LncRNA-GAS5在制备青光眼诊断试剂中的应用

摘要

本发明公开了LncRNA-GAS5在制备青光眼诊断试剂中的应用以及一种青光眼病变的诊断试剂盒。本发明的通过高通量测序和定量PCR验证，发现LncRNA-GAS5与青光眼发生呈现显著地相关性。本发明可以用于临床青光眼病人的筛选，为青光眼的早期干预提供理论依据。

说明书

技术领域

本发明属于医学领域和分子诊断领域，具体涉及LncRNA-GAS5在制备青光眼诊断 试剂中的应用，以及一种青光眼LncRNA-GAS5诊断试剂盒，可根据个体的LncRNA-GAS5 表达水平进行人类青光眼病变的诊断及病情发展的判断。

背景技术

青光眼是一种常见的眼科疾病，以眼压升高或波动较大、视神经萎缩和视野缺损为 特征。青光眼目前是导致人类失明的三大致盲眼病之一，总人群发病率为1％，45岁以后为 2％。患者早期并没有明显的症状，直至开始出现明显视野缺损时，方才检查出青光眼，但 此时的视力损害已不可逆。目前，青光眼的治疗方式包括药物、激光和手术等，这些方法虽 然可以降低眼内压，延缓青光眼疾病的发生，但是视神经萎缩和视野缺损很难被逆转。因此 亟待对青光眼的发生进行早期诊断，寻找出新型无创的、高灵敏度和特异性的生物标志物。

长链非编码RNA(LncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们虽然 不编码蛋白产物，但是可以在多个层面(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控 基因的表达。它们可以调节许多生物学过程，包括细胞分化、增殖和凋亡，而且其LncRNA 表达异常与众多人类疾病发生密切相关，包括癌症、心血管系统和神经系统等疾病。

生长阻滞特异转录物5(Growth arrest-specific tran-script 5,Gas5,NCBI Reference  Sequence:NR_002578.2)是哺乳动物细胞凋亡和生长的关键调控因子。Gas5通过模拟糖皮 质激素应答元件来结合糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor)的DNA结合结构域,阻 止糖皮质激素受体与糖皮质激素应答元件的相互作用,从而抑制下游基因的表达,促进细胞 凋亡的发生。目前，尚无LncRNA-CAS5作为青光眼诊断的生物学标记物的报道。

发明内容

本发明目的在于提供了LncRNA-GAS5的新的用途，可作为诊断试剂用于青光眼病 变的早期诊断。

本发明具体技术方案如下：

核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的LncRNA-GAS5在制备诊断制备青光眼病变诊断试剂中 的应用，特别是青光眼的早期诊断。

本发明的另一个目的在于提供一种青光眼病变诊断的LncRNA-GAS5检测试剂盒， 试剂盒包括RNA抽提体系、RNA反转录反应体系和PCR反应体系，其中PCR反应体系含 有特异性扩增SEQ ID NO:1基因序列的引物序列。

上述检测试剂盒中RNA抽提体系包括总RNA提取试剂、RNA逆转录反应体系包括 反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；PCR反应体系包括扩增系统和引物系 统，所述扩增系统由SYBR Premix Ex Taq^TM试剂组成；所述引物系统包括RNA反转录随 机引物和GAS5特异性的qRT-PCR的引物，其中，

RNA反转录随机引物为GAPDH和/或Beta-tubulin的定量PCR引物序列，

GAPDH定量PCR引物序列，上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID  NO:3所示；

GAS5特异性的qRT-PCR的上游引物如SEQ ID NO:4所示，下游引物如SEQ ID NO:5所 示；Beta-tubulin定量PCR引物序列，上游引物序列如SEQ ID NO:6所示，下游引物序列如 SEQ ID NO:7所示。

上述的检测试剂盒，包括：

(a)抽提体系

1)Trizol reagent，1管，2000μL/管；

2)氯仿，1管，500μL/管；

3)无水乙醇,1管，8000μL/管；

4)DEPC ddH₂O，1管，1000μL/管；

5)ddH₂O，1管，2000μL/管；

6)异丙醇，8000μL/管；

(b)反转录体系

1)总RNA反转录引物(包括Oligo dT和Random6mers)，1管，浓度：50μM，50μL/ 管；

2)反转录酶(200U/μL)50μL；

3)dNTP Mixture(10mM each)50μL；

4)反转录buffer 50μL；

(c)PCR体系

1)SYBR Premix Ex Taq酶；

2)buffer 100μL；

3)GAS5特异性qRT-PCR的上游引物，1管，10μM，100μL/管；

GAS5特异性qRT-PCR的下游引物，1管，10μM，100μL/管；

GAPDH定量PCR上游引物，1管，10μM，100μL/管；

GAPDH定量PCR下游引物，1管，10μM，100μL/管；

和/或，Beta-tubulin定量PCR上游引物，1管，10μM，100μL/管；

Beta-tubulin定量PCR下游引物，1管，10μM，100μL/管；

4)dNTP Mixture(10mM each)50μL。

本发明确定了LncRNA-GAS5表达量的改变，与青光眼的发生存在显著地相关性。 LncRNA-GAS5可以作为青光眼早期诊疗的生物标记物，定期评估青光眼的进展和手术后的 复发情况。

本发明中确定LncRNA-GAS5作为青光眼诊断的生物标记物包括如下步骤：

第一步：样本准备：眼科青光眼手术后小梁网样本(实验组，n＝20)和外伤病人的小梁网样 本(对照组，n＝20)，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。

第二步：差异表达lncRNA筛选：采用美国Aglient公司的lncRNA表达谱芯片，分 析青光眼疾病发生相关的lncRNA。分析具体步骤为：采用标记酶将荧光基团标记 lncRNA，得到用于与芯片杂交的荧光探针，在标注条件下使用MAUI杂交仪和芯片杂交； 使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数值型数据进行 保存；采用Genespring GX软件分析找出青光眼发生相关的lncRNA分子；这时会筛选出一 系列的差异表达lncRNA，然后结合GO和KEGG信号通路分析，结合TRANSFAC和 catRAPID数据库，最终确定LncRNA-GAS5作为靶点用于后续的测定。

第三步：采用定量PCR验证芯片分析的实验结果；

第四步：验证靶点LncRNA-GAS5在青光眼病人、正常人和手术治疗青光眼病人血 浆和血细胞内的表达差异。

本发明的另一目的在于提供LncRNA-GAS5反义核苷酸在制备治疗青光眼药物中的 应用，反义核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。。

LncRNA-GAS5反义核苷酸与靶LncRNA-GAS5互补,抑制或封闭基因的转换和表 达，或诱导Rnase H识别或切割LncRNA-GAS5,使其丧失功能，因此可以作为药物用于治 疗青光眼。

本发明为青光眼疾病的早期诊断、预后判断和早期干预治疗提供重要的参考依据， 具有较大的实际临床价值，可以用于筛选出青光眼疾病的高危人群和复发人群，以期及早进 行干预和治疗，减少非高危复发病人不必要的治疗和医疗花费。

附图说明

图1为lncRNA芯片分析筛选青光眼发生相关的lncRNA(图A为箱线图分析芯片的 质量，其中每7个样本混合构成一个生物学重复，消除个体差异；图B为散点图从整体上 显示青光眼和非青光眼样本的lncRNA表达差异；图C为聚类图从整体角度，分析青光眼和 非青光眼样本的lncRNA表达差异；图D为火山图筛选青光眼相关的lncRNA；图E为定量 PCR验证芯片分析结果。

图2为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人和健康人房水的表达差异。

图3为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人和健康人玻璃体的表达差异。

图4为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人血浆和血细胞内的表达变化。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解 的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是 为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1LncRNA-GAS5与青光眼病变相关性验证

(1)lncRNA芯片分析筛选青光眼疾病有关的lncRNA并进行验证

第一步：样本准备：青光眼手术过程收集病变的组织小梁网(实验组，n＝21)和正常外伤人 的小梁网(对照组，n＝21)，总RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃ 备用。

第二步：差异表达lncRNA筛选：

采用美国Aglient公司的lncRNA表达谱芯片，分析青光眼疾病发生相关的lncRNA；分析具 体步骤为：采用标记酶将荧光基团标记lncRNA，得到用于与芯片杂交的荧光探针，在标注 条件下使用MAUI杂交仪和芯片杂交；使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强 度，并将实验结果转换成数值型数据进行保存；各个样本的分布如图1A所示；各个样本的 lncRNA整体表达分布如图1B和图1C所示，表明青光眼和非青光眼病理样本之间存在显著 地lncRNA表达差异；采用Genespring GX软件分析找出青光眼发生相关的lncRNA分子， 这时会筛选出一系列的差异表达lncRNA(如图1D所示)；

第三步：采用定量PCR验证芯片分析的实验结果(如图1E所示)；然后结合GO和KEGG 信号通路分析，根据t-test unequal unpaired算法，将P＜0.05且差异倍数在2倍以上的 lncRNA确定为差异表达LncRNA，结果表明LncRNA-GAS5在青光眼病人和正常小梁网内 表达差异最大，故而推测GAS5与青光眼疾病具有较大的相关性。

第四步：

收集青光眼病人和其他非青光眼病人的房水和玻璃体的临床样本；采用Trizol试剂提取总 RNA，通过反转录PCR的方法得到总RNA的cDNA；通过定量PCR的方法，检测靶点 LncRNA-GAS5的表达水平(如图2-4所示)，图2为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼 病人和健康人房水的表达差异，结果表明GAS-5在青光眼病人房水中表达下调；图3为定 量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人和健康人玻璃体的表达差异，结果表明GAS5在 青光眼病人玻璃体中表达下调；图4为定量PCR分析LncRNA-GAS5在青光眼病人血浆和 血细胞内的表达变化，结果表明GAS5在青光眼病人血细胞内表达下调。结果表明GAS5在 青光眼病人的房水、玻璃体以及血液内表达显著地下降。

实施例2制备本发明的试剂盒

LncRNA-GAS5的序列如SEQ ID:NO:1所示，其特异性定量PCR上下游引物以及内参 GAPDH和/或Beta-tubulin的定量PCR上下游引物，通过Primer 5设计，由Invitrogen公司 负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物采用DEPC H₂O溶解，总浓度为10μM。

制备包括以下组成成分的试剂盒：

抽提体系

1)Trizol reagent，1管，2000μL/管；

2)氯仿，1管，500μL/管；

3)无水乙醇,1管，8000μL/管；

4)DEPC ddH₂O，1管，1000μL/管；

5)ddH2O，1管，2000μL/管；

6)异丙醇，8000μL/管；

反转录体系

1)总RNA反转录引物(包括Oligo dT和Random6mers)，1管，浓度：50μM，50μL/ 管；

2)反转录酶(200U/μL)50μL；

3)dNTP Mixture(10mM each)50μL；

4)反转录buffer 50μL；

PCR体系

1)SYBR Premix Ex Taq酶；

2)buffer 100μL；

3)GAS5特异性的qRT-PCR上游引物(SEQ ID NO:4)，1管，10μM，100μL/管；

GAS5特异性的qRT-PCR的下游引物(SEQ ID NO:5)，1管，10μM，100μL/管；

GAPDH定量PCR上游引物(SEQ ID NO:2)，1管，10μM，100μL/管；

GAPDH定量PCR下游引物(SEQ ID NO:3)，1管，10μM，100μL/管；

和/或，Beta-tubulin定量PCR上游引物(SEQ ID NO:6)，1管，10μM，100μL/管；

Beta-tubulin定量PCR下游引物(SEQ ID NO:7)，1管，10μM，100μL/管；

4)dNTP Mixture(10mM each)50μL。

实施例3LncRNA-GAS5在房水、玻璃体、血细胞和血浆内的表达检测

血液样本:清晨空腹抽取静脉血5mL,加入含2％枸橼酸钠试管内，离心获得血浆和血细 胞样本，离心条件为4℃，12,000rpm,10min。

房水标本：在术中打开前房或作眼球切开前，用1.0mL无菌一次性塑料注射器直 接抽取前房水0.1mL，移入已经消毒1.0mL effendorf试管中低温保存。

玻璃体样本：在行标准三通道玻璃体切割时，不打开进水开关的情况下，于切割 头开口处，直接抽取玻璃体0.3mL，移入已经消毒1.0mL effendorf试管中低温保存。

房水、玻璃体、血清及血浆样本的RNA提取

分别在分离的房水、玻璃体、血细胞和血浆样本中，加入TRIzol后室温放置10min，使样 品充分裂解(注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存)。每1ml TRIzol加入 200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。4℃12,000rpm离心15 min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相 转移到新管中。在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15min。4℃12,000rpm离心 10min，弃上清，RNA沉淀于管底。RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配 制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75％乙醇。4℃8,000rpm离心 5min，弃上清。室温放置晾干后，在沉淀内加入50μl RNase-free水，以充分溶解RNA，- 70℃保存。

RNA质量检测

在260nm和280nm吸光度处，采用紫外分光光度计测定RNA的浓度；RNA溶液的 A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。同时，结合琼脂糖凝胶电泳检测 RNA质量，紫外透射光下观察并拍照。

RNA逆转录获得cDNA样本

逆转录采用用TaKaRa公司PrimeScript^TM RT reagent Kit，按照试剂盒提供的体系(20μl)分 别加入：

将以上体系置于无Rnase的0.2μl EP管中，按下面程序反转为cDNA：37℃15min， 85℃5sec，得到的cDNA放于-20℃中保存。

实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR反应体系(50μl)，配置如下：SYBR Green Mix 25μl，GAS5特异性的 qRT-PCR的上游引物、GAS5特异性的qRT-PCR下游引物、GAPDH定量PCR上游引物、 GAPDH定量PCR下游引物各1μl，和/或Beta-tubulin定量PCR上游引物、Beta-tubulin定 量PCR下游引物各1μl，dNTP 2μl，待测样品cDNA 2μl，ddH₂O 19μl。

PCR条件：

92℃5min,(92℃30s；58℃30s；72℃30s 40个循环)，72℃5min。

数据分析

基因表达值用Delta Ct的方法计算，假设目的和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差 不超过1Ct；ΔCt＝目的基因Ct均数-参照基因Ct均数；其中参照基因选择GAPDH和/或 Beta-tubulin；分别确定健康人和青光眼病人的ΔCt范围。

结果判断

计算出待测样本的ΔCt，分析其是否在健康人的正常范围内，若待测样本的ΔCt在健康人的 ΔCt范围内，或者小于该ΔCt范围，认为待测样本为青光眼阴性；若待测样本ΔCt大于健 康人ΔCt的范围，认为其为青光眼阳性。健康人的ΔCt范围如表1所示。

表1：健康人的ΔCt范围

  GAS5Ct均数-GAPDH Ct均数 GAS5Ct均数-Beta-tubulin Ct均数 房水样本 10.5-13.3 11.6-12.9 玻璃体样本 7.4-8.8 6.5-8.2 血细胞样本 4.8-7.2 6.9-9.1

根据上述结果，同时对照实际临床病理分析诊断的结果，分别选取30例未知的临床样 本，评价基于GAS5的方法检测的准确率，结果如表2所示。结果表明LncRNA-GAS5可作 为青光眼诊断的生物学标记物用于青光眼病变的诊断。

表2：基于GAS5的方法检测的准确率

  GAS5Ct均数-GAPDH Ct均数 GAS5Ct均数-Beta-tubulin Ct均数 房水样本 81.40％ 78.20％ 玻璃体样本 76.30％ 68.40％ 血细胞样本 76.20％ 77.15％