一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物

摘要

本发明基于乳腺癌不同分子亚型的患者血浆代谢组学研究，发现可用于区分Luminal B型vs HER2过表达型、Luminal A型vs Basal-like型乳腺癌的生物标志物。与HER2过表达型相比，Luminal B型患者血浆中脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸及缬氨酸明显上调，哌啶酸明显下调；与Basal-like型相比，LuminalA型患者血浆中缬氨酸含量明显上调，哌啶酸、甘氨酸、甘氨鹅去氧胆酸及棕榈酸明显下调。本发明能够快速预测乳腺癌分子亚型，为乳腺癌的临床诊断、治疗及预后评价提供重要依据。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤生物标记物领域，具体涉及一组乳腺癌分子亚型的生物标志物的组合物， 该组合物来源于血浆内源性小分子代谢产物，该组合物对于快速区分乳腺癌的分子亚型和临 床个体化治疗具有重要意义。

背景技术

乳腺癌是女性中最为常见的恶性肿瘤，具有很强的异质性，近年来其发病率和死亡率均 在逐渐增高。乳腺癌患者中人表皮生长因子受体2(HER2)是一种原癌基因，它的高水平表 达提示患者容易出现腋窝淋巴结转移，临床建议使用相应的分子靶向药物进行干预。雌激素 受体(ER)的表达是应用内分泌药物治疗不可或缺的重要依据。根据HER2和ER的基因表 达情况，可将乳腺癌分为4种分子亚型：LuminalA型(ER+、HER2-)、Luminal B型(ER+、 HER2+)、HER2过表达型(ER-、HER2+)和Basal-like型(ER-、HER2-)。

确定乳腺癌分子分型是个体化治疗的基础。目前，临床上主要通过活体组织检查法及后 续的免疫组化法研究癌细胞基因的表达情况来判断乳腺癌的分子分型。但是，该方法昂贵、 耗时，对病人容易造成较大的创伤，且容易误判。

因此发展快速、无创的乳腺癌分子分型诊断方法尤为重要。有研究表明，癌症病人的基 因水平变化会在体内内源性小分子代谢物水平上有所呈现。血浆分析是临床上常用的一种疾 病诊断方法，因其简便、经济且相对无创的优点而被广泛采用。目前尚未有人使用血浆代谢 物水平区分乳腺癌分子分型。

因此，应用血浆代谢组学寻找生物标志物以区分乳腺癌分子亚型的研究策略对于乳腺癌 的临床快速诊断及个体化治疗具有重要意义。

发明内容

本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物：哌啶酸、缬氨酸在制备区分乳腺 癌亚型生物标志物的组合物的应用。

本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物：哌啶酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮 氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸在制备区分Luminal B型和HER2过表达型乳腺癌的标志物的组合 物的应用。

本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物：

分别检测HER2过表达型、Luminal B型患者的离体血浆

与HER2过表达型相比，Luminal B型的哌啶酸下调，缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨 酸、2-辛烯二酸上调。

本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物：

单位：提取离子流强度

哌啶酸：Luminal B型2156672±45553、HER2过表达型2198270±79503；

缬氨酸：Luminal B型1368882±182218、HER2过表达型1233138±265196；

脯氨酸：Luminal B型1325183±55489、HER2过表达型1311271±79206；

异亮氨酸：Luminal B型325054±5322、HER2过表达型224589±9743；

亮氨酸：Luminal B型2548628±130655、HER2过表达型2301808±90442；

2-辛烯二酸：Luminal B型1126470±42105、HER2过表达型1109990±70424。

本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物：哌啶酸、缬氨酸、甘氨酸、甘氨 鹅去氧胆酸、棕榈酸在制备区分Luminal A型和Basal-like型乳腺癌的标志物的组合物的应用。

本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物：

分别检测Luminal A、Basal-like型患者中的离体血浆

与Basal-like型相比，Luminal A型患者血浆中缬氨酸含量明显上调，哌啶酸、甘氨酸、 甘氧鹅去氧胆酸及棕榈酸明显下调。

本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物：

单位：提取离子流强度

哌啶酸：Luminal A型217914±99803、Basal-like型256884±119445；

缬氨酸：Luminal A型1152199±294556、Basal-like型892569±141893；

甘氨酸：Luminal A型361960±164984、Basal-like型487493±144298；

甘氨鹅去氧胆酸：Luminal A型19579±1680、Basal-like型27315±1922；

棕榈酸：Luminal A型264688±43895、Basal-like型292127±35745。

本发明采用的技术方案是：应用基于液相色谱质谱联用、气相色谱质谱联用技术的非靶 向代谢组学分析，结合多元数据分析处理方法，开展乳腺癌不同分子亚型患者的血浆代谢组 学研究，寻找患者血浆中表征乳腺癌分子分型的内源性小分子生物标志物组合。

检测患者离体血浆：与HER2过表达型相比，Luminal B型患者血浆中脯氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、2-辛烯二酸及缬氨酸水平明显上调，哌啶酸水平明显下调；与Basal-like型相比， Luminal A型患者血浆中缬氨酸水平明显上调，哌啶酸、甘氨酸、甘氨鹅去氧胆酸及棕榈酸水 平明显下调。

本发明的乳腺癌分子亚型的生物标志物的确定过程如下：

材料：乙腈及甲酸(UPLC纯)购于美国ROE公司；色谱级别甲醇和氯仿购于江苏汉邦 科技有限公司；氯化甲氧胺及N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)购 于美国Sigma-Aldrich公司；去离子水由美国密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超纯水系统 制备；标准化合物包括：2-异丙基苹果酸、谷氨酰胺、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨 酸、副黄嘌呤、维生素C、苹果酸、异亮氨酸、甘氨鹅脱氧胆酸、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、 乳酸、甘氨酸、草酸、亮氨酸、甘油、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、柠檬酸、D-果糖、D-葡 萄糖、棕榈酸、硬脂酸及胆固醇，均购于美国Sigma-Aldrich公司。

血浆标本采集：96例乳腺癌患者术前外周静脉血内的血浆和年龄、性别与实验组相匹配 的79例健康志愿者的外周静脉血的血浆。所有的实验者均有正常的心肺肝肾及造血功能，采 血时间均为清晨空腹状态。

血浆样品提取溶剂的优选过程：

UPLC-Q/TOF-MS血浆样品提取溶剂优化：利用响应面法进行实验设计，以质谱ESI+和 ESI-检测模式下的峰个数和总峰面积为标准考察不同溶剂(乙腈、甲醇、乙醇、氯仿、水)， 对血浆标本的提取效率。将实验测得数据进行多变量分析，在PLS模型中重要性因子(variable  importance to projection，VIP值)反映了这些变量对模型响应的重要性。乙腈、甲醇、乙醇、 氯仿、水乙腈、水、甲醇、氯仿和乙醇的VIP值依次为1.503，0.802，0.651，0.688和0.987， 结果表明乙腈的提取效率最高，故最终选择乙腈作为血浆样本的提取溶剂。

样品的分析方法为：GC-Q/MS和UPLC-Q/TOF-MS。

方法学考察：

精密度：连续6针得到的仪器精密度RSD＜5％，说明实验中仪器状态良好。选取血浆内 典型的两种内源性代谢物亮氨酸和甘氨酸，考察其日内和日间精度。两种代谢物日内精密度 基本在RSD基本在5％～15％范围内，可以看出总体日间精度度的RSD大于日内精密度；稳 定性：实验中选择25℃进样室温度。结果显示，三天中亮氨酸及甘氨酸稳定性良好。

优选的样品制备及分析

GC-Q/MS

样品处理方法：取200μL血浆于1.5mL离心管中，加入50μL 1mg/mL的2-异丙基苹果 酸溶液内标，涡旋20秒混匀，加入400μL甲醇、氯仿和水的混合溶液(比例为2.5∶1∶1)，然 后在70℃的金属浴上振摇30min(1200rpm)，16000g×5min离心(4℃)，取500μL上清于 1.5mL离心管中，加入500μL蒸馏水，涡旋混匀，然后16000g×5min离心(4℃)，取500μL 上清于1.5mL离心管中，在室温下用氮吹仪吹干，所得残渣用80μL的甲氧胺吡啶溶液溶解， 在50℃条件下肟化8h，加入60μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺试剂，在70℃条件下 衍生化2h，即得。

GC-Q/MS条件：美国Agilent 7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪。色谱柱HP-5MS毛细 管柱(30.0m×0.25mm，毛细管厚度0.25μm)；载气为高纯氦气，流速1.0mL/min；进样量2 μL；程序升温：80℃恒温2min，80℃-300℃(5℃/min)恒温6min；不分流，进样温度300℃； 接口温度300℃；离子源温度200℃；电子能量50eV；溶剂延迟3min；采用全扫描模式，扫 描质量范围：m/z 30-600道尔顿。

UPLC-Q/TOF-MS：

样品处理方法：取100μL血浆于1.5mL离心管中，加入400μL乙腈，涡旋30秒后混匀， 13000rpm×10min离心(4℃)，取200μL上清于1.5mL离心管中，在室温下用氮吹仪吹干， 所得残渣用300μL的20％乙腈水溶液溶解，即得。

UPLC-Q/TOF-MS条件：

色谱分离采用超高效液相色谱系统(UPLC，Agilent 1290，USA)。色谱柱为Waters BEH C₁₈柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，柱温25℃，进样室温度为室温，进样量2μL。

正、负离子模式流动相组成均是A为体积浓度0.1％甲酸水溶液，B为体积浓度0.1％甲酸 乙腈溶液。

梯度洗脱条件：0～1min为0～30％B相，2min内B相线性增加到60％，3～8min线性 变化至90B相，然后在8～9min线性增加至100％B相并保持1min；流速0.3mL/min，柱 后流出液不经分流直接导入质谱系统检测。

质谱分析采用四级杆-飞行时间质谱(Agilent 6530Q-TOF/MS，USA)。以电喷雾离子源 (ESI)正、负离子模式检测；干燥气流速为7L/min，干燥气温度为300℃，干燥气和锥孔 气均为高纯氮气；离子源温度100℃，正离子和负离子模式下毛细管电压均为为3000V，碰 撞电压为100V；采用全扫描模式每秒进行三次数据采集，扫描质量范围：m/z 100-1000道尔 顿。

数据处理和分析

将GC-Q/MS和UPLC-Q/TOF-MS得到的数据导入SIMCA软件(version 13.0.2，Umetrics) 进行多元统计分析。通过建立OPLS-DA(正交偏最小二乘法-判别分析)模型，我们发现区分 Luminal B和HER2过表达型之间及Luminal A和Basal-like型之间代谢轮廓贡献较大的差异 代谢物，前者有6种，后者5种，其中有2个共有差异代谢物。如图1所示。

通过HMDB(http：//www.hmdb.ca/)和Metline(http：//metlin.scripps.edu/)等数据库进行物质结 构的检索，利用数据库中提供的精确分子量和上述所得的MS/MS图谱缩小来自乳腺癌分子 亚型的生物标志物与数据库结构物质的可能范围，提高两者的匹配程度。最终通过购买标准 品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级MS裂解谱比对，对乳腺癌分子亚型的 生物标志物进行结构表征和确认。

鉴定表征的9个化合物，即脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸、缬氨酸、哌啶酸、 甘氨酸、甘氨鹅去氧胆酸及棕榈酸，他们的色谱保留时间与标准品的保留时间一致，并且其 多级质谱碎片信息与标准品的结构特征相吻合。

本发明涉及一种区分乳腺癌亚型生物标志物的组合物：哌啶酸、缬氨酸在制备区分乳腺 癌亚型生物标志物的组合物的应用。

本发明涉及将脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、2-辛烯二酸、哌啶酸及缬氨酸用于制备区分乳 腺癌Luminal B型vs HER2过表达型生物标志物的组合物；本发明涉及将哌啶酸、甘氨酸、 甘氨鹅去氧胆酸、棕榈酸及缬氨酸用于制备区分Luminal A型vs Basal-like型生物标志物的 组合物。结果见表1。

表1.区分乳腺癌Luminal B型vs HER2过表达型及Luminal A型vs Basal-like型的生物 标志物汇总

验证：

进一步采用受试者工作曲线(ROC)法检验缬氨酸、哌啶酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨酸 和棕榈酸五种生物标志物对Luminal A型和Basal-like型乳腺癌之间的诊断准确率。

结果显示：训练集中，曲线下面积为0.969(灵敏度92.3％、特异性90.0％)；测试集中， 曲线下面积为0.959(灵敏度85.7％、特异性92.9％)。在训练集中，基于最优灵敏度和特异 性，得到的最优临界值(cut-off value)为0.518。运用该临界值进行样本预测，结果显示：此 五种生物标志物组对训练集的预测准确率为90.0％(Luminal A型)和80.0％(Basal-like型)， 对测试集的预测准确率为90.9％(Luminal A型)和87.5％(Basal-like型)。结果如图2所示。

综上所述，本发明为通过血浆代谢组学为临床上预测乳腺癌的分子亚型提供了一组新的 生物标志物，这种方法具有快速、简便、经济及无创的优点。

上述研究方法相较于传统的乳腺癌诊断方法具有快速、简便、经济且相对无创等优点。

本发明对于预测乳腺癌分子亚型具有重要意义，为乳腺癌临床诊断、个体化治疗及预后 评价提供重要依据。

附图说明

图1：实施例1中Luminal B型vs HER2过表达型(A)及Luminal A型vs Basal-like型(B) 乳腺癌患者的OPLS-DA得分图。

图2：实施例2中缬氨酸、哌啶酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨酸和棕榈酸五种生物标志物在训练 集和测试集对Luminal A型和Basal-like型乳腺癌患者的诊断准确率验证图。

图1-2的具体解释

图1的A为：Luminal B型与HER2过表达型乳腺癌在UPLC-Q/TOF-MS正离子模式、负离 子模式、GC-MS下OPLS-DA图；

图1的B为：Luminal A型与Basal-like型乳腺癌在UPLC-Q/TOF-MS正离子模式、负离子模 式、GC-MS下OPLS-DA图；

图2的A为：训练集中Luminal A型与Basal-like型乳腺癌受试者工作曲线

图2的B为：测试集中Luminal A型与Basal-like型乳腺癌受试者工作曲线

分别为训练集和测试集的ROC(受试者工作特征)曲线，AUC(曲线下面积)的值揭示了 OPLS-DA模型的诊断准确性；

图2的C为：训练集中Luminal A型与Basal-like型乳腺癌预测情况

图2的D为：测试集中Luminal A型与Basal-like型乳腺癌预测情况

显示训练集和测试集ROC分析得到的Cut off value(截断点)，0和1分别代表Luminal A型 和Basal-like型乳腺癌患者。

具体实施例

实施例1

用于区分Luminal B型及HER2过表达型乳腺癌的生物标志物组合，其组成及相对峰强度 如表2所示：

表2 Luminal B型vs HER2过表达型乳腺癌差异代谢物

^aVIP变量重要性投影；^bEIC提取离子流；^cHER2过表达型相对于Luminal B型乳腺癌 差异代谢物提取离子流峰强度变化趋势。

实施例2

用于区分Luminal A型及Basal-like型乳腺癌的生物标志物组合，其组成及相对峰强度如 表3所示：

表3 Luminal A型vs Basal-like型乳腺癌差异代谢物

^aVIP变量重要性投影；^bEIC提取离子流；^cBasal-like型相对于Luminal A型乳腺癌差异代谢 物提取离子流峰强度变化趋势。