高生物量和/或高生长速度重组菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了高生物量和/或高生长速度重组菌及其构建方法与应用。该重组菌的构建方法，包括对受体菌进行A1、A2和A3的改造或对所述受体菌进行所述A1和所述A2的改造，得到生物量和/或生长速度高于所述受体菌的重组菌；所述A1为将所述受体菌的磷酸转移酶G亚基基因敲除；所述A2为将所述受体菌的半乳糖抑制子基因敲除；所述A3为向所述受体菌中导入葡萄糖激酶基因；所述受体菌为大肠杆菌、乳酸杆菌、链球菌或嗜血杆菌。本发明构建的高生物量和/或生长速度快的重组菌和产链孢红素重组菌在生物研究、医学等领域具有较高的应用前景及开发价值。

说明书

技术领域

本发明涉及高生物量和/或高生长速度重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

工程菌株的生长是工业发酵的关键。菌体生长速度慢会延长生产周期，降低效率，提高 成本，不利于菌株的大规模应用。而菌体发酵最终达到的细胞密度也是至关重要的。因此急 需一种生长速度快，可达到的细胞密度大的菌株。

萜类化合物是由异戊二烯为结构单元的化合物。萜类化合物的合成途径分为MVA途径和 MEP途径。MEP途径分为两个阶段：1.生成中间体异戊烯基焦磷酸（Isopentenyl diphosphate  IPP）以及其双键异构体二甲基丙基焦磷酸（Dimethylallyl pyrophosphate DMAPP）阶段， 2.萜类生成及其修饰阶段。基因crtE、crtI和crtB可以进行连续的催化反应，将DMAPP转 化为链孢红素。以链孢红素作为底物，可以生产多种高附加值的产物，如番茄红素和虾青素。 番茄红素是最有力的抗氧化剂之一，可以有效的防治因衰老，免疫力下降引起的各种疾病。 在自然界，虾青素具有最强的天然抗氧化性，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管 疾病等多种作用。获取天然的番茄红素和虾青素工艺复杂，成本高，不适宜大规模生产。而 利用微生物发酵技术进行生产，能有效的降低成本，节约资源，值得深入研究。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供高生物量和/或高生长速度的重组菌的构 建方法及其得到的重组菌。

本发明所提供的重组菌的构建方法，包括对受体菌进行A1、A2和A3的改造或对 所述受体菌进行所述A1和所述A2的改造，得到生物量和/或生长速度高于所述受体菌 的重组菌；

所述A1为将所述受体菌的磷酸转移酶G亚基（phosphotransferase system ptsG  subunit,ptsG）基因敲除；

所述A2为将所述受体菌的半乳糖抑制子（Galactose repressor，GalR）基因敲除；

所述A3为向所述受体菌中导入葡萄糖激酶（glucokinase,Glk）基因；

所述受体菌为大肠杆菌、乳酸杆菌、链球菌或嗜血杆菌。

上述重组菌的构建方法中，所述生物量可以单位发酵液内所含的重组菌的数量来 体现，所述重组菌的数量可以菌落形成单位（cfu）表示。

上述重组菌的构建方法中，所述受体菌可为大肠杆菌BW25113。

上述重组菌的构建方法中，所述磷酸转移酶G亚基基因编码B1或B2的蛋白质：

B1、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

B2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过突变得到的具有磷酸转移酶G亚基 功能的由B1衍生的蛋白质；

所述半乳糖抑制子基因编码C1或C2的蛋白质：

C1、由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

C2、在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过突变得到的具有半乳糖抑制子功能 的由C1衍生的蛋白质；

所述葡萄糖激酶基因编码D1或D2的蛋白质：

D1、由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

D2、在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过突变得到的具有葡萄糖激酶功能的 由D1衍生的蛋白质。

上述重组菌的构建方法中，所述磷酸转移酶G亚基基因为B11）-B13）中的任一 种DNA分子：

B11）其编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或基因组DNA；

B12）在严格条件下与B11）限定的DNA分子杂交且编码所述磷酸转移酶G亚基的 cDNA分子或基因组DNA；

B13）与B11）或B12）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述磷酸转 移酶G亚基的cDNA分子或基因组DNA；

所述半乳糖抑制子基因为C11）-C13）中的任一种DNA分子：

C11）其编码序列是SEQ ID No.4的cDNA分子或基因组DNA；

C12）在严格条件下与C11）限定的DNA分子杂交且编码所述半乳糖抑制子的cDNA 分子或基因组DNA；

C13）与C11）或C12）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述半乳糖 抑制子的cDNA分子或基因组DNA；

所述葡萄糖激酶基因为D11）-D13）中的任一种DNA分子：

D11）其编码序列是SEQ ID No.6的第237-1205位（SEQ ID No.6是 ptsGup-119-glk-kan-ptsGdown片段，起始位置是glk起始密码子的第1位，终止位 置是glk终止密码子的最后1位）cDNA分子或基因组DNA；

D12）在严格条件下与D11）限定的DNA分子杂交且编码所述葡萄糖激酶的cDNA 分子或基因组DNA；

D13）与D11）或D12）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述葡萄糖 激酶的cDNA分子或基因组DNA。

上述突变为取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基。

在本发明的一个实施方式中，所述重组菌是对所述大肠杆菌BW25113进行所述A1、 所述A2和所述A3的改造得到的重组菌，其名称为BW25113ΔptsGΔgalRglk；在本发 明的另一个实施方式中，所述重组菌是对所述大肠杆菌BW25113进行所述A1和所述 A2的改造得到的重组菌，其名称为BW25113ΔptsGΔgalR。

所述BW25113ΔptsGΔgalRglk的构建方法包括下述1）-3），所述BW25113ΔptsG ΔgalR的构建方法包括下述1）和2）：

1）将所述大肠杆菌BW25113的所述磷酸转移酶G亚基（ptsG）基因敲除，保持 所述大肠杆菌BW25113的其它基因不变，得到所述大肠杆菌BW25113的突变体，将其 命名为BW25113ΔptsG；

2）将所述BW25113ΔptsG的所述半乳糖抑制子（GalR）基因敲除，保持所述大肠 杆菌BW25113ΔptsG的其它基因不变，得到所述BW25113ΔptsG的突变体，将其命名 为BW25113ΔptsGΔgalR；

3）向所述BW25113ΔptsGΔgalR中导入所述葡萄糖激酶（Glk）基因，得到所述 BW25113ΔptsGΔgalR的突变体，将其命名为BW25113ΔptsGΔgalRglk。

上述重组菌的构建方法中，所述葡萄糖激酶基因可通过葡萄糖激酶基因表达盒导 入；所述葡萄糖激酶基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No.6的第61-1554位（起始 位置是119启动子的第1位，终止位置是终止子的最后1位）。

上述重组菌的构建方法中，所述葡萄糖激酶基因可通过SEQ ID No.6所示的DNA 分子导入。

由上述任一种重组菌的构建方法构建的重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种构建链孢红素产量高的产链孢红素 重组菌的构建方法及其得到的产链孢红素重组菌。

本发明所提供的产链孢红素重组菌的构建方法，包括向上述任一种重组菌中导入 链孢红素合成相关基因，得到产链孢红素重组菌。

上述产链孢红素重组菌的构建方法中，所述链孢红素合成相关基因由crtE（栊牛 儿栊牛儿基焦磷酸合成酶）基因、crtI（八氢番茄红素脱氢酶）基因、crtB（八氢番 茄红素合成酶）基因和idi（异戊烯焦磷酸异构酶）基因组成；所述crtE基因编码由 SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述crtI基因编码由SEQ ID No.9所 示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述crtB基因编码由SEQ ID No.10所示的氨基酸序 列组成的蛋白质；所述idi基因编码由SEQ ID No.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

上述产链孢红素重组菌的构建方法中，所述crtE基因的编码序列是SEQ ID No.7 的第1993-2922位；所述crtI基因的编码序列是SEQ ID No.7的第2940-4418位；所 述crtB基因的编码序列是SEQ ID No.7的第4436-5368位；所述idi基因的编码序列 是SEQ ID No.7的第5386-5934位。

上述产链孢红素重组菌的构建方法中，所述链孢红素合成相关基因可通过SEQ ID  No.7的第1-6190位的表达盒（由启动子、目的基因及终止子组成）导入。

上述产链孢红素重组菌的构建方法中，所述链孢红素合成相关基因具体可通过 SEQ ID No.7所示的DNA分子（pLY036）导入。

由上述任一种产链孢红素重组菌的构建方法构建的产链孢红素重组菌也属于本发 明的保护范围。

实验证明，对作为受体菌的大肠杆菌BW25113进行所述A1、A2和A3改造得到的 重组菌BW25113ΔptsGΔgalRglk，以及对作为受体菌的大肠杆菌BW25113进行所述A1 和A2改造得到的重组菌BW25113ΔptsGΔgalR，在相同的培养条件下，均培养12小 时，BW25113ΔptsGΔgalRglk的生物量是大肠杆菌BW25113的3.26倍，BW25113ΔptsG ΔgalR的生物量是大肠杆菌BW25113的2.81倍，说明BW25113ΔptsGΔgalRglk和 BW25113ΔptsGΔgalR不但生物量显著高于受体菌，二者的生长速度也显著高于受体 菌。以BW25113ΔptsGΔgalRglk作为受体菌导入含有链孢红素合成相关基因表达盒的 pLY036得到的重组菌BW25113ΔptsGΔgalRglk/pLY036，以BW25113ΔptsGΔgalR作 为受体菌导入含有链孢红素合成相关基因表达盒的pLY036得到的重组菌BW25113Δ ptsGΔgalR/pLY036的链孢红素产量分别是以大肠杆菌BW25113作为受体菌导入含有 链孢红素合成相关基因表达盒的pLY036得到的重组菌BW25113/pLY036的链孢红素产 量1.88倍和1.73倍，说明BW25113ΔptsGΔgalRglk/pLY036和BW25113ΔptsGΔ galR/pLY036的链孢红素产量显著高于BW25113/pLY036。本发明构建的高生物量和/ 或生长速度快的重组菌和产链孢红素重组菌在生物研究、医学等领域具有较高的应用 前景及开发价值。

附图说明

图1为BW25113ΔptsG PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图。泳道M为DNA marker,泳道1 为BW25113ΔptsG，泳道2为野生型BW25113。

图2为BW25113ΔgalR PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图。泳道M为DNA marker。泳道 1为BW25113ΔgalR，泳道2为野生型BW25113。

图3为BW25113ΔptsGΔgalRglk PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图。泳道M为DNA marker。泳道1和2为BW25113ΔptsGΔgalRglk。泳道1的引物为GalR-up200-F、 GalR-down200-R，泳道2的引物为PtsG-up200-F、PtsG-down200-R。泳道3和4为大 肠杆菌BW25113。泳道3的引物为GalR-up200-F、GalR-down200-R，泳道4的引物为 PtsG-up200-F、PtsG-down200-R。

图4为大肠杆菌BW25113、BW25113ΔptsG、BW25113ΔgalR、BW25113ΔptsGΔgalR 和BW25113ΔptsGΔgalRglk的生长曲线。图4中，Wt代表BW25113，ΔptsG代表 BW25113ΔptsG，ΔgalR代表BW25113ΔgalR，ΔptsGΔgalR代表BW25113ΔptsGΔ galR，ΔgalRΔptsG119glk代表BW25113ΔptsGΔgalRglk。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊 说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从 商业途径得到。

下述实施例中，大肠杆菌BW25113（Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa, Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry  L Wanner,and Hirotada Mori1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame, single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology (2006):1-11.）是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原 料低廉。大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重 复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中，磷酸转移酶G亚基基因的编码序列如SEQ ID No.2所示，编码由 SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质磷酸转移酶G亚基；半乳糖抑制子基因 的编码序列如SEQ ID No.4所示，编码由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白 质半乳糖抑制子；葡萄糖激酶基因的编码序列如SEQ ID No.6的第237-1205位，编码 由SEQ ID No.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质葡萄糖激酶；crtE基因编码由SEQ ID  No.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；crtI基因编码由SEQ ID No.9所示的氨基酸序 列组成的蛋白质；crtB基因编码由SEQ ID No.10所示的氨基酸序列组成的蛋白质； idi基因编码由SEQ ID No.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质。crtE基因的编码序列 是SEQ ID No.7的第1993-2922位；crtI基因的编码序列是SEQ ID No.7的第2940-4418 位；crtB基因的编码序列是SEQ ID No.7的第4436-5368位；所述idi基因的编码序 列是SEQ ID No.7的第5386-5934位。

下述实施例中的野生型P1噬菌体（Thomason LC,Costantino N.2007.E.coli  genome manipulation by P1transduction.Current Protocols in Molecular Biology: 1.17.1-8）公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相 关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、重组菌BW25113ΔptsGΔgalR和BW25113ΔptsGΔgalRglk的构建

重组菌BW25113ΔptsGΔgalRglk是对大肠杆菌BW25113进行A1、A2和A3的改造 得到的重组菌，重组菌BW25113ΔptsGΔgalR是对大肠杆菌BW25113进行A1和A2的 改造得到的重组菌。

所述A1为将大肠杆菌BW25113的磷酸转移酶G亚基（ptsG）基因敲除；

所述A2为将大肠杆菌BW25113的半乳糖抑制子（GalR）基因敲除；

所述A3为向大肠杆菌BW25113中导入葡萄糖激酶（Glk）基因。

所述BW25113ΔptsGΔgalRglk的构建方法包括下述1）-3），所述BW25113ΔptsG ΔgalR的构建方法包括下述1）和2）：

1）将所述大肠杆菌BW25113的所述磷酸转移酶G亚基（ptsG）基因敲除（缺失）， 保持所述大肠杆菌BW25113的其它基因不变，得到所述大肠杆菌BW25113的突变体， 将其命名为BW25113ΔptsG；

2）将所述BW25113ΔptsG的所述半乳糖抑制子（GalR）基因敲除（缺失），保持 所述大肠杆菌BW25113ΔptsG的其它基因不变，得到所述BW25113ΔptsG的突变体， 将其命名为BW25113ΔptsGΔgalR；

3）向所述BW25113ΔptsGΔgalR中导入所述葡萄糖激酶（Glk）基因，得到所述 BW25113ΔptsGΔgalR的突变体，将其命名为BW25113ΔptsGΔgalRglk。具体方法如 下：

1）中的BW25113ΔptsG是keio库中编号为JW1087的菌株，BW25113ΔptsG是将 大肠杆菌BW25113的磷酸转移酶G亚基（ptsG）替换为两端带有FRT位点的卡那霉素 抗性基因（约1248bp）从而将大肠杆菌BW25113的ptsG基因敲除，保持所述大肠杆 菌BW25113的其它基因不变，得到的大肠杆菌BW25113的突变体。ptsG基因编码SEQ ID No.1所示的蛋白质，ptsG基因的编码序列如SEQ ID No.2所示。BW25113ΔptsG的基 因型为ΔptsG::Kan。引物对PtsG-up200-F：CATATGTTTTGTCAAAATGTGCAAC和 PtsG-down200-R：CCGCTACCAGGTGACGAAAAACTTC从BW25113ΔptsG的基因组DNA中扩 增得到一个约1648bp的片段（图1），从大肠杆菌BW25113的基因组DNA中扩增得到 一个约1834bp的片段。其中，PtsG-up200-F和PtsG-down200-R引物结合位置分别是 大肠杆菌BW25113的ptsG基因的上游200bp和下游200bp附近区域。测序分析结果表 明BW25113ΔptsG的基因组上没有ptsG基因，BW25113ΔptsG是将大肠杆菌BW25113 的所述磷酸转移酶G亚基（ptsG）基因敲除，保持所述大肠杆菌BW25113的其它基因 不变，得到的大肠杆菌BW25113的突变体。

2）的BW25113ΔptsGΔgalR具体构建方法如下：BW25113ΔptsGΔgalR的构建： 以1）的BW25113ΔgalR为供体菌，利用P1噬菌体转导技术将BW25113ΔptsG△kan 的半乳糖抑制子基因（galR）替换为卡那霉素抗性基因得到BW25113ΔptsGΔgalR。 具体如下：

（a）利用表达Flp重组酶的质粒pCP20（深圳市卓泰丰科技有限公司，货号： pCP20921A）消除BW25113ΔptsG的卡那霉素抗性，具体步骤如下：采用化学转化法将 质粒pCP20转入BW25113ΔptsG，30℃培养过夜，使菌体基因组上的卡那霉素抗性消 除；挑选单克隆菌株，于无抗性LB中42℃培养6小时。pCP20为温敏型质粒，在无抗 性LB中42℃培养6小时可将质粒消除，得到卡那霉素抗性消除的菌株，命名为BW25113 ΔptsGΔkan。

（b）供体P1的制备：将BW25113ΔgalR接种于含10mmol/L MgCl₂、5mmol/L CaCl₂和0.1%葡萄糖的LB培养基中，培养1h，加入野生型P1噬菌体，培养1-3h。加几滴 氯仿再摇几分钟，离心取上清即得到噬菌体P1virΔgalR。

（c）利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除株BW25113ΔptsGΔgalR,具体步 骤如下：过夜培养BW25113ΔptsGΔkan（受体菌），1.5ml菌液10000g离心2分钟后， 用0.75ml的P1盐溶液（溶剂为水，溶质为10mM CaCl₂和5mM MgSO₄)重悬BW25113 ΔptsGΔkan细胞，将100μl噬菌体P1virΔgalR与100μl BW25113ΔptsGΔkan 细胞悬浮液混和，孵育30min，用1ml LB和200μl柠檬酸钠，37℃继续培养1h， 离心收集，用100μl LB重悬后，涂布含卡那霉素的LB平板（卡那霉素的浓度为 50μg/ml）上，筛选得到的阳性克隆（能在该含卡那霉素的平板上生长的克隆）即为 BW25113ΔptsGΔgalR，其基因型为ΔptsGΔgalR::Kan。

其中，BW25113ΔgalR是Keio库中编号为JW2805的菌株，BW25113ΔgalR是将 大肠杆菌BW25113的半乳糖抑制子（GalR）基因替换为两端带有FRT位点的卡那霉素 抗性基因（约1300bp）从而将大肠杆菌BW25113的半乳糖抑制子（GalR）基因敲除， 保持所述大肠杆菌BW25113的其它基因不变，得到的大肠杆菌BW25113的突变体。GalR 基因编码SEQ ID No.3所示的蛋白质，GalR基因的编码序列如SEQ ID No.4所示。

BW25113ΔgalR的基因型为ΔgalR::Kan。引物对GalR-up200-F： CAACCTGAAGCCAAACGCCACCAGC，和GalR-down200-F：ACCCGCGCCTTGCCGGAAGTGAAGG，从 BW25113ΔgalR的基因组DNA中扩增得到一个约1648bp的片段（图2），从大肠杆菌 BW25113的基因组DNA中扩增得到一个约1432bp的片段。其中，GalR-up200-F和 GalR-down200-F引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的GalR基因的上游200bp和 下游200bp附近区域。测序分析结果表明BW25113ΔgalR的基因组上没有GalR基因， BW25113ΔgalR是将大肠杆菌BW25113的半乳糖抑制子（GalR）基因敲除，保持所述 大肠杆菌BW25113的其它基因不变，得到的大肠杆菌BW25113的突变体。

向2）的BW25113ΔptsGΔgalR中导入葡萄糖激酶（Glk）基因，得到BW25113Δ ptsGΔgalR的突变体BW25113ΔptsGΔgalRglk，具体方法如下：

（1）宿主菌的制备：

将pKD46质粒（购自Clontech公司）通过氯化钙转化法转化至BW25113ΔptsGΔ galR，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌BW25113ΔptsGΔgalR/pKD46。重组大肠 杆菌BW25113ΔptsGΔgalR/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白， 宿主菌就具有了同源重组的能力。

（2）ptsGup-119-glk-kan-ptsGdown片段的制备：

ptsGup-119-glk-kan-ptsGdown片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6，由3075个核 苷酸组成，其中含有（a）葡萄糖激酶基因表达盒，其核苷酸序列是SEQ ID No.6的第 61-1554位，该葡萄糖激酶基因表达盒由（a1）大肠杆菌119启动子（SEQ ID No.6 的第61-218位）、（a2）大肠杆菌葡萄糖激酶（Glk）基因（SEQ ID No.6的第237-1205 位）和（a3）TrrnB终止子（SEQ ID No.6的第1396-1554位）连接而成；（b）带LOXP 侧翼的卡那霉素抗性基因（LOXP-kan-LOXP)，其核苷酸序列是SEQ ID No.6的第 1564-2976位；（c）ptsG基因上游同源臂ptsGup，其核苷酸序列是SEQ ID No.6的第 1-60位；（d）ptsG基因下游同源臂ptsGdown，其核苷酸序列是SEQ ID No.6的第 3016-3075位。

（3）同源重组：

将SEQ ID No.6所示的ptsGup-119-glk-kan-ptsGdown片段电转入重组大肠杆菌 BW25113ΔptsGΔgalR/pKD46的感受态细胞，利用卡那霉素平板（卡那霉素的浓度为 50μg/ml）筛选到阳性转化体—将ptsGup-119-glk-kan-ptsGdown片段转入重组大肠杆 菌BW25113ΔptsGΔgalR/pKD46得到的重组大肠杆菌，命名为BW25113ΔptsGΔ galRglk。BW25113ΔptsGΔgalRglk的基因型为ΔptsGΔgalRglk::Kan。用引物 GalR-up200-F：CAACCTGAAGCCAAACGCCACCAGC，GalR-down200-R： ACCCGCGCCTTGCCGGAAGTGAAGG对BW25113ΔptsGΔgalRglk和大肠杆菌BW25113进行 PCR验证，从BW25113ΔptsGΔgalRglk的基因组DNA中扩增得到一个约1648bp和 1432bp的片段。用引物PtsG-up200-F：CATATGTTTTGTCAAAATGTGCAAC和 PtsG-down200-R：CCGCTACCAGGTGACGAAAAACTTC对BW25113ΔptsGΔgalRglk和大肠杆 菌BW25113进行PCR验证，从BW25113ΔptsGΔgalRglk和野生型的基因组DNA中分别 扩增得到约1892bp和1834bp的片段（图3）。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌 BW25113的ptsG基因的上游和下游区域。测序分析结果表明BW25113ΔptsGΔgalRglk 的基因组上含有SEQ ID No.6所示的ptsGup-119-glk-kan-ptsGdown片段。

实施例2、重组菌BW25113ΔptsGΔgalR和BW25113ΔptsGΔgalRglk的生物量测 定

以微型生物反应器测定菌株生长曲线，细胞的生物量（生物量）在如下测试培养 基中进行：用ZYM-5052进行诱导转化含有卡那霉素抗性的自诱导培养基，自诱导培养 基ZYM-5052配方：100ml A+2ml B+2ml C+200μl D+100μl E，其中A、B、C、 D和E的溶质及浓度如下（以下均为质量百分比浓度）：

A.ZY：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉；

B.50×M：1.25M Na₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C.50×5052：25%甘油，2.5%葡萄糖，10%乳糖；

D.1M MgSO₄；

E.1000×微量元素：50mM FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，CoCl₂、 NiCl₂、Na₂Mo₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM。

测试培养基：取4g葡萄糖，用蒸馏水定容至100ml，调pH至7.0，在121℃灭菌 20分钟。

微型生物反应器（Biolector，m2p-labs公司）是一种可以实时监测菌株生长情 况的高频震荡仪。

测试菌株：大肠杆菌BW25113、BW25113ΔptsG、BW25113ΔgalR、BW25113ΔptsG ΔgalR、BW25113ΔptsGΔgalRglk。

实验重复三次，每次重复每种测试菌株一块48孔梅花板。将各种测试菌株分别接 入测试培养基中，在37℃培养12小时，离心菌液，取菌体，用无菌蒸馏水洗净菌体。 在48孔梅花板中，每个样孔中加入1ml测试培养基，每个孔中，加入0.01ml菌悬液 （用无菌蒸馏水重悬菌体得到的菌体含量为8×10⁸cfu/ml的液体）。转速800rpm,在 37℃培养12小时。每2小时对两个孔的样品测定培养液中的菌体含量。

实验结果表明，BW25113ΔptsGΔgalRglk的生长最快，且最终达到的生物量最高， 为1.40×10⁸cfu/ml。BW25113ΔptsGΔgalR的生长也具有明显的优势,生长较快且最 终到达较高的生物量1.21×10⁸cfu/ml。BW25113ΔgalR的生长速度略低于BW25113Δ ptsGΔgalR，生物量达到了1.09×10⁸cfu/ml。野生型（即大肠杆菌BW25113）与BW25113 ΔptsG的生长速度与生物量都较低，其生物量分别为0.43×10⁸cfu/ml和0.32× 10⁸cfu/ml。在相同的培养条件下，均培养12小时，BW25113ΔptsGΔgalRglk和 BW25113ΔptsGΔgalR生长速度均明显快于BW25113，BW25113ΔptsGΔgalRglk的生 物量是大肠杆菌BW25113的3.26倍，BW25113ΔptsGΔgalR的生物量是大肠杆菌 BW25113的2.81倍（图4）。说明BW25113ΔptsGΔgalRglk和BW25113ΔptsGΔgalR 不但生物量显著高于受体菌，二者的生长速度也显著快于受体菌。

实施例3、产链孢红素重组菌的构建及其性能

1、产链孢红素重组菌的构建

分别向大肠杆菌BW25113和实施例1构建的BW25113ΔptsG、BW25113ΔgalR、 BW25113ΔptsGΔgalR和BW25113ΔptsGΔgalRglk这五个受体菌中导入pLY036，得到 产链孢红素重组菌。其中采用的质粒转化方法是用化学转化法。将向大肠杆菌BW25113 中导入pLY036得到的产链孢红素重组菌命名为BW25113/pLY036，将向实施例1构建 的BW25113ΔptsG中导入pLY036得到的产链孢红素重组菌命名为BW25113Δ ptsG/pLY036，将向实施例1构建的BW25113ΔgalR中导入pLY036得到的产链孢红素 重组菌命名为BW25113ΔgalR/pLY036，将向实施例1构建的BW25113ΔptsGΔgalR中 导入pLY036得到的产链孢红素重组菌命名为BW25113ΔptsGΔgalR/pLY036，将向实 施例1构建的BW25113ΔptsGΔgalRglk中导入pLY036得到的产链孢红素重组菌命名 为BW25113ΔptsGΔgalRglk/pLY036。BW25113/pLY036、BW25113ΔptsG/pLY036、 BW25113ΔgalR/pLY036、BW25113ΔptsGΔgalR/pLY036和BW25113ΔptsGΔ galRglk/pLY036用引物对CrtE进行PCR验证，均能扩增得到序列是SEQ ID No.7的 第1993-2922位所示的链孢红素合成相关基因的DNA片段。

其中，pLY036为乳糖诱导型表达载体，pLY036的核苷酸序列是SEQ ID No.7，pLY036 含有链孢红素合成相关基因表达盒，链孢红素合成相关基因表达盒的核苷酸序列是 SEQ ID No.7的第1993-5934位，链孢红素合成相关基因由栊牛儿栊牛儿基焦磷酸合 成酶crtE基因、八氢番茄红素脱氢酶crtI基因、八氢番茄红素合成酶crtB基因和异 戊烯焦磷酸异构酶idi基因组成；所述crtE基因编码由SEQ ID No.8所示的氨基酸序 列组成的蛋白质；所述crtI基因编码由SEQ ID No.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 所述crtB基因编码由SEQ ID No.10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述idi基因 编码由SEQ ID No.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质。SEQ ID No.7的第1911-1940 位为Tac启动子，SEQ ID No.7的第6025-6190位为TrrnB终止子，SEQ ID No.7的第 1993-2922位是crtE基因的编码序列，SEQ ID No.7的第2940-4418位是crtI基因的 编码序列，SEQ ID No.7的第4436-5368位是crtB基因的编码序列，SEQ ID No.7的 第5386-5934位是idi基因的编码序列。

以BW25113/pLY036、BW25113ΔptsG/pLY036、BW25113ΔgalR/pLY036、BW25113 ΔptsGΔgalR/pLY036和BW25113ΔptsGΔgalRglk/pLY036这5株菌中的任一菌株单 独为工程菌，均同时进行如下实验：将工程菌划线到含有质量百分比浓度为1.5％的 琼脂和含50μg/ml的氯霉素LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上所长的单克隆，接 种到含50μg/ml的氯霉素的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转速250转/分钟； 将过夜培养物以体积百分比为1％的接种量接种至装有50mL自诱导培养基ZYM-5052 （含50μg/ml氯霉素）的容量为250ml的三角瓶中，在37℃以220转/分钟的转速振 荡，进行诱导培养12h，6000g、4℃、10min离心收集菌体，用冰浴的质量百分浓度为 0.85%的无菌氯化钠水溶液洗涤2次，以相同的离心条件收集菌体，得到工程菌诱导细 胞。将各种工程菌诱导细胞和大肠杆菌BW25113分别用冰浴的质量百分浓度为0.85% 的无菌氯化钠水溶液均重悬至菌体含量为8×10⁸cfu/ml的菌液，取出200μl菌液，加 入250ml三角瓶中，以含有4%葡萄糖和1×PBS的ZYM-5052在37℃进行葡萄糖转化6 小时，取菌液，12000rpm，离心1min，弃去上清液，收集菌体，用冰浴的质量百分浓 度为0.85%的无菌氯化钠水溶液洗涤并重悬菌体，均取1×10⁸cfu菌体加入1ml丙酮进 行萃取。4℃放置3小时，离心取上清液，得到待测样品，进行370-500nm的波长扫 描。实验重复三次，每次每种菌在3个250ml三角瓶中进行上述葡萄糖转化。

其中，含有4%葡萄糖和1×PBS的ZYM-5052按照如下方法配制：向实施例2中自 诱导培养基ZYM-5052中加入葡萄糖和10×PBS，至葡萄糖的含量为4%（质量百分含量）， 将10×PBS稀释10倍，得到含有4%葡萄糖和1×PBS的ZYM-5052。

其中，1L10×PBS（pH7.4）的配制方法为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：2.7g，磷酸氢 二钠(Na₂HPO₄)：14.2g，氯化钠(NaCl)：80g，氯化钾(KCl)：2g，加蒸馏水定容至1L。

2、产链孢红素重组菌的链孢红素产量的测定

以链孢红素（深圳振强生物技术有限公司，产品目录号502-64-7）为标准品采用 标准曲线法（外标法）进行定量分析待测样品中链孢红素的含量。波长扫描后标准 品在442nm处出现最高峰，BW25113/pLY036、BW25113ΔptsG/pLY036、BW25113Δ galR/pLY036、BW25113ΔptsGΔgalR/pLY036和BW25113ΔptsGΔgalRglk/pLY036这 5株菌的待测样品在442nm处均出现最高峰，大肠杆菌BW25113在442nm处无峰(图5)。

定量分析大肠杆菌BW25113、BW25113/pLY036、BW25113ΔptsG/pLY036、BW25113 ΔgalR/pLY036、BW25113ΔptsGΔgalR/pLY036和BW25113ΔptsGΔgalRglk/pLY036 的链孢红素产量，如表1所示，表明BW25113ΔptsGΔgalRglk/pLY036和BW25113Δ ptsGΔgalR/pLY036的链孢红素产量显著高于BW25113/pLY036，菌株BW25113ΔptsG ΔgalRglk/pLY036的产物量最高，是BW25113/pLY036的1.88倍，BW25113ΔptsGΔ galR/pLY036也较高，是BW25113/pLY036的1.73倍。

表1各个菌株的链孢红素产量

菌株 链孢红素产量（mg链孢红素/10⁸cfu） BW25113 0.27±0.01 BW25113/pLY036 3.24±0.02 BW25113ΔptsG/pLY036 2.84±0.02 BW25113ΔgalR/pLY036 4.25±0.03 BW25113ΔptsGΔgalR/pLY036 5.59±0.03 BW25113ΔptsGΔgalRglk/pLY036 6.08±0.04