化合物P7C3-A20在制备治疗脑缺血疾病药物中的应用

摘要

本发明涉及化合物P7C3-A20在制备治疗脑缺血疾病药物中的应用。本发明通过细胞实验证实P7C3-A20可以提高缺氧缺糖模型中离体培养的小鼠大脑皮层神经元的生存率，通过动物实验证实P7C3-A20可以明显降低大鼠大脑中动脉阻塞导致的脑梗死面积，这些结果表明P7C3-A20具有脑缺血保护作用，能够防治脑缺血造成的脑损伤，在制备脑缺血损伤和/或脑梗死相关药物方面具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及化合物的新用途，具体地说，涉及化合物P7C3-A20在制备治 疗脑缺血疾病药物中的应用。

背景技术

P7C3-A20属于P7C3系列化合物的一种，CAS号为1235481-90-9，化学 结构式为：

它是一种氯丙基咔唑类化合物，口服生物利用度高，可通过血脑屏障，且 在有效剂量和高剂量下均未表现出毒性。已有国外报道发现P7C3这一类化合 物在抑郁症、老年性疾病如帕金森(PD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、 认知退行性疾病、视网膜变性等疾病中有保护作用。目前，尚无P7C3-A20对 脑缺血损伤的保护作用的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供化合物P7C3-A20的新用途。

在本发明的第一方面，提供了化合物P7C3-A20在制备防治脑缺血损伤的 药物中的应用。

作为本发明的一种具体实施方式，所述的防治脑缺血损伤是指提高大脑皮 层神经元的生存率或减少脑梗死面积。

在本发明的第二方面，提供了化合物P7C3-A20在制备药物中的应用，所 述的药物用于：

a)提高缺血大脑皮层神经元的生存率，或

b)减少脑缺血的脑梗死面积。

在本发明的第三方面，提供了化合物P7C3-A20在制备防治脑梗死的药物 中的应用。

本文中，所述的化合物P7C3-A20结构式为：

本文中，所述的“脑缺血”是指包括TIA、脑梗塞和烟雾病(但不仅限于 此)在内的颅内血管病变，其引起的主要病理变化为脑缺血损害。总的来说， 所述的“脑缺血”可能由以下原因引起：①颅内、外动脉狭窄或闭塞；②脑动 脉栓塞；③血流动力学因素；④血液学因素等。造成脑动脉狭窄或闭塞的主要 原因是动脉粥样硬化。造成脑动脉栓塞的主要原因包括动脉粥样硬化，以及因 患有风湿性心瓣膜病、亚急性细菌性心内膜炎、先天性心脏病、人工瓣膜和心 脏手术等形成的栓子随血流进入脑内造成的栓塞。血流动力学因素包括短暂的 低血压引发的脑缺血，例如心肌梗死、严重心律失常、休克、颈动脉窦过敏、 直立性低血压、锁骨下动脉盗血综合征等。血液学因素包括口服避孕药物、妊 娠、产妇、手术后和血小板增多症引起的血液高凝状态，红细胞增多症、镰状 细胞贫血、巨球蛋白血症引起的黏稠度增高所引起的脑缺血。

本发明优点在于：本发明通过细胞实验证实P7C3-A20可以提高缺氧缺糖 模型(OGD模型)中离体培养的小鼠大脑皮层神经元的生存率，通过动物实 验证实P7C3-A20可以明显降低大鼠大脑中动脉阻塞导致的脑梗死面积，这些 结果表明P7C3-A20具有脑缺血保护作用，能够防治脑缺血造成的脑损伤，在 制备脑缺血损伤和/或脑梗死相关药物方面具有广阔的应用前景。本发明为脑 缺血提供了新的药物研发方向。

附图说明

图1.神经元生存率检测结果。*P<0.05vs无P7C3-A20处理组，N＝6。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、方法

1、小鼠大脑皮层神经元的培养

(1)取孕鼠，E15-18天，脱颈椎处死，75％酒精擦拭腹部，剖腹，切取子 宫。

(2)将子宫放置于含双抗的无菌去离子水的培养皿中，转移至细胞房内。

(3)将子宫迅速转移至冰冷的高糖DMEM中，用眼科剪从子宫角处撕开 子宫，取出胎鼠，剪刀断头，仔细剥离，取大脑；显微镜下分离出大脑皮层， 仔细剥除脑膜和血管。

(4)将脑组织转入新鲜冰冷的高糖DMEM中，漂洗2次后转移至1.5mL EP 管中，放置冰上，用弯剪尽量剪碎脑组织。

(6)将剪碎的脑组织转移至小锥形瓶中，加入Accutase酶，锡箔纸封口， 37℃摇床消化10min。

(7)消化结束后，加入1mL FBS终止消化，混匀，1000rpm离心5min， 舍弃上清液。

(8)加入5mL接种培养基，1000rpm离心5min，舍弃上清液。

(9)加入少量接种培养基，混匀，200目细胞筛过筛，并用细胞计数板计 数。

(10)加入接种培养基调整细胞密度，接种。

(11)接种后4-6h，根据细胞贴壁情况更换成Neurobasal生长培养基。

(12)接种36h后，半量换液，加入阿糖胞苷(终浓度为2.5μg/mL)。

(13)第5天，全量换液。

(14)第7天，全量换液，加药处理或进行其他操作。

其中，接种培养基：含10％FBS+10％马血清的高糖DMEM；Neurobasal 生长培养基：2％B27添加物，1％双抗，25μM L-谷氨酸。

2、OGD模型在体外模拟脑缺血

待原代培养的小鼠大脑皮层神经元生长至第7天，弃细胞培养基，用PBS 清洗两次。加入无糖DMEM培养基，给药组加入溶于二甲基亚砜(DMSO) 的P7C3-A20(购于上海技毅生物科技有限公司，CAS号为1235481-90-9)。 P7C3-A20的终浓度为10mM、30mM及100mM，并将溶剂DMSO的浓度控 制在0.1％。对照组则加入0.1％的DMSO。将神经元放置于三气培养箱(含 1％O₂、5％CO₂、94％N₂)中培养12小时，通过制造低氧低糖环境，模拟脑缺 血。培养12小时后，用CCK-8方法测神经元生存率。CCK-8细胞活力试剂盒 购于日本Dojindo公司，是一种广泛运用的细胞活力及生存率的检测试剂盒。

二、结果

结果见图1，可以看到OGD大幅度降低了神经元的生存率，而P7C3-A20 化合物的处理可显著减轻OGD导致的神经元的生存率下降(P<0.05)。

实施例2

一、方法

用大鼠(Sprague-Dawley大鼠，体重250g左右，上海斯莱克实验动物有 限公司)制备永久性脑缺血损伤模型。过程如下：将大鼠麻醉，打开颅骨，直 接在目视下将大脑中动脉电凝，导致左侧大脑中动脉堵塞。30分钟后给予大鼠 腹腔注射P7C3-A20(30mg/kg)。复位颅骨，缝合皮肤，即成功制备大鼠大脑 中动脉堵塞导致的永久性脑缺血模型。大脑中动脉堵塞后24小时，给予检测 脑梗死面积。脑梗死体积检测采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(购自Amersco公 司)染色法，即TTC染色法。

二、结果

结果见表1，可以看到：化合物P7C3-A20明显降低了脑梗死面积。

表1对照组与P7C3-A20治疗组的脑梗死面积对比

注：***P<0.001vs对照组，N＝9-10。表格中的数字为脑梗死占全脑体积 的百分比。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些 改进和补充也应视为本发明的保护范围。