸处包含亲脂性取代基的GLP-1(7-37)的类似物，所 述亲脂性取代基为直链或支链烷烃α,ω-二羧酸的酰基。这些GLP-1(7-37) 的类似物的优选酰基选自HOOC(CH₂)mCO-，其中m为4-38，优选为4-24， 更优选选自：HOOC(CH₂)₁₄CO-、HOOC(CH₂)₁₆CO-、HOOC(CH₂)₁₈CO-、 HOOC(CH₂)₂₀CO-和HOOC(CH₂)₂₂CO-。

因此，本发明也包括哺乳动物胰高血糖素样肽-1(7-37)或其类似物， 其应用于视网膜神经退行性疾病(特别是DR)的局部(眼睛)治疗，其 中所述胰高血糖素样肽-1(7-37)的类似物是包含至少一种下述修饰的肽：

a)胰高血糖素样肽-1(7-37)的至少一个氨基酸缺失；

b)胰高血糖素样肽-1(7-37)的至少一个氨基酸残基被其它氨基酸 残基取代；和

c)在胰高血糖素样肽-1(7-37)的C-端插入至少一个氨基酸残基， 同时在N-端区它们包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。除人胰高血糖素样 肽-1受体的肽激动剂外，当在受体前测试时，所述类似物能刺激cAMP 生成。

特别地，在疾病的早期阶段，可将哺乳动物胰高血糖素样肽-1(7-37) 或其类似物应用于视网膜神经退行性疾病(特别是DR)的治疗和/或预 防。在早期阶段，当在眼部局部施用所述肽时，其作为神经保护剂发挥 作用(在预防治疗中避免神经退行性变)。

也应用于视网膜神经退行性疾病(特别是DR)的治疗和/或预防的 GLP-1(7-37)类似物的实例包括利拉鲁肽的一部分，Lys²⁶(N^ε–(十四烷酰 基)-GLP-1(7-37)、Lys³⁴(N^ε–(十四烷酰基)-GLP-1(7-37)、Lys^26,34二(N^ε–(十 四烷酰基)-GLP-1(7-37)、Lys²⁶(N^ε–(十四烷酰基)Arg³⁴-GLP-1(7-37)、 Gly⁸Arg^26,34Lys³⁵(N^ε–(十四烷酰基)-GLP-1(7-37)、Arg^26,34Lys³⁶(N^ε–(十四烷 酰基)-GLP-1(7-37)、Lys^26,34二(N^ε–(ω-羧基十九烷酰基))-GLP-1(7-37)、 Arg³⁴Lys²⁶(N^ε–(ω-羧基十九烷酰基))-GLP-1(7-37)、Arg³⁴Lys²⁶(N^ε–(ω-羧基 十七烷酰基))-GLP-1(7-37)、Arg^26,34Lys³⁶(N^ε–(ω-羧基十七烷酰 基))-GLP-1(7-37)、Arg^26,34Lys³⁶(N^ε–(ω-羧基十一烷酰基))-GLP-1(7-37)、 Lys^26，34二(N^ε–(ω-羧基十一烷酰基))-GLP-1(7-37)、Arg³⁴Lys²⁶(N^ε–(ω-羧基十 一烷酰基))-GLP-1(7-37)、Arg³⁴Lys²⁶(N^ε–(ω-羧基庚酰基))-GLP-1(7-37)、 Arg^26,34Lys³⁶(N^ε–(ω-羧基庚酰基))-GLP-1(7-37)、Lys^26,34二(N^ε–(ω-羧基庚酰 基))-GLP-1(7-37)、Arg³⁴Lys²⁶(N^ε–(ω-羧基十五烷酰基))-GLP-1(7-37)、 Arg³⁴Lys²⁶(N^ε–(石胆酰基(lithocholyl))-GLP-1(7-37)、Lys^26,34二(N^ε–(ω-羧基 十三烷酰基))-GLP-1(7-37)、Lys^26,34(N^ε–(γ-谷酰基(N^α–十四烷酰 基)))-GLP-1(7-37)、Lys^26,34二(N^ε–(γ-谷酰基(N^α–十六烷酰 基)))-GLP-1(7-37)、Arg³⁴Lys²⁶(N^ε–(γ-谷酰基(N^α–十四烷酰 基)))-GLP-1(7-37)。

所有这些类似物被广泛公开在专利文件EP0944648(Novo Nordisk) 中，其中也包括它们合成的实例。它们中的大部分是通过在微生物中实 施重组技术以及通过化学合成获得的。

在另一个实施方案中，应用于视网膜神经退行性疾病的局部(眼睛) 治疗和/或预防的肽，是那些在N-端区域包括主要包含SEQ ID NO：1的 氨基酸序列的肽，其中Xaa¹为甘氨酸，Xaa²为亮氨酸，Xaa³为赖氨酸， 且Xaa⁴为谷氨酰胺。特别地，所述肽用于DR的局部治疗和/或预防。

在另一个实施方案中，应用于视网膜神经退行性疾病(特别是DR) 治疗和/或预防的肽主要包含氨基酸序列SEQ ID NO：4 (HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPXaa⁵)或该肽 的序列为氨基酸序列SEQ ID NO：4，其中Xaa⁵是其-COOH端被-NH₂基团取代的丝氨酸残基。该SEQ ID NO：4对应于被称为艾塞那肽(Amylin  Pharmaceuticals)的活性成分。所述化合物可按专利文件US5424286中公 开的，通过固体化学合成或在微生物中使用DNA重组技术获得。

在另一个实施方案中，应用于视网膜神经退行性疾病，特别是DR 治疗和/或预防的肽，主要包含氨基酸序列SEQ ID NO：8 (HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKXaa⁶)，或该肽的序列为氨基酸序列SEQ ID NO：8，其中Xaa⁶是其-COOH 端被-NH₂基团取代的赖氨酸残基。该SEQ ID NO：8对应于被称为利西 拉来(Amylin Pharmaceuticals)的活性成分。所述化合物可通过固体化学 合成(梅里菲尔德固相法，Merifield solid-phase methodology)获得。该 产品广泛公开于专利文件US6528486中。

本发明中所有的这些肽以及定义为GLP-1(7-37)类似物的任何肽都 是GLP-1Rc的激动剂，所述肽长度为13-50个氨基酸，特别地为30-50 或30-40个氨基酸，并且其在N-端(N-端区域)包括主要包含SEQ ID NO： 1的氨基酸序列。的确，据认为SEQ ID NO：1是与GLP-1Rc相互作用 的至少部分氨基酸序列。如下所证实的，它们全部可被局部用于视网膜 神经退行性疾病(特别是DR)的治疗和/或预防。

因此，在一个具体实施方案中，根据本发明使用的肽是GLP-1Rc的 激动剂。

具体肽的激动剂活性的确定可以通过分析(assay)来测试，所述分析为 在表达克隆的人GLP-1Rc的细胞系中刺激cAMP的生成。此种分析的一 个实例可从专利文件EP0944648(Novo Nordisk)得到。

简要地，通过剂量反应曲线计算具体肽的EC50，所述曲线使用表达 人胰腺GLP-1Rc的幼仓鼠肾(BHK)细胞来测定。在缓冲液(10mmol/L  Tris-HCI和30mmol/L NaCl pH 7.4，此外还含有1mmol/L二硫苏糖醇、5 mg/L亮抑肽酶(Sigma,St.Louis,MO,USA)、5mg/L胃酶抑素(Sigma,St. Louis,MO,USA)、100mg/L杆菌肽(Sigma,St.Louis,MO,USA)和16 mg/L抑肽酶(Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd,Denmark))中通过均化制备 细胞的质膜。然后在41w/v％蔗糖的顶层将匀浆离心。将两层之间的白 带在缓冲液中稀释并离心。该分析可在96孔微量滴定板中实施，总体积 为140μl。使用的缓冲液可以是加入1mmol/L EGTA、1.5mmol/L MgSO₄、 1.7mmol/L ATP、20mM GTP、2mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.01％ Tween-20和0.1％人血清白蛋白(Reinst,Behringwerke AG,Marburg, Germany)的50mmol/L Tris-HCI，pH 7.4。将要测试激动剂活性的化合物 溶解并稀释于缓冲液中，加入膜制备物，将混合物37℃孵育2h。通过加 入25μl 0.05mol/L HCl终止反应。在通过闪烁迫近分析法(RPA 538， Amersham，UK)分析cAMP之前，将样品稀释10倍。

如果在这些条件下，肽的EC50(pM)为至少GLP-1(7-37)之一， 即从至少55pM或优选从至少60pM，则将该肽作为激动剂。

保护通过一些眼科检查检测到的视网膜神经退行性变是在血管异常 发生之前治疗DR的好方法。在DR的早期阶段，存在神经退行性变(其 可以通过辨色力和对比灵敏度的丧失、胶质细胞激活和神经细胞凋亡来 检测)。在这些早期阶段，当没有指示进行治疗且只建议随访，直至确定 了DR的更晚期阶段(临床显著的糖尿病黄斑水肿和/或增殖性糖尿病视 网膜病变)，局部施用(在眼部局部施用)本发明的肽是有用的。

在DR早期阶段的治疗有真正的优势，其避免了进一步的并发症， 即微动脉瘤、微出血、硬渗出物、新血管生成、毛细血管闭塞和血视网 膜屏障(BRB)损坏。

在另一实施方案中，根据本发明使用的肽是局部用药物组合物的成 分(组分)，所述组合物包括至少一种如上公开的肽以及任何药物可接受 的载体和/或赋形剂。因此，本发明也涉及局部用药物组合物，其应用于 视网膜神经退行性疾病(特别是糖尿病视网膜病变)局部治疗和/或预防， 所述组合物包含至少一种如上所述的肽。具体的载体和/或赋形剂涉及水、 生理盐水缓冲液和油中水的混合物或水中油的混合物。具体的赋形剂选 自：防腐剂、粘着剂、湿润剂、润肤剂和抗氧化剂。

优选的局部用药物组合物选自：溶液(例如滴眼液)、面霜、洗液、 药膏、乳剂、气溶胶和非气溶胶喷雾、凝胶、油膏和悬浮液。如上所述， 所述局部用药物组合物应被理解为局部眼用组合物。

此外，本发明的组合物可包含其它的成分，如芳香剂、着色剂和在 局部制剂中使用的本领域现有技术已知的其它组分。

本发明的局部组合物可根据本领域现有技术已知的方法来制备。本 领域技术人员根据要制备的制剂的类型可以很容易地确定适合的赋形剂 和/或载体以及它们的量。

在一个优选实施方案中，本发明的局部组合物是滴眼液形式的溶液， 也称为滴眼液。以滴眼液形式施用该肽具有极大的优势：易于需要的对 象使用，且无不适感。

在整个描述和权利要求中，术语“包括/包含”及其变体并不意图排 除其它的技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，术语“包括”包含“由… 组成”的情况。通过查看本描述，本发明其它的目的、优势和特征对本 领域技术人员将是显而易见的，或者可以通过实践本发明学到。下述实 施例和附图以举例说明的方式提供，并且它们不意图限制本发明。此外， 本发明涵盖本文描述的具体实施方案和优选实施方案的所有可能的组 合。

实施例

实施例1.GLP-1Rc在人视网膜中表达

已知，在糖尿病供体死亡前一年的眼底检查中，其视网膜中已经存 在视网膜神经退行性变的主要特征(细胞凋亡和胶质细胞激活)，但没有 任何的微循环异常(Carrasco et al.,“Lower Somatostatin Expression Is an  Early Event in Diabetic Retinopathy and Is Associated With Retinal  Neurodegeneration”,Diabetes Care-2007,Vol.No.30,pp.:2902-2908)。因 此，正常的眼底检查不排除糖尿病患者眼部已经存在视网膜神经退行性 变的可能性。

在本研究中发明人希望检测，在人视网膜中GLP-1受体(GLP-1Rc) 是否表达。

从8个糖尿病供体和8个非糖尿病供体(年龄：66.9±5.4岁)中获得 了八个人死后的眼睛。从死亡到眼球摘除术经过的时间少于4h。在摘除 术之后，每一供体的一只眼睛在-80℃速冻且保存，直至用于mRNA检测。 另一只眼杯固定于4％的多聚甲醛，并包埋于石蜡中用于免疫组化研究。

所有眼部组织的使用都符合适用法律以及涉及人组织研究的赫尔辛 基宣言。此外此项研究经Vall d’Hebron医院伦理委员会批准 (Barcelona-Spain)。

在将从供体中分离的眼杯显微解剖后，收集神经视网膜和视网膜色 素上皮(REP)。使用研钵将每只眼睛的神经视网膜和RPE在液氮中研磨 成粉末。使用QIAshredder吸附柱(Quiagen，Hilden，Germany)将组织 均化，并且根据厂商的使用说明书，利用RNeasy微小试剂盒(Quiagen， Hilden，Germany)从组织中提取mRNA。通过RNA nano Lab Chip Kit 生物分析仪(Agilent，Palo Alto，CA，USA)测定mRNA的浓度和完整 性。按照厂商针对随机六聚体核苷酸引发的使用方法，使用反 转录试剂(Applied Biosystems，Roche，New Jersey，USA))将1μg总 mRNA反转录。按照厂商的使用方法利用ABI Prism 7000序列检测系统 (Perkin-Elmer Applied Biosystems；Madrid,Spain)实施定量实时PCR (Q-RT-PCR)。用TaqMan Assay评估GLP-1Rc的水平。

在免疫荧光分析中，将被石蜡包埋的眼睛连续切成7μm的厚度。将 切片用二甲苯脱蜡，并在乙醇中再水化。然后将切片固定并将其置于抗 原修复液(Dako A/S，Glostrup，Denmark)中95℃20min。然后在含有 0.3％Triton X-100的PBS中，将切片与1％BSA孵育1h以封闭抗体的 非特异性结合，然后与对人GLP-1Rc(Abcam，Cambridge，UK)具有特 异性的初级抗体4℃孵育过夜。洗涤切片，然后将其与Alexa488 (Molecular Probes，Eugene，OR)二级抗体在室温孵育1h。用一滴含 有DAPI的封固剂覆盖载玻片以使细胞核可见(Vector Laboratories， Burlingame，CA)。

定量实时PCR(Q-RT-PCR)分析的结果显示于图2A中，其中表现 了在一些人组织中对应于GLP-1受体的mRNA的相对量。特别地，分析 的组织是糖尿病供体的视网膜色素上皮(RPE DBT)样本、糖尿病供体 的神经视网膜(NR DBT)样本、非糖尿病供体的视网膜色素上皮(RPE) 样本、非糖尿病供体的神经视网膜(NR)样本。作为对比分析，分析了 GLP-1受体在其它组织，即在人胰腺(HP)、肠(BW)、肝脏(LV)和 内脏脂肪(F)细胞系中的表达。用人β-肌动蛋白作为Q-RT-PCR的内参。

图2A中的数据显示，可以在糖尿病供体和非糖尿病供体(RPE/DBT； NR/DBT；RPE，NR)的视网膜中检测到GLP-1Rc mRNA的表达。

免疫荧光分析的结果显示于图2B中，其中显示了一个石蜡切片的20 ×的光学显微镜图像。粗箭头指的是绿色染色，因而对应于GLP-1受体。 虚线箭头显示外核层(ONL)的核。图2B是为通过免疫组化再次证明， 在视网膜中也检测到了GLP-1受体。

实施例2.在糖尿病小鼠中局部施用GLP-1Rc激动剂预防了视网膜神经 退行性变

动物和处理

包括从Harlan Laboratories，Inc.获得的总共20只C57BL/KsJ-db/db 小鼠。将10只C57BL/KsJ非糖尿病小鼠作为对照组。所有实验的实施都 符合Vall d’Hebron Institut de Recerca(VHIR，Barcelona-Spain)动物管 理委员会批准的协议和CEE(86/609/CEE)以及ARVO(视觉和眼科学 研究协会)的原则。将小鼠置于下述受控条件下饲养：具有12小时光/ 暗周期，温度20℃和湿度60％，且可自由地得到水和食物。

C57BL/KsJ-db/db小鼠是研究DR患者中观察到的神经退行性特征的 很好的模型。C57BL/KsJ-db/db小鼠在瘦素受体基因上携带一个突变，也 是肥胖导致的2-型糖尿病的模型。由于过多的食物消耗，这些小鼠在-4-6 周的年龄开始有高血糖症发生。

在对GLP-1受体激动剂的效果进行分析之前，发明人对与糖尿病有 关的视网膜异常的时间顺序进行了评估。进行了视网膜电图和一些神经 退行性变的检测，包括视网膜形态测量、胶质细胞激活和细胞凋亡评估。 结论为在16-24周之间，与非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠中总视网膜厚 度显著降低。此外，在糖尿病小鼠中观察到了以胶质原纤维酸性蛋白增 生和上调(胶质细胞激活的指示)为特征的“反应性(reactive)”糖尿病 表型。也观察到在8、16和24周，与非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠的 凋亡神经节细胞的数量显著增加。因此，该小鼠模型对于测试涉及治疗 或预防DR的任何化合物都是很好的模型，甚至比用于研究DR的视网膜 神经退行性变的被称为链脲霉素诱导的糖尿病模型(STZ-DM)更好，在 该模型中，STZ的神经毒性效果能够危及结果。

GLP-1Rc激动剂利拉鲁肽是一种GLP-1(7-37)类似物，通过注射 器将其以滴眼液的形式(利拉鲁肽浓度：在0.9％氯化钠蒸馏水溶液中6 mg/mL)直接施用于8周龄小鼠每只眼睛的上方角膜表面。作为对照， 施用媒介物(含有0.9％的氯化钠水溶液)滴眼液。用利拉鲁肽处理10 只小鼠，用媒介物处理10只小鼠。每天(利拉鲁肽或媒介物)处理一次， 处理14天。在第15天，在尸体解剖前约一小时，向小鼠眼睛注入一滴 利拉鲁肽或媒介物。通过颈椎脱臼法使小鼠安乐死。立即摘除眼睛，并 分离神经视网膜。将一只眼睛的神经视网膜冻于液氮中，并在-80℃保存 以用于mRNA和蛋白评估。将另一只眼睛速冻于组织冰冻包埋剂；TFM^TM(Electron Microscopy Sciences)，通过浸入液氮，穿过背侧/腹侧平面切成8 mm的冰冻超薄切片。将切片置于载玻片上，并在-80℃保存。制备这些 切片以用于视网膜形态评估，GLP-1Rc的存在、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的存在和末端转移dUTP缺口端标记(Terminal Transfer dUTP  Nick-End Labeling,TUNEL)免疫反应性的评价。

通过利用实时PCR测定mRNA的表达，以及通过免疫组化和免疫印 迹分析，对小鼠神经视网膜中GLP-1Rc的存在进行评价。

GLP-1Rc mRNA的表达

通过实时PCR分析GLP-1Rc的表达。使用下述引物： GGGTCTCTGGCTACATAAGGACAAC(正向，SEQ ID NO：6)和 AAGGATGGCTGAAGCGATGAC(反向，SEQ ID NO：7)。

免疫组化分析

使用对GLP-1Rc具有特异性的抗体，通过荧光显微法对GLP-1Rc进 行评估。将切片在酸性甲醇(-20℃)中固定2min，然后用PBS洗三次， 每次5min。用0.1％的TBS-Triton X-100将切片通透，然后室温在封闭 剂(含有10％BSA和10％山羊血清的PBS)中孵育30min。接下来在 潮湿环境中将切片与GLP-1Rc(Abcam Ltd,Cambridge,U.K.)于4℃孵育 过夜。用PBS将切片洗三次，每次5min，然后与二级抗体Alexa 594山 羊抗兔(Invitrogen,UK)(1:200稀释于配好的封闭溶液)孵育。将切片 在PBS中洗三次，用Hoechst复染，用荧光封固剂(Prolong,Invitrogen) 固定，且用盖玻片封固。使用相同的亮度和对比度设置，用Olympus显 微镜记录图像。

免疫印迹分析：

将神经视网膜转移至含有来自Sigma的1×蛋白酶抑制剂 (Sigma-Aldrich，UK)的裂解液(Tris-HCl 100mM，pH 7.5；苯甲基磺 酰氟(PMSF)，0.1mM；Triton，1％；NaCl，150mM；NaF，20mM；Na₃PO₄， 2mM)中，然后用注射器将其均化。将匀浆冰上孵育30min，然后1000 rpm 4℃离心15分钟。利用BCA分析(Pierce，Thermo Scientific USA) 测定上清中的蛋白浓度。将样品与6×上样缓冲液(Tris-HCl，1M，pH， 6.8；十二烷基硫酸钠(SDS)，20％；10％甘油；巯基乙醇和0.01g溴酚 蓝)混合，煮沸10分钟。用10％SDS-PAGE溶解蛋白样品。电泳分离后， 将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad Laboratories，UK)。用含5％脱 脂奶粉、0.1％Tween的Tris缓冲生理盐水(TBS)将膜于室温封闭1小 时，然后在4℃与抗GLP-1R的初级抗体(1:1000稀释；Abcam Ltd， Cambridge，UK)孵育过夜。将膜用TBS-T(0.1％Tween)充分洗涤，然 后在室温与用辣根过氧化物酶标记的二级抗体孵育1小时(1:5000稀释， Dako，Denmark)。使用化学发光检测系统(Millipore，USA)使条带可 见。利用ImageJ对蛋白表达相对量进行定量。

神经退行性变测定：

为了确定神经退行性变，实施免疫组化分析以对胶质细胞激活和细 胞凋亡进行评估。此外，对谷氨酸代谢进行评估。

利用对GFAP(胶质原纤维酸性蛋白)具有特异性的抗体，通过荧光 显微法对胶质细胞激活进行评估。将切片在酸性甲醇(-20℃)中固定2 min，然后用PBS洗三次，每次5min。用0.025％的TBS-Triton X-100将 切片通透，然后于室温在封闭剂(含有1％BSA和10％山羊血清的PBS) 中孵育2小时。然后在潮湿环境中将切片与兔抗-GFAP抗体(Abcam Ltd, Cambridge,U.K.)(1:500稀释于配好的封闭液)于4℃孵育过夜。将切片 用PBS洗三次，每次5min，然后与二级抗体Alexa 488山羊抗-兔 (Invitrogen)(1:200稀释于配好的封闭溶液)孵育。将切片在PBS中洗 三次，用Hoechst复染，用荧光封固剂(Prolong,Invitrogen)封固，并且用 盖玻片固定。使用相同的亮度和对比度设置，用Olympus显微镜记录来 自糖尿病和对照样本的比较数字图像。

使用基于在先报道的GFAP染色程度的评分系统(Anderson et al. “Glial and endothelial blood-retinal barrier responses to amyloid-beta in the  neural retina of the rat”.Clin Ophthalmol–2008,Vol.No.:2,pp.:801-816)以 评估胶质细胞激活的程度。所述评分系统如下：只有缪勒氏细胞末端脚 板区域/GCL(1分)；缪勒氏细胞末端脚板区域/GCL和一些邻近进程(2 分)；缪勒氏细胞末端脚板区和许多进程，但未延伸至ONL(3分)；缪 勒氏细胞末端脚板区和一些位于ONL中的全部进程(4分)；缪勒氏细胞 末端脚板区和许多从GCL至ONL外层边缘的暗进程(5分)。

使用与荧光素(DeadEnd Fluorometric TUNEL System kit； PROMEGA，USA)结合的DAPI(4’,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色的TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick-End Labeling)方法对细胞凋亡进行评 估。通过与新制备的含0.1％Triton X-100的0.1％柠檬酸钠在冰上孵育2 min，将视网膜冰冻切片通透。二级抗体是Alexa 594山羊抗-兔抗体 (Invitrogen)(1:200稀释于配好的含5％BSA的封闭溶液中)。为了通过 荧光显微法评估，使用在450-500nm范围内的激发波长(例如488nm)， 且在515-565nm(绿色)范围内检测。

谷氨酸在细胞外间隙的积累和谷氨酸受体的过度激活(“兴奋性中 毒”)在视网膜神经退行性变中发挥重要作用。谷氨酸转运体对于将细胞 外谷氨酸浓度维持在神经毒性水平以下是必要的。谷氨酸/天冬氨酸转运 体(GLAST)是最主要的谷氨酸转运体，在哺乳动物视网膜中占谷氨酸 摄取的至少50％。使用特异性抗体[兔抗-GLAST(EAAT1)(1:100，Abcam  ab416，Cambridge，UK)或兔抗L-谷氨酸(1:100，Abcam ab9440， Cambridge，UK)]，通过荧光显微法对GLAST和谷氨酸进行评估。

对获得的数据进行统计分析。使用柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫 (Kolmogorov-Smirnov)检验对变量的正态分布进行评估。将数据表示为平 均值±SD。使用非配对的Student T-检验对糖尿病和非糖尿病小鼠之间的 连续变量进行比较。通过Fisher精确检验对分类变量之间进行比较。统 计显著性水平设定为p<0.05。

结果：

GLP-1Rc在小鼠视网膜中的表达：

尽管未显示数据，通过实时PCR检测了糖尿病(db/db)小鼠以及非 糖尿病(db/+)小鼠神经视网膜中GLP-1Rc mRNA的表达。在视网膜中 观察到的GLP-1Rc的表达与在胰腺(公认的GLP-1靶向组织)中观察到 的范围相同。也通过免疫组化和免疫印迹分析对GLP-1Rc蛋白进行了检 测。

胶质细胞激活的数据描述于图3中。从图3中可以看出，在用安慰 剂(C)处理的糖尿病小鼠视网膜中，在缪勒氏细胞末端脚板以及穿过视 网膜内层(INL)和外层(ONL)延伸的缪勒氏细胞放射纤维中，GFAP 主要是沿内界膜(INL)表达。用利拉鲁肽滴眼液处理的糖尿病小鼠(T) 比用媒介物处理的糖尿病小鼠表现出显著更低的GFAP免疫荧光得分 (p<0.05)，且其与非糖尿病小鼠的相似(p＝n.s)(表1)。

接下来，表1显示了基于评分系统(Anderson et al.Clin Ophthalmol 2008,同上)的胶质细胞激活的定量(以百分数表示，％)。

表1

通过TUNEL检测对视网膜细胞凋亡进行评估的数据显示于图4中。 其中图A显示了用GLP-1(7-37)类似物利拉鲁肽处理的糖尿病小鼠(T， n＝10)和用媒介物处理的糖尿病小鼠(对照，C，n＝10)的神经节细胞层 中TUNEL阳性细胞的百分数。该数据也显示于图B中，用于表示用 GLP-1R激动剂处理的糖尿病小鼠(T)和用媒介物处理的糖尿病小鼠(对 照，C)的神经视网膜中TUNEL阳性的免疫荧光。在该图B中，以任意 单位描述了整个视网膜(神经视网膜)中TUNEL荧光的定量。A.U：任 意单位。结果为平均值±SD。*p<0.05。

从图4中可以看出，与在年龄相当的非糖尿病对照的视网膜中观察 到的相比，整个视网膜中视网膜凋亡细胞的总百分数以及视网膜层(外 核层、内核层以及神经节细胞层)中凋亡细胞的百分数是显著增加的 (p<0.01)。在所有组中，神经节细胞层的凋亡水平最高。与用安慰剂处 理的糖尿病小鼠相比，用GLP-1Rc激动剂(利拉鲁肽)处理的糖尿病小 鼠在神经节细胞层表现出显著更低比例的细胞凋亡(p<0.05)。此外，用 GLP-1Rc激动剂滴眼液处理的糖尿病小鼠比用媒介物处理的糖尿病小鼠 表现出显著更低的TUNEL+免疫荧光强度，且其与非糖尿病小鼠的相似 (p＝n.s)。因此，在经过处理的小鼠中，凋亡细胞的水平更低，这是较低 视网膜损伤的间接测定。

在用GLP-1Rc激动剂(T)处理的糖尿病小鼠中，由糖尿病(C)引 起的谷氨酸水平的升高得到了消除。这一有益效果与用GLP-1Rc激动剂 (T)处理的糖尿病小鼠中GLAST水平的显著升高有关(图5)。

所有这些数据合起来为局部眼部施用(滴眼液)GLP-1Rc激动剂在 预防发生在糖尿病视网膜病变早期阶段的视网膜神经退行性进程中具有 有效效果提供了第一项证据。该数据也为可以通过局部眼部施用(滴眼 液)GLP-1Rc激动剂(特别是局部施用上文公开的肽)来治疗和/或预防 神经退行性变在其中发挥重要作用的其它视网膜疾病提供了证据。

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-US5424286

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-Anderson et al.“Glial and endothelial blood-retinal barrier responses to  amyloid-beta in the neural retina of the rat”.Clin Ophthalmol–2008, Vol.No.:2,pp.:801-816.

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.序列长度为13-50个氨基酸的肽，应用于视网膜神经退行性疾 病的局部眼部治疗和/或预防，所述肽能够到达视网膜且其N-端区域主 要包含下述序列：

HXaa¹EGTFTSDXaa²SXaa³Xaa⁴(SEQ ID NO：1)，其中：

Xaa¹是选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸；

Xaa²是选自缬氨酸和亮氨酸的氨基酸；

Xaa³是选自丝氨酸和赖氨酸的氨基酸；

Xaa⁴是选自酪氨酸和谷氨酰胺的氨基酸；以及

组氨酸是N-末端残基。

2.如权利要求1所述应用的肽，其中所述序列长度为30-40个氨 基酸。

3.如权利要求1-2中任一项所述应用的肽，其中所述视网膜神经 退行性疾病选自：糖尿病视网膜病变(DR)、老年性黄斑变性、青光 眼和色素性视网膜炎。

4.如权利要求1-3中任一项所述应用的肽，其中所述视网膜神经 退行性疾病为糖尿病视网膜病变。

5.如权利要求4所述应用的肽，其用于糖尿病视网膜病变早期阶 段的局部治疗。

6.如权利要求1-5中任一项所述应用的肽，其中Xaa¹是丙氨酸， Xaa²是缬氨酸，Xaa³是丝氨酸，Xaa⁴是酪氨酸。

7.如权利要求1-6中任一项所述应用的肽，其是哺乳动物胰高血糖 素样肽-1。

8.如权利要求7所述应用的肽，其是氨基酸序列为SEQ ID NO：2 的人胰高血糖素样肽-1(7-37)。

9.如权利要求1-6中任一项所述应用的肽，其是具有下述氨基酸序 列SEQ ID NO：3的肽：

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG，

其中所述赖氨酸残基(K)包括通过酰胺连接与赖氨酸侧链的氨 基相连的亲脂性取代基N^ε–(γ-谷酰基(N^α–十六烷酰基))。

10.如权利要求1-5中任一项所述应用的肽，其中Xaa¹是甘氨酸， Xaa²是亮氨酸，Xaa³是赖氨酸，Xaa⁴是谷氨酰胺。

11.如权利要求10所述应用的肽，其是具有下述氨基酸序列SEQ  ID NO：4的肽：

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPXaa⁵，其中

Xaa⁵是-COOH端被-NH₂基团取代的丝氨酸残基。

12.如权利要求10所述应用的肽，其是具有下述氨基酸序列SEQ  ID NO：8的肽：

HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKXa  a⁶，其中

Xaa⁶是-COOH端被-NH₂基团取代的赖氨酸残基。

13.局部眼用药物组合物，应用于视网膜神经退行性疾病的局部 眼睛治疗和/或预防，其包括权利要求1-12中任一项所述的肽。

14.如权利要求13所述应用的局部眼用药物组合物，其选自：溶 液、面霜、洗液、药膏、乳剂和悬浮液。

15.如权利要求13-14中任一项所述应用的局部眼用药物组合物， 其是滴眼液。

16.如权利要求13-15中任一项所述应用的局部眼用药物组合物， 其中所述视网膜神经退行性疾病选自：糖尿病视网膜病变、老年性黄 斑变性、青光眼和色素性视网膜炎。

17.如权利要求13-16中任一项所述应用的局部眼用药物组合物， 其中所述视网膜神经退行性疾病是糖尿病视网膜病变。