一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸含量的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸含量的方法及其应用。本发明提供的一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸含量性状的方法，包括如下步骤：检测待测大豆基因组中基于Map-6017？SNP位点的基因型，如果为TT纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有高亚麻酸含量性状的大豆籽粒，如果为CC纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有低亚麻酸含量性状的大豆籽粒；所述高亚麻酸含量指的是亚麻酸含量为8.5％以上；所述低亚麻酸含量指的是亚麻酸含量小于8.5％。实验证明，本发明所提供的一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸含量性状的方法可以用于鉴定或辅助鉴定待测大豆品种中亚麻酸含量的高低。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸含量 的方法及其应用。

背景技术

大豆(Glycine max)是世界上重要的油料粮食作物，其种子油是人类与动物营养 以及食品加工业植物食用油的重要来源。大豆油用量占全世界食用油的31％(Kim and  Krishnan，2004)。大豆种子油主要是由甘油和脂肪酸组成的，其中脂肪酸占种子油的 90％以上，主要包括棕榈酸(16:0)与硬脂酸(18:0)两种饱和脂肪酸和油酸(18:1)、 亚油酸(18:2)与亚麻酸(18:3)等三种不饱和脂肪酸。脂肪酸的组成及其种类配比决 定了种子油的品质。亚麻酸是人体必需脂肪酸，具有降低血清胆固醇和甘油三酯及软 化血管等重要生理功能，被营养学家称之为“安全脂肪酸”。世界卫生组织和联合国 粮农组织指出：“鉴于多不饱和脂肪酸在人体发育和健康中具有不可或缺的作用，建 议所有婴幼儿配方食品中都应含有多不饱和脂肪酸”。亚麻酸具有多种生理功能，是 深海鱼油中富含的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的重要代谢前体， 尤其对生活在内陆地区、很少食用深海产品人们的健康极为重要。美、英、法、德、 日等国立法规定婴幼儿食品中必须添加亚麻酸及其代谢物。为了解决我国人民摄取亚 麻酸不足的问题，需要提高大豆亚麻酸含量，改善脂肪酸配比以增加大豆的营养价值。

由于亚麻酸含量是受多基因控制的数量性状且易受环境影响，利用传统表型鉴定 和育种方法培育高亚麻酸含量的品种不但需要花费很长的时间，而且难于成功，已经 不能够满足当前优质大豆育种的发展。随着分子标记的开发和使用，分子标记辅助选 择(Molecular marker-assisted selection，MAS)成为可以节约人力、物力和加速育 种进程的有效方法(Cregan et al.1999)。分子标记辅助选择的最大优点为在不需要 评估表型特征的情况下，通过确认是否带有目标基因而鉴定出高亚麻酸含量的植株。

大豆种质资源中蕴藏着丰富的基因，从育种的物质基础—种质资源中发掘所需要 的优异资源及基因可有效促进大豆品种改良。作为栽培大豆起源地，我国的大豆种质 资源在世界上最为丰富，现保存在国家种质资源库的就有3万余份，在亚麻酸含量上 变异广泛(刘兴媛等，作物品种资源，1998)。为了有效的研究和利用我国大豆资源， 邱丽娟等(作物学报，2009)构建了可代表我国大豆种质资源多样性的核心种质，为 深入发掘种质资源中蕴藏的优异基因、有效拓宽大豆遗传基础奠定了材料基础。

关联分析，又称关联作图(Association Mapping)，是一种以LD(Linkage  Disequlibrium)分析为基础，直接对基因型变异和表型变异进行分析，从而把那些与 性状有关联的基因鉴定出来(Khush et al.2001)的基因定位方法，已成为发掘与表 型相关分子标记的强有力工具。新型分子标记—SNP因为具有在基因组中数量多、分 布广泛、可高通量检测等优点而在近年广泛用于鉴定多基因控制的复杂性状。随着SNP 标记数量的不断增多，高通量的SNP分型平台相继推出，包括Goladen Gate和 BeadArray(Illumina)，GenomeLab SNP stream(Beckman)和MegAllele(Affymetrix) 等，其中Illumina公司的BeadArray芯片鉴定技术具有高效、高通量、成本低、准确 性好等优点，适合位点数从几十到几千的中等通量基因分型研究，实验成功率>99％， 是理想的中高通量基因分型检测的解决方案，目前已被广泛用于人类、拟南芥、水稻 等物种的SNP分型。

发明内容

本发明的目的是鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸含量性状，和/或，筛选或辅助 筛选具有不同亚麻酸含量的大豆籽粒。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸 含量性状的方法，可包括如下步骤：检测待测大豆基因组中基于Map-6017SNP位点 的基因型，如果为TT纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有高亚麻酸含量性状的大豆 籽粒，如果为CC纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有低亚麻酸含量性状的大豆籽粒。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种筛选或辅助筛选具有不同亚麻酸含 量的大豆籽粒的方法，可包括如下步骤：检测待测大豆基因组中基于Map-6017SNP 位点的基因型，如果为TT纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有高亚麻酸含量性状的 大豆籽粒，如果为CC纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有低亚麻酸含量性状的大豆 籽粒。

上述方法中，所述Map-6017位点的所在基因为大豆基因组第2条染色体的 Glyma.02g138100基因；所述Glyma.02g138100基因的核苷酸序列为序列表的序列1； 所述Map-6017位点为序列表中序列1的第3230位。

上述方法中，所述高亚麻酸含量指的是亚麻酸含量可为8.5％以上；所述低亚麻 酸含量指的是亚麻酸含量小于8.5％。

上述方法中，所述检测待测大豆基因组中基于Map-6017SNP位点的基因型的方 法可包括：(1)提取大豆基因组DNA。(2)加入Map-6017探针组，进行等位基因特异 性延伸和连接酶连接，可以得到一段包含Map-6017SNP位点和地址序列的片段。(3) 将得到的片段进行PCR扩增(扩增体系中具有Cy3标记的dATP、Cy5标记的dGTP、dCTP 和dTTP)后与芯片(美国Illumina公司产品，芯片上具有微珠，微珠表面连接有所 述地址序列的互补序列)进行杂交。(4)芯片扫描，利用软件根据两种荧光颜色判 读并输出分型结果。从而确定待测大豆品种基于Map-6017SNP位点基因型为TT纯合 型或CC纯合型。

本发明还提供了一种产品。

本发明所提供的产品，可为检测大豆基因组中基于Map-6017SNP位点的多态性 或基因型的物质；所述产品的功能为如下(a)、(b)或(c)：

(a)鉴定或辅助鉴定大豆籽粒的亚麻酸含量性状；

(b)鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸含量性状相关的单核苷酸多态性；

(c)筛选或辅助筛选具有不同亚麻酸含量的大豆籽粒。

上述产品中，所述大豆基因组中基于Map-6017SNP位点的基因型可为TT纯合型 或CC纯合型。

上述产品中，所述Map-6017位点的所在基因为大豆基因组第2条染色体的 Glyma.02g138100基因；所述Glyma.02g138100基因的核苷酸序列为序列表的序列1； 所述Map-6017位点为序列表中序列1的第3230位。

上述产品中，所述检测大豆基因组中基于Map-6017SNP位点的多态性或基因型 的物质可包括Map-6017SNP探针组。

上述产品中，所述亚麻酸含量为高亚麻酸含量或低亚麻酸含量；所述高亚麻酸 含量指的是亚麻酸含量可为8.5％以上；所述低亚麻酸含量指的是亚麻酸含量小于 8.5％。

检测大豆基因组中基于Map-6017SNP位点的多态性或基因型的物质在下述(1)- (6)中的任一应用也属于本发明的保护范围：

(1)鉴定或辅助鉴定大豆籽粒的亚麻酸含量性状；

(2)制备鉴定或辅助鉴定大豆籽粒的亚麻酸含量性状的产品；

(3)鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸含量性状相关的单核苷酸多态性；

(4)制备鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸含量性状相关的单核苷酸多态性的产 品；

(5)筛选或辅助筛选具有不同亚麻酸含量的大豆籽粒；

(6)制备筛选或辅助筛选具有不同亚麻酸含量的大豆籽粒的产品。

上述应用中，所述(1)和/或所述(2)中，所述大豆籽粒的亚麻酸含量性状可 为高亚麻酸含量性状或低亚麻酸含量性状。所述高亚麻酸含量指的是亚麻酸含量可 为8.5％以上；所述低亚麻酸含量指的是亚麻酸含量小于8.5％。

上述应用中，所述(3)和/或所述(4)中，所述大豆籽粒的亚麻酸含量性状可 为高亚麻酸含量性状或低亚麻酸含量性状。所述高亚麻酸含量指的是亚麻酸含量可 为8.5％以上；所述低亚麻酸含量指的是亚麻酸含量小于8.5％。

上述应用中，所述(5)和/或所述(6)中，所述具有不同亚麻酸含量的大豆 籽粒可为具有高亚麻酸含量性状的大豆籽粒或具有低亚麻酸含量性状的大豆籽粒。 所述高亚麻酸含量指的是亚麻酸含量可为8.5％以上；所述低亚麻酸含量指的是亚麻 酸含量小于8.5％。

上述应用中，所述大豆基因组中基于Map-6017SNP位点的基因型可为TT纯合型 或CC纯合型。

上述应用中，所述Map-6017位点的所在基因为大豆基因组第2条染色体的 Glyma.02g138100基因；所述Glyma.02g138100基因的核苷酸序列为序列表的序列1； 所述Map-6017位点为序列表中序列1的第3230位。

上述应用中，所述用于检测大豆基因组中基于Map-6017SNP位点的多态性或基 因型的物质可包括Map-6017SNP探针组。

上述任一所述Map-6017SNP探针组可由探针1、探针2和探针3组成：

所述探针1为单链DNA分子，探针1的序列如序列表中序列2中的核苷酸所示。

所述探针2为单链DNA分子，探针2的序列如序列表中序列3中的核苷酸所示。

所述探针3为单链DNA分子，探针3的序列如序列表中序列4中的核苷酸所示。

本发明中，所述高亚麻酸含量指的是亚麻酸含量可为8.5％以上；所述低亚麻酸 含量指的是亚麻酸含量小于8.5％。

实验证明，本发明所提供的一种鉴定或辅助鉴定大豆籽粒亚麻酸含量性状的方 法可以用于鉴定或辅助鉴定待测大豆品种中大豆籽粒亚麻酸含量的高低。所述高亚 麻酸含量指的是亚麻酸含量为8.5％以上；所述低亚麻酸含量指的是亚麻酸含量小于 8.5％。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了 阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述的大豆地方品种和大豆选育品种记载在如下文献中：王国勋. 中国大豆品种资源目录.北京：中国农业出版社，1982；常汝镇，孙建英.中国大豆 品种资源目录：续编一.北京：农业出版社，1991；常汝镇，孙建英，邱丽娟，陈 一舞.中国大豆品种资源目录：续编二.北京：中国农业出版社，1996。

下述实施例中，所述高亚麻酸含量指的是亚麻酸含量可为8.5％以上；所述低亚 麻酸含量指的是亚麻酸含量小于8.5％。

实施例1、Map-6017SNP位点是与大豆籽粒亚麻酸含量相关的单核苷酸多态性

一、Map-6017单核苷酸多态性位点基本信息

Map-6017单核苷酸多态性位点位于Glyma.02G138100基因核苷酸序列(序列1) 第3230位，其基本信息见表1。

表1、Map-6017SNP单核苷酸多态性位点基本信息

二、Map-6017SNP基因型与大豆籽粒亚麻酸含量的关联分析

1、Map-6017SNP探针组的制备

根据自主开发的全基因组SNP数据集，筛选Map-6017SNP位点并人工合成 Map-6017SNP探针组：

探针1:ACTTCGTCAGTAACGGACGGATTCTTGGCGGCAGCCCA(序列表中的序列2)；

探针2:GAGTCGAGGTCATATCGTGGATTCTTGGCGGCAGCCCG(序列表中的序列3)；

探针3:AAATGTATTCTTGAGCCTTTCTTTGGACCAGAGCACGGGTAGTTTGTCTGCCTATAGTGAGTC (序列表中的序列4)。

芯片的微珠上连接有地址序列的互补序列。

2、基于Map-6017SNP位点基因分型方法的建立

利用Illumina的SNP检测平台对表2中所示的59个大豆地方品种和表3中所示 的27个大豆选育品种基于Map-6017SNP位点的基因型进行检测。

检测对象为基因组DNA。以基因组DNA为模板，加入步骤1制备的探针1、探针2 和探针3，进行等位基因特异性延伸和连接酶连接，可以得到一段包含Map-6017SNP 位点和地址序列的片段。将得到的片段进行PCR扩增(扩增体系中具有Cy3标记的 dATP、Cy5标记的dGTP、dCTP和dTTP)后与芯片(美国Illumina公司产品，芯片上 具有微珠，微珠表面连接有所述地址序列的互补序列)进行杂交。然后进行芯片扫描， 利用软件根据两种荧光颜色判读并输出分型结果。确定待测大豆品种基于Map-6017 SNP位点基因型。

结果表明，待测大豆品种基于Map-6017SNP位点基因型为CC纯合型或TT纯合 型。

3、Map-6017SNP基因型与大豆籽粒亚麻酸含量的关联分析

(1)检测大豆品种中大豆籽粒的亚麻酸含量

于2010、2011和2012年分别将表2中的大豆地方品种和表3中的大豆选育品种 在中国农业科学院作物科学研究所海南三亚基地种植。在田间采用完全随机区组试验 设计方案，重复三次。田间种植行宽0.4米，行长1.5米，株间距0.1米。种子收获 后，将同一年份、同一品种的三次重复种子混合，检测大豆籽粒亚麻酸的含量，然后 取同一品种三年检测结果的平均值，得到该品种的亚麻酸含量，结果如表2和表3所 示。检测亚麻酸含量利用HP6890气相色谱仪(GC)(Agilent Technologies,Palo Alto, CA,USA)进行，具体检测方法参考Yang et al.Theor Appl Genet(2010)120:665–678。

(2)按照步骤2建立的基于Map-6017SNP位点进行基因分型方法，检测表2和 表3中的大豆品种基于Map-6017SNP位点的基因型，结果表2和表3所示。表2为 59个大豆地方品种基于Map-6017SNP位点的基因型，表3为27个大豆选育品种基于 Map-6017SNP位点的基因型。

表2. 59个大豆地方品种的大豆籽粒基于Map-6017SNP位点的基因型

统一编号 品种名称 基于Map-6017SNP位点的基因型 亚麻酸含量(％) ZDD13233 冬黄豆—1 TT 9.2 ZDD03540 博爱红皮皂角籽 TT 9.3 ZDD07993 通县黄豆 TT 9.4 ZDD09566 黑豆 TT 9.4 ZDD14505 宜章六月黄 TT 9.5 ZDD05494 洪湖六月爆 TT 9.5 ZDD07580 白城秣食豆 TT 9.5 ZDD02096 天鹅蛋 TT 9.5 ZDD06375 大青仁 TT 9.6 ZDD14782 长沙泥豆 TT 9.6 ZDD08510 大黑豆 TT 9.7 ZDD06438 沙县乌豆 TT 9.7 ZDD14783 矮生泥豆① TT 9.8 ZDD12453 渠县八月黄 TT 9.9 ZDD16859 崖县黄豆 TT 9.9 ZDD14252 丰城早乌豆 TT 10.0 ZDD08728 白露豆 TT 10.0 ZDD06363 大粒黄 TT 10.0 ZDD11323 丹徒小乌甲 TT 10.1 ZDD07610 金山茶秣食豆 TT 10.1 ZDD08986 小白豆＜2＞ TT 10.1 ZDD03237 浙川鸡窝黄 TT 10.2 ZDD06377 厦门腾子豆 TT 10.5 ZDD09832 青豆 TT 10.5 ZDD20676 六月黄 TT 10.6 ZDD04620 泰兴牛毛黄乙 TT 10.6 ZDD08251 大屯小黑豆 TT 10.6 ZDD03651 黑豆 TT 10.9 ZDD03191 中牟铁角二糙 TT 11.2

ZDD00698 茶色豆 CC 7.4 ZDD11014 绿滚豆 CC 7.5 ZDD10812 酱黄豆 CC 7.6 ZDD15624 皂角豆 CC 7.6 ZDD00326 方正秣食豆 CC 7.6 ZDD18529 猫眼豆 CC 7.6 ZDD01074 小白脐 CC 7.7 ZDD20340 绿肉黑皮豆 CC 7.8 ZDD00603 长春满仓金 CC 7.8 ZDD01612 兔儿眼 CC 7.9 ZDD01489 玉石豆 CC 7.9 ZDD04092 滨海大黄壳子甲 CC 7.9 ZDD08564 小圆黄豆 CC 8.0 ZDD00383 金元1号 CC 8.1 ZDD06358 东山白马豆 CC 8.1 ZDD02159 大黑豆 CC 8.1 ZDD09773 牛眼睛 CC 8.1 ZDD00294 青豆 CC 8.1 ZDD17989 黄大粒 CC 8.1 ZDD00638 薄地高 CC 8.1 ZDD07370 怀德白花大粒 CC 8.1 ZDD00078 满仓金 CC 8.1 ZDD05465 崇明白毛八月白 CC 8.2 ZDD17233 乌山仁峰黄豆 CC 8.2 ZDD14092 金蓬豆 CC 8.2 ZDD11159 花绿黄豆 CC 8.2 ZDD18771 青豆 CC 8.2 ZDD11703 曙光黄豆 CC 8.2 ZDD04572 吴江五月牛毛黄 CC 8.2 ZDD06856 黑河小黄豆 CC 8.2

表3. 27个大豆选育品种基于Map-6017SNP位点的基因型

统一编号 品种名称 基于Map-6017SNP位点的基因型 亚麻酸含量(％) WDD00903 Punjab-1 TT 8.4 ZDD14190 白秋1号 TT 10.7 ZDD23883 中黄20 TT 9.4 WDD01192 Xepcohckab2 CC 7.8 ZDD01797 7651-1 CC 7.9 WDD01069 Biaoge du lot et gerome CC 7.9 ZDD22798 吉黄138号 CC 7.9 ZDD00059 牡丰1号 CC 8.0 ZDD19699 泗豆2号 CC 8.0 ZDD18870 东山69 CC 8.0 ZDD10100 郑8516 CC 8.0 ZDD18632 冀豆7号 CC 8.1 ZDD08697 榆选13号 CC 8.1

ZDD18845 晋豆13号 CC 8.2 ZDD00393 哈1号 CC 8.2 ZDD06823 合丰25 CC 8.3 WDD01420 Pojabonar 856-3 CC 8.3 ZDD11588 74-424 CC 8.3 ZDD00003 黑农2号 CC 8.3 ZDD23221 潍J127 CC 8.3 ZDD19339 8588 CC 8.4 ZDD06819 嫩丰11号 CC 8.4 ZDD22642 黑生101 CC 8.4 ZDD19410 豫豆22 CC 8.4 ZDD01807 7694-1 CC 8.4 ZDD04451 金大332 CC 8.4 WDD01442 普广 CC 8.4

表2结果显示，59个大豆地方品种中29个品种基于Map-6017SNP位点的基因型 为TT纯合型，这29个品种的大豆地方品种中大豆籽粒的亚麻酸的平均含量为 9.96％；59个大豆地方品种中30个品种基于Map-6017SNP位点的基因型为CC纯合型， 这30个品种的大豆地方品种中大豆籽粒的亚麻酸的平均含量为7.96％。显著性检验 P<0.01。表3结果显示，27个大豆选育品种中3个品种基于Map-6017SNP位点的基 因型为TT纯合型，这3个品种的大豆选育品种中大豆籽粒的亚麻酸的平均含量为 9.50％；27个大豆选育品种中24个品种基于Map-6017SNP位点的基因型为CC纯合型， 这24个品种的大豆选育品种中大豆籽粒的亚麻酸的平均含量为8.18％。显著性检验 P<0.01。

统计结果表明，基于Map-6017SNP位点的基因型为TT纯合型的29个大豆地方品种 和3个大豆选育品种中，97％大豆籽粒的亚麻酸含量为8.5％以上；基于Map-6017SNP 位点的基因型为CC纯合型的30个大豆地方品种和24个大豆选育品种中，100％大豆籽粒 的亚麻酸含量小于8.5％。

实验证明，步骤2建立的基于Map-6017SNP位点进行基因分型方法可以用于鉴定 待测大豆品种中大豆籽粒亚麻酸含量的高低：检测待测大豆基于Map-6017SNP位点 的基因型，如果待测大豆基因组中基于Map-6017SNP位点的基因型为TT纯合型、待 测大豆籽粒为候选的具有高亚麻酸含量性状的大豆籽粒，如果待测大豆基因组中基 于Map-6017SNP位点的基因型为CC纯合型、待测大豆籽粒为候选的具有低亚麻酸含 量性状的大豆籽粒。所述高亚麻酸含量指的是亚麻酸含量为8.5％以上；所述低亚麻 酸含量指的是亚麻酸含量小于8.5％。