药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法及所用染料新用途

摘要

本发明提供了一种药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法及所用染料新用途，采用能够特异染色细胞膜、通过胞吞作用进入细胞内的细胞膜荧光染料标记细胞脱颗粒模型上的囊泡循环现象，基于影像学信息进行分析，以高内涵系统作为检测手段，在高内涵系统上检测药物注射剂所导致细胞内荧光增强来反映细胞发生脱颗粒状况，通过荧光强度转化计算方法计算细胞脱颗粒阳性率来预测药物注射剂引发过敏类过敏反应的机会，所用染料包括FM4-64、FM1-43、AM1-43或AM4-66；所述检测方法操作简单，结果客观，具有重要应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学和药学领域，尤其是药物注射剂过敏类过敏反应 的检测方法及所用染料新用途。

背景技术

药物注射剂在危重疾病治疗中发挥重要作用，但不良反应一直是困扰其 临床应用的主要问题。在药物注射剂不良反应中，过敏/类过敏反应一直高居 首位，因此，快速检测药物注射剂过敏/类过敏反应对注射剂安全性生产和临 床应用具有重要意义。

药物注射剂过敏/类过敏反应传统评价方法包括整体动物检测方法和细 胞生化介质检测方法两类。整体动物检测方法采用大/小鼠、豚鼠、犬、食蟹 猴等动物，通过观察给药后出现的过敏症状，检测血液中过敏物质的含量变 化，测定过敏介质引起的动物血压、心律变化等指标来判断过敏反应的发生， 但整体动物实验法需要使用大量动物，同时存在动物种属差异大、个体间差 异明显、观察指标主观性强等不足。细胞生化介质检测方法通常采用细胞株 或原代培养肥大细胞做模型，通过检测包括细胞脱颗粒释放的生化介质，如 β-己糖苷酶、类胰蛋白酶和组胺或白介素等指标预测过敏反应发生，但采用 细胞生化介质检测方法，由于细胞脱颗粒释放介质种类较多，常导致不同检 测指标之间的一致性差；如果同时进行多指标检测，实验程序复杂而且成本 增高，加之实验室环境因素影响较多，各实验室报道的研究结果差异较大。 同时，原代培养的肥大细胞来源于动物体内，虽然在一定程度上节省了动物 数量，但肥大细胞体外培养时间短，不能长期使用，仍难以解决动物用量大 的问题。因此，有必要发展一种简单快速的检测过敏/类过敏反应的新方法。

为了建立检测过敏/类过敏反应快速检测方法，有必要明确过敏反应和类 过敏反应间的联系和区别。过敏反应包括致敏阶段和抗原再刺激过程，但类 过敏反应是类过敏原刺激后直接引发而无需致敏过程；两者均可引起肥大细 胞/嗜碱粒细胞脱颗粒释放过敏介质，进而引起局部/全身过敏症状。可见， 在过敏反应和类过敏反应发生的病理生理过程中，肥大细胞脱颗粒是共同的 关键反应步骤。因此，以细胞脱颗粒为考察关键指标预测过敏/类过敏反应发 生具有重要应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供药物注射剂过敏类过敏反应的检测 方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述检测方法中所用染料的新 用途。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，采用能够特异染色细胞膜、通 过胞吞作用进入细胞内的细胞膜荧光染料标记细胞脱颗粒模型上的囊泡循环 现象，基于影像学信息进行分析，以高内涵系统作为检测手段，在高内涵系 统上检测药物注射剂所导致细胞内荧光增强来反映细胞发生脱颗粒状况，通 过荧光强度转化计算方法计算细胞脱颗粒阳性率来预测药物注射剂引发过敏 类过敏反应的机会。

优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述细胞膜荧光 染料为FM类染料或AM类染料。

优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述细胞膜荧光 染料为FM4-64、FM1-43、AM1-43或AM4-66。

优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述细胞脱颗粒 模型包括RBL-2H3细胞株、P815细胞株或Ku812细胞株。

优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述细胞脱颗粒 模型为RBL-2H3细胞株(大鼠嗜碱性白血病细胞)时，用MEM完全培养基培 养于37℃、饱和湿度的5％CO₂培养箱中,当细胞增长至80％丰度时进行传代， 传代比例为1:5，约每三天传代一次。

所述MEM完全培养基含1％PS双抗、10％FBS和89％MEM基础培养基。

上述RBL-2H3细胞株(大鼠嗜碱性白血病细胞)是从Wistar大鼠保持肿 瘤状态的嗜碱性细胞中分离和克隆而来，该细胞具有高亲和力的IgE受体,被 广泛用于肥大细胞功能研究；由于RBL-2H3细胞具有永生化特性，培养方法 简单，生长迅速，避免了由体内分离肥大细胞的繁琐过程，因此是建立体外 过敏反应和类过敏反应的良好细胞模型。所述RBL-2H3细胞购自中国科学院 典型培养物保藏委员会细胞库。

优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述高内涵系统 作为检测手段，具体方法为：细胞接种于孔板中后，加入Hoechst33342染色 细胞核，共孵育30min后洗去染料，然后加入细胞膜荧光染料溶液，再次共 孵育30min后进行高内涵检测，获得细胞荧光图像；发生脱颗粒的细胞胞质 内荧光强度明显升高，计算胞质内荧光强度增加的细胞个数，据此细胞脱颗 粒的阳性细胞百分率。

优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述高内涵系统 中细胞脱颗粒的阳性细胞百分率的具体计算方法为：采用软件分析高内涵系 统所获得的细胞荧光图片，首先根据Hoechst33342染色的细胞核来识别图片 中所有细胞，然后计算每个细胞胞质中FM4-64荧光强度；按照8％脱颗粒率 来确定空白对照组荧光强度值，然后采用此荧光强度值去分析同批阳性对照 组和测试药物组中的荧光增强阳性细胞数目，凡是细胞内荧光强度高于对照 组荧光强度值者确定为阳性细胞，每个测试孔内按照：细胞脱颗粒率＝阳性细 胞总数/细胞总数计算，细胞脱颗粒率越高，提示测试样品引起过敏/类过敏 反应的几率越大。

对于本身有颜色的注射剂，比如大多数中药注射剂，需要首先考察注射 剂本身颜色对所用荧光染料的荧光强度是否存在影响，如果存在影响，需要 基于多批注射剂在不同浓度与荧光染料相互作用数据，计算得出不同浓度下 的影响系数，空白对照组荧光强度值经系数转化后用于分析相应浓度下的测 试样品阳性细胞，计算相应细胞脱颗粒率。

上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法中所用细胞膜荧光染料作为 药物注射剂过敏类过敏反应的检测试剂方面的新用途。

优选的，上述细胞膜荧光染料的新用途，所述细胞膜荧光染料为FM4-64、 FM1-43、AM1-43或AM4-66，即：

FM4-64作为药物注射剂过敏类过敏反应的检测试剂方面的新用途。

FM1-43作为药物注射剂过敏类过敏反应的检测试剂方面的新用途。

AM1-43作为药物注射剂过敏类过敏反应的检测试剂方面的新用途。

AM4-66作为药物注射剂过敏类过敏反应的检测试剂方面的新用途。

本发明的有益效果是：

上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法以细胞膜特异荧光染料为工 具，采用高内涵系统对囊泡循环引起的细胞内荧光强度增加进行检测，据此 确定细胞发生了脱颗粒现象，进而计算细胞脱颗粒率预测过敏/类过敏反应发 生；所用染料为水溶性苯乙烯类复合物，对细胞无毒性，在水相中没有荧光， 只有插入生物脂质膜后才显示荧光，能够与细胞质膜及细胞器膜特异结合后 发出高强度荧光；囊泡循环过程包括囊泡转运、定向、锚定、细胞膜融合和 囊泡回收等步骤，其中囊泡回收能够将膜上的特异荧光染料内吞，引起细胞 内荧光染料积累，造成胞内荧光强度增加；高内涵系统(high content system, HCS)特点是基于影像学对细胞功能进行分析，高内涵系统包括腔室玻片、多 孔板以及组织芯片扫描等多种可调节扫描模式，系统扫描后获取的图像可传 输到本地服务器进行存储和有效分析，同时系统配有多种图像分析方法，可 根据研究目的进行多指标分析，具有高通量筛选能力。

上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，操作简单，结果客观，具 有重要应用价值。

附图说明

图1为丹红注射液降低FM4-64荧光强度图谱；

图2为典型DHI样品引起细胞脱颗粒荧光图像，稀释至750×尚引起细胞 脱颗粒发生；

图3为典型DHI脱颗粒样品脱颗粒率图谱，与对照组比较，***P<0.001；

图4为PI 750×引起细胞脱颗粒现象图谱；

图5为PI导致细胞脱颗粒率统计图谱，与对照组比较，***P<0.001；

图6为绿原酸引起的细胞脱颗粒现象图谱；

图7为绿原酸导致细胞脱颗粒率统计图谱，与对照组比较， *P<0.05,***P<0.001；

图8为荧光染料FM4-64标记RBL-2H3细胞脱颗粒的高内涵检测结果图， 阳性对照药为15μg/ml Compound 48/80(Compound 48/80是N-甲基-对甲氧 基苯乙胺和甲醛缩合产生的聚合物)；丹红注射液临床发生过敏症状的样品测 试结果，Hoechst 33342染色细胞核，FM4-64特异染色细胞膜。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体 实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1：中药注射剂丹红注射液类过敏反应检测

丹红注射液是临床治疗心脑血管疾病的常用中药，市场占有率高，应用 范围广泛；由丹参和红花两味中药制成，呈红棕色透明液体，具有中药注射 剂的典型特征，如化学成分多样和自身具有颜色，因此选择丹红注射液为研 究对象具有一定的代表意义。为了考察方法可靠性，收集到了临床中有过敏 症状报告的30批次丹红注射液做为研究样品。

主要药品与试剂

丹红注射液(DHI,Danhong injection)为菏泽步长制药有限公司产品。 MEM基础培养基(Cat No.41500034)和胎牛血清为美国Gibco公司产品，培 养细胞时MEM基础培养基中加入10％胎牛血清和1％青霉素+链霉素。 Compound48/80(Sigma,Cat No.2313)用MEM无酚红培养基(Gibco,Cat No. 51200038)溶解，配制成100ug/ml的储备液。荧光染料Hoechst33342(Cell  Singaling Technology，Cat No.4082)用MEM无酚红培基溶解，配制成100 μg/ml储备液。荧光染料FM4-64(Invitrogen,Cat No.T13320)，用MEM 无酚红培基溶解，配制成10μg/ml储备液。

上述FM4-64的分子结构式如下：

主要仪器和耗材

高内涵Operetta+Harmony分析软件，PerkinElmer公司；细胞操作台； Eppendorf移液枪(量程分别为1mL，200μL，100μL，10μL，2.5μL),96 孔黑板，Corning公司(3603型)。

所用细胞

RBL-2H3细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

主要操作方法:

实验设8个组，包括正常对照组、阳性药Compound48/8015μg/ml组 和丹红注射液6个浓度组，由于丹红注射液成分复杂，有效成分浓度未知， 为了系统考察丹红注射液类过敏反应量效关系，其稀释浓度分别设立为10×、 50×、100×、500×、750×和1000×，所有丹红注射液的实验浓度分别用 无酚红培养基对丹红原液进行稀释。每组均设三个复孔，每孔终体积均为100 μL，试验重复至少两次。

实验步骤：

(1)RBL-2H3细胞用MEM完全培养基(含1％PS双抗+10％FBS+89％ MEM基础培养基)进行培养，取对数生长期的RBL-2H3细胞，按10⁴个/孔接种 于96孔板中，每孔培养体积为100μl，在温度37℃，饱和湿度，5％CO₂培养 箱中培养24小时；

(2)细胞培养24h后，吸弃培养基，用MEM无酚红培养基洗一次；

(3)用MEM无酚红培养基稀释Hoechst33342储备液,终浓度为1μg/m, 在细胞经无酚红MEM培养基清洗后，加入Hoechst33342染细胞核，每孔100 μl，染色时间为30min；

(4)每孔中的液体总体积为100μl，FM4-64的终浓度为2μg/mL。 Compound48/40(C48/80)的终浓度为15μg·mL^-1,各成分体积见下表1；

表1 DHI样品加样表(单位：μL)

(5)细胞核染色30min后，吸出Hoechst33342，用MEM无酚红培基洗 三次。加入各组药物，在培养箱中共孵育30min；

(6)打开高内涵Operetta和Harmony分析软件，设置Hoechst33342 和FM 4-64的激发波长和发射波长：

(7)物与细胞共孵育30min后，将黑板放入Operetta，通过观察细胞 内荧光亮度，确定脱颗粒细胞，计算脱颗粒率，检测类过敏反应发生情况；

(8)统计学处理

采用SPSS11.0软件系统进行统计学分析，用Origin8.5软件做统计图， 组间比较采用ANVOA法进行显著性检验，P<0.05认为有显著性差异。

实验数据分析：为了计算细胞脱颗粒率，采用以下计算方法：类过敏反 应高内涵检测中空白对照组的脱颗粒率标准控制在8±1％水平，由此确定空 白组荧光强度。由于丹红注射液本身为红棕色透明液体，实验证实丹红注射 液能够降低FM4-64荧光强度(图1)，基于4批正常丹红注射液样品在不同浓 度时与FM4-64相互作用数据，初步确定了丹红注射液在不同浓度下与FM4-64 相互作用后对FM4-64荧光强度降低系数，见表2，基于以下公式计算丹红注 射液实验组的荧光强度标准，用于确定其脱颗粒率：

丹红脱颗粒率荧光强度标准＝空白对照组荧光强度(即8％细胞脱颗粒率荧 光强度)×(丹红浓度降低FM4-64荧光强度系数)

按照以上公式计算出的丹红注射液不同稀释浓度下的荧光强度标准，用 于分析相应浓度下丹红注射液类过敏样品脱颗粒率。统计30批丹红注射液脱 颗粒率，见表3，列出典型丹红样品引起细胞脱颗粒率情况(图2-3)。

表2 FM4-64与丹红注射液相互作用后的荧光强度转化系数

表3 30批次临床发生过敏症状的丹红注射液高内涵检测脱颗粒率

实施例2：西药注射液葛根素注射液类过敏反应检测

葛根素注射液主要用于辅助治疗冠心病、心绞痛等疾病。2003年1月1 日-2005年6月30日国家不良反应检测中心统计病例报告葛根素不良反应共 1006例。从2004年至今，几乎每年均有关于葛根素注射液致过敏反应的临床 报道，其中过敏性休克报道屡见不鲜。在说明书中明确提出对葛根素注射液 过敏或过敏体质者禁用葛根素注射液。高内涵检测方法以葛根素注射液为检 测对象更能体现该方法的可行性。

主要药品与试剂

葛根素注射液(PI,Puerarin injection)为济南利民制药有限公司产 品。MEM基础培养基(Cat No.41500034)和胎牛血清为美国Gibco公司产品， 培养细胞时MEM基础培养基中加入10％胎牛血清和1％青霉素+链霉素。 Compound48/80(Sigma,Cat No.2313)用MEM无酚红培养基(Gibco,Cat No. 51200038)溶解，配制成100μg·mL^-1的储备液。荧光染料Hochest33342(Cell  Singaling Technology，Cat No.4082)用MEM无酚红培基溶解，配制成100 μg·mL^-1储备液。荧光染料FM 4-64(Invitrogen,Cat No.T13320)，用 MEM无酚红培基溶解，配制成10μg·mL^-1储备液。

主要仪器和耗材

高内涵Operetta+Harmony分析软件，PerkinElmer公司；细胞操作台； Eppendorf移液枪(量程分别为1mL，200μL，100μL，10μL，2.5μL),96 孔黑板，Corning公司(3603型)。

所用细胞

RBL-2H3细胞，购自中国科学院上海细胞库。

主要操作方法

实验设8个组，包括正常空白对照组、阳性药Compound48/8015μg/ml 组和葛根素注射液6个浓度组：50x、100x、200x、500x、750x和1000x，葛 根素注射液为透明液体，未发现对FM4-64荧光强度有干扰作用。所有葛根素 注射液的实验浓度分别用无酚红培养基对丹红原液进行稀释。每个组均设三 个复孔，所有孔的终体积均为100μL，试验重复至少两次。葛根素注射液为 透明液体，未发现对FM 4-64的干扰。

实验步骤

(1)RBL-2H3细胞用MEM完全培养基(含1％PS双抗+10％FBS+89％ MEM基础培养基)进行培养，取对数生长期的RBL-2H3细胞，按10⁴个/孔接种 于96孔板中，每孔培养体积为100μL，在温度37℃，饱和湿度，5％CO₂培养 箱中培养24小时；

(2)细胞培养24h后，吸弃培养基，用MEM无酚红培养基洗一次；

(3)用MEM无酚红培养基稀释Hoechst33342储备液,终浓度为1.0μ g/mL。在细胞经无酚红MEM培养基清洗后，加入Hoechst33342染细胞核，每 孔100μL，染色时间为30min；

(4)每孔中的液体总体积为100μL，FM4-64的终浓度为2.0μg·mL^-1； Compound48/40(C48/80)的终浓度为15μg·mL^-1，各成分体积见下表4；

表4 PI样品加样表(单位：μL)

(5)细胞核染色30min后，吸出Hoechst33342，用MEM无酚红培基洗 三次。加入各组药物，在培养箱中共孵育30min；

(6)打开高内涵Operetta和Harmony分析软件，设置Hoechst33342 和FM 4-64的激发波长和发射波长：

(7)药物与细胞共孵育30min后，将黑板放入Operetta，通过观察细胞 内荧光亮度，确定脱颗粒细胞，计算脱颗粒率，检测类过敏反应发生情况；

(8)统计学处理

采用SPSS11.0软件系统进行统计学分析，用Origin8.5软件做统计图， 组间比较采用ANVOA法进行显著性检验，P<0.05认为有显著性差异。

实验数据分析：为了计算细胞脱颗粒率，采用以下计算方法：类过敏反 应高内涵检测中空白对照组的脱颗粒率标准控制在8±1％水平，由此确定空 白组荧光强度；由于葛根素为透明液体，未发现对FM 4-64存在明显干扰,因 此直接采用空白对照组荧光强度为标准分析相应浓度下葛根素注射液样品脱 颗粒率，列出典型葛根素样品引起细胞脱颗粒率情况，西药注射液葛根素注 射液类过敏反应检测结果见图4-5。

实施例3：类过敏原绿原酸引起的类过敏反应检测

绿原酸具有心血管保护、抗氧化、抗癌、抗菌等药理作用。很多引起过 敏反应的注射剂如双黄连注射液、栀子苷茵栀黄注射液、清开灵注射液等均 含有绿原酸，并且致敏性均与绿原酸有关。在目前许多过敏反应相关研究中， 还以绿原酸做为阳性对照组，是目前已知的可以引起细胞脱颗粒的一种类过 敏原。

主要药品与试剂

绿原酸(Chl，Chlorogenic acid)标准品在成都曼思特生物科技有限公 司购得，配制成100μm储备液。MEM基础培养基(Cat No.41500034)和胎 牛血清为美国Gibco公司产品，培养细胞时MEM基础培养基中加入10％胎牛血 清和1％青霉素+链霉素。Compound48/80(Sigma,Cat No.2313)用MEM无 酚红培养基(Gibco,Cat No.51200038)溶解，配制成100ug/ml的储备液。 荧光染料Hochest33342(Cell Singaling Technology，Cat No.4082)用 MEM无酚红培基溶解，配制成100μg/ml储备液。荧光染料FM 4-64(Invitrogen, Cat No.T13320)，用MEM无酚红培基溶解，配制成10μg/ml储备液。

主要仪器和耗材

高内涵Operetta+Harmony分析软件，PerkinElmer公司；细胞操作台； Eppendorf移液枪(量程分别为1mL，200μL，100μL，10μL，2.5μL),96 孔黑板，Corning公司(3603型)。

所用细胞

RBL-2H3细胞，购自中国科学院上海细胞库。

主要操作方法

实验设8个组，包括正常空白对照组、阳性药Compound48/8015μg/ml 组和绿原酸6个浓度组：0.01μM，0.1μM，1μM，5μM，10μM和20μM， 绿原酸溶液未发现对FM4-64荧光强度有干扰作用。所有绿原酸溶液的实验浓 度分别用无酚红培养基对丹红原液进行稀释。每个组均设三个复孔，所有孔 的终体积均为100μL，试验重复至少两次以上。

实验步骤

(1)RBL-2H3细胞用MEM完全培养基(含1％PS双抗+10％FBS+89％ MEM基础培养基)进行培养，取对数生长期的RBL-2H3细胞，按10⁴个/孔接种 于96孔板中，每孔培养体积为100μl，在温度37℃，饱和湿度，5％CO₂培养 箱中培养24小时；

(2)细胞培养24h后，吸弃培养基，用MEM无酚红培养基洗1次；

(3)用MEM无酚红培养基稀释Hoechst33342储备液,终浓度为1μg/m； 在细胞经无酚红MEM培养基清洗后，加入Hoechst33342染细胞核，每孔100 μl，染色时间为30min；

(4)每孔中的液体总体积为100μl，FM4-64的终浓度为2μg/ml； Compound48/40(C48/80)的终浓度为15μg/ml，各成分体积如下表5；

表5 Chl样品加样表(单位：μL)

(5)细胞核染色30min后，吸出Hoechst33342，用MEM无酚红培基洗 三次。加入各组药物，在培养箱中共孵育30min；

(6)打开高内涵Operetta和Harmony分析软件，设置Hoechst33342 和FM 4-64的激发波长和发射波长：

(7)药物与细胞共孵育30min后，将黑板放入Operetta，通过观察细胞 内荧光亮度，确定脱颗粒细胞，计算脱颗粒率，检测类过敏反应发生情况；

(8)统计学处理

采用SPSS11.0软件系统进行统计学分析，用Origin8.5软件做统计图， 组间比较采用ANVOA法进行显著性检验，P<0.05认为有显著性差异。

实验数据分析：为了计算细胞脱颗粒率，采用以下计算方法：类过敏反 应高内涵检测中空白对照组的脱颗粒率标准控制在8±1％水平，由此确定空 白组荧光强度。由于绿原酸为淡绿色透明液体。，未发现对FM 4-64存在明显 干扰,因此直接采用空白对照组荧光强度为标准分析相应浓度下葛根素注射 液样品脱颗粒率，列出典型绿原素样品引起细胞脱颗粒率情况，类过敏原绿 原酸引起的类过敏反应检测结果见图6-7。

综上所述，如图8所示，基于肥大细胞脱颗粒是过敏/类过敏反应过程中 的关键环节，采用体外培养细胞脱颗粒模型，以特异膜染色剂标记细胞脱颗 粒过程中囊泡循环现象，在高内涵系统建立了一种预测注射类药物过敏/类过 敏反应的快速检测方法。本发明的有益效果是：高内涵方法通过荧光成像可 以直接观察到细胞脱颗粒发生，采用细胞脱颗粒率量化了脱颗粒发生程度， 利于预测过敏/类过敏的发生。与传统动物行为观察方法比较，本发明节约了 实验动物使用数量，降低了实验检测成本，且细胞脱颗粒率比动物行为观察 指标客观性强；与传统过敏介质生化测定方法比较，本发明简化了多生化指 标检测程序，尤其是降低了注射剂自身颜色在比色法测定生化介质中的干扰， 利于提高过敏/类过敏反应发生预测准确率，因此具有更高可行性。本发明方 法可应用于中药注射剂、西药注射剂和类过敏原所引起的细胞脱颗粒快速检 测，适用于预测过敏/类过敏反应发生，对指导安全性药物生产和临床应用具 有重要应用价值。

上述参照具体实施方式对该药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法及所 用染料新用途进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定 范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改， 应属本发明的保护范围之内。