抑制STAT3表达和防治慢性移植物抗宿主病的shRNA及应用

摘要

本发明涉及一条能有效抑制STAT3基因表达和防治慢性移植物抗宿主病的shRNA，并提供STAT3-shRNA对小鼠脾CD4

说明书

技术领域

本发明涉及一种shRNA，特别涉及一种可抑制STAT3表达和防治慢性移植物抗宿主病 的shRNA小分子靶向药物及其应用。

背景技术

慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease，cGVHD)是异基因造血干细胞 移植(allogeneic hemapoietic stem cells transplant，allo-HSCT)长期存活患者的主要并发症， 不仅严重影响患者的生存质量，也是导致非复发死亡的主要原因。随着allo-HSCT的广泛开 展，约30％～70％患者可在移植后中位4～6个月发生不同程度的cGVHD，严重限制了 allo-HSCT的应用和发展。GVHD主要是由于有免疫活性的供体来源T细胞与受体组织反应 的结果。目前研究认为，cGVHD主要是由于供者自身反应性T细胞的活化所引发的免疫排 斥，现有免疫抑制治疗多以抑制T细胞活化为主要出发点，尽管这些措施能够在一定程度上 减少移植排斥，但是仍存在白血病等复发，甚至由于过度免疫抑制而引发致命性感染、继发 第二肿瘤等并发症，而抑制不足则导致cGVHD难以控制。寻找更有效、更精确调控机体免 疫抑制效果的新策略是移植领域研究的热点，亦可能是解决移植排斥并发症的根本出路。

近年来，利用RNA干扰技术，将化学合成的短发夹干扰RNA(short hairpin RNA，shRNA) 转导至特定的细胞，沉默相关基因的表达，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基 因治疗最有吸引力的方法之一。选择特异性的靶基因合成有效的shRNA，并且选择合适转染 方式，使其在宿主细胞中高效作用，是实施这一靶向治疗措施的重点。有效的靶向治疗是目 前国内外不断在寻找的治疗方法。幼稚CD4⁺Th细胞可以被活化并分化成熟为有不同功能的 效应性Th细胞。Th17细胞是在自身免疫性疾病发病机制的研究中，新发现一个分泌IL-17， 但其分化不依赖于Th1或Th2分化所需的细胞因子和转录因子的CD4⁺T细胞亚群。Th17细 胞在自身免疫性疾病和移植排斥领域有较广泛的研究，但有关Th17在GVHD发生发展中的 作用，近年才开始引起学者关注。我们的前期研究应用基因表达谱芯片发现STAT3及IL-17A、 IL-21在cGVHD病人表达升高，并且发现cGVHD患者外周血中存在Th17↑/Treg↓失衡。 新近研究发现：JAK/STAT信号转导途径是Th细胞极化的重要通路，其中信号转导及转录激 活因子3(signal transducer and activator of transcription 3)STAT3是Th17细胞分化的信号转 导通路的核心，是T细胞向Th17或Treg分化的“支点”，调控Th17和Treg之间的动态平衡。

我们在前期研究基础上结合免疫领域最新热点，首次提出通过阻断STAT3，对Th17/Treg 平衡进行调控，从而达到抑制cGVHD的研究思路。探讨阻断STAT3信号对诱导Th17、Treg 分化及其相互调控的作用及机制，阐明Th17/Treg“漂移”在cGVHD发生发展过程中的作用， 为进一步寻求cGVHD的免疫治疗新靶点提供实验依据。靶向针对STAT3基因的shRNA序列 对于开发新的抗cGVHD基因药物和提高cGVHD的治疗效果有重要的意义，具有广阔的应 用前景和经济价值。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种能高效抑制STAT3表达和防治慢性移植物抗宿主病的 shRNA。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抑制STAT3表达和防治慢性移植物抗宿主病 的shRNA，合成序列如下所示：

正义链：

5’-TCGACTTTGATTTCAACTACAACTCGAGTTGTAGTTGAAATCAAAGTCGTTTTTTC-3’ 反义链：

5’-TCGAGAAAAAACGACTTTGATTTCAACTACAACTCGAGTTGTAGTTGAAATCAAAGT CGA-3’

所述的shRNA应用于抑制STAT3基因(NM_213659)的表达。靶向序列为 ACTTTGATTTCAACTACAA。

本发明的另一目的在于提供一种可高效抑制或治疗慢性移植物抗宿主病的药物。

该药物含有如上所述的shRNA作为药物的活性成分。该药物是通过慢病毒载体感染宿 主细胞将shRNA药物整合至目的基因组，从而抑制STAT3基因表达和防治慢性移植物抗宿 主病。

制备上述可高效抑制或治疗慢性移植物抗宿主病的药物步骤如下：

针对小鼠STAT3基因序列，利用公用网站中提供的RNA干扰(RNAi)序列设计原则， 针对不同的靶点设计3条RNA干扰序列及RNAi阴性对照序列，选择最佳的动力学参数靶 点进入后续实验流程。合成含有干扰序列的单链DNA oligo，然后退火配对产生双链。通过 慢病毒感染宿主细胞达到将shRNA药物整合至目的基因组，其制备过程为：将合成的双链 shRNA，通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体上；将连接产物转入制备好 的细菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子后，送测序验证；测序结果经比对确认正确的克隆 即为构建成功的目的基因RNAi及阴性对照慢病毒载体质粒。同时制备重组慢病毒质粒的两 种辅助包装原件载体质粒，三种载体质粒分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen公司 Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液， 对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。免疫磁珠分 选小鼠脾细胞，活化72h后感染STAT3-shRNA及阴性对照慢病毒，96h 留取各组细胞，提取RNA，逆转录合成cDNA，荧光定量PCR(染料法)验证mRNA水平 的STAT3干扰效果，筛选出权利要求1所述的shRNA用于正式实验。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明的抑制STAT3表达的shRNA是通过慢病毒感染小鼠脾细 胞，经检测干扰效果筛选得到的；能高效抑制STAT3基因的表达，与阴性对照组比较，mRNA 水平的下调程度达到52倍左右，如图1、2，表3所示。

2、本发明的抑制STAT3表达的shRNA通过慢病毒载体作用于小鼠脾 细胞后，影响各亚群分化方向(如表4)，其中Th17比例降低，Treg比 例增高(如图3、4所示)，Th17/Treg比值降低，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

3、本发明的抑制STAT3表达的shRNA通过慢病毒载体作用于小鼠骨髓CD117⁺早期干 祖细胞后(图5)，荧光定量PCR检测STAT3-shRNA慢病毒感染小鼠骨髓CD117⁺早期干祖 细胞96h时STAT3基因的相对表达量(内参照基因为GAPDH)，与阴性对照组、空白对 照组比较，STAT3-shRNA干扰组STAT3基因在mRNA水平的相对表达量均数的差别均有统 计学意义(P<0.001，P<0.001)；阴性对照组与空白对照组比较，STAT3基因在mRNA水平 的相对表达量均数的差别无统计学意义(P＝0.063)(图6)。干扰组细胞增殖活力(如表5、 图7)、早期凋亡率(如表6、图8)及体外分化为各系造血集落的能力(如表7、图9)， 与对照组比较，均无显著性差异(P>0.05)，说明其安全性。

4、本发明的抑制STAT3表达的shRNA应用于活体内治疗小鼠cGVHD模型，cGVHD 临床评分(如表8、图10)及靶器官病理评分(如表9、图11-12)均降低，与阴性对照组比 较，差异有统计学意义(P<0.05)。

5、涉及STAT3基因的shRNA序列对于开发新的抗cGVHD基因药物和提高cGVHD的 治疗效果有重要的意义，具有广阔的应用前景和经济价值。

本发明的shRNA可用于抑制STAT3基因的表达，用于制备治疗慢性移植物抗宿主病的 小分子靶向药物，通过慢病毒载体感染并整合至目的细胞基因组，沉默STAT3基因的表达， 发挥治疗作用。

附图说明

图1是实施例1中通过荧光显微镜观察STAT3-shRNA慢病毒感染小鼠细 胞，其中(a)是空白对照组在200倍白光(Bright)情况下所进行的显微镜观察；(b)是空 白对照组在200倍荧光(GFP)情况下所进行的显微镜观察；(c)是空白对照组在200倍白 荧光融合(Merge)情况下所进行的显微镜观察；(d)是shRNA2组在200倍白光(Bright) 情况下所进行的显微镜观察；(e)是shRNA2组在200倍荧光(GFP)情况下所进行的显微 镜观察；(f)是shRNA2组在200倍白荧光融合(Merge)情况下所进行的显微镜观察。

图2是实施例1中通过荧光定量PCR检测STAT3-shRNA1、2、3慢病毒及阴性对照病毒感染 小鼠脾细胞96h时STAT3基因的mRNA水平相对表达量。

图3是实施例2中通过流式细胞术检测STAT3-shRNA2慢病毒及阴性对照病毒感染小鼠脾 细胞96h时CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg亚群细胞，其中(a)表示设门，紫 色代表干扰组CD4+的细胞群，(b)表示干扰组Treg亚群细胞同型对照，(c)表示干扰组Treg 亚群细胞，(d)表示设门，紫色代表阴性对照组CD4+的细胞群，(e)表示阴性对照组Treg 亚群细胞同型对照，(f)表示阴性对照组Treg亚群细胞。

图4是实施例2中通过流式细胞术检测STAT3-shRNA2慢病毒及阴性对照病毒感染小鼠脾 细胞96h时CD4⁺IL-17A⁺Th17亚群细胞，其中(a)表示设门，紫色代 表干扰组CD4+的细胞群，(b)表示干扰组Th17亚群细胞同型对照，(c)表示干扰组Th17 亚群细胞；(d)表示设门，紫色代表阴性对照组CD4+的细胞群，(e)表示阴性对照组Th17 亚群细胞同型对照(f)表示阴性对照组Th17亚群细胞。

图5是应用荧光显微镜观察实施例3中本发明的抑制STAT3表达的shRNA2慢病毒感染小鼠 骨髓CD117⁺早期干祖细胞96h的图，其中(a)表示白光200倍，(b)表示荧光200倍，(c) 表示白光400倍，(d)表示荧光400倍。

图6是实施例3中通过荧光定量PCR检测STAT3-shRNA2慢病毒感染小鼠骨髓CD117⁺早期 干祖细胞96h时STAT3基因的mRNA水平相对表达量，从左到右分别是空白对照组、shRNA 干扰组和阴性对照组。

图7是感染96h CCK8法检测各组小鼠骨髓CD117⁺细胞OD值，从左到右分别是空白对照组、 shRNA干扰组和阴性对照组。

图8是流式细胞术检测感染96h各组CD117⁺干祖细胞凋亡率，其中(a)表示空白对照组， (b)表示shRNA2组，(c)表示阴性对照组。(图中括号内数字代表3次检测结果的均数± 标准差)

图9是小鼠CD117⁺干祖细胞体外分化为各系造血集落图(14d倒置显微镜100-400倍)，从 左到右分别是空白对照组、shRNA干扰组和阴性对照组，从上到下分别是 CFU-E,CFU-GM,CFU-T。

图10是各时间点不同组临床评分的均数示意图。

图11是shRNA2治疗组与阴性对照组病理示意图。

图12是各组不同靶器官的cGVHD病理评分。

图13是STAT3-shRNA的慢病毒载体结构图。

图14是阴性对照RNA的慢病毒载体结构图。

图15是两种辅助包装原件载体结构图，其中a是pHelper 1.0载体，b是pHelper 2.0载体。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本例是用STAT3-RNAi慢病毒感染小鼠细胞，筛选出最佳的 STAT3-RNAi。

一、RNAi慢病毒载体的制备

1、shRNA靶点设计

基因名称：STAT3物种：Mouse

针对STAT3基因序列，利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则，设计多个RNA干 扰靶点序列，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程。

其结果如下表(表1)所示。

表1小鼠STAT3-shRNA干扰靶点序列

同时使用一些RNA干扰实验中公认序列，比如RNAi阴性对照(Negative Control，NC) Scramble序列(TTCTCCGAACGTGTCACGT)作为阴性对照。

基因信息：Scramble序列

核心序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT

通过NC序列在基因库中进行比对，结果NC序列仅和Zebrafish的两个基因有连续16个 碱基的同源性，除以上两个基因以外，该序列和基因组中的任何序列没有连续16个碱基的 同源性，因此可以用做普适型阴性对照。

2、合成3条STAT3-shRNA和阴性对照RNA

首先合成含shRNA1、2、3干扰序列或者阴性对照RNA序列的单链DNA oligo，然后退火配 对产生双链(上海吉凯基因技术有限公司合成)，再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后 的GV118或者GV112载体(载体均为上海吉凯基因技术有限公司提供)。

3、目的及阴性对照慢病毒载体构建：克隆制备与鉴定

载体名称：GV118、GV112，其中GV118用于构建STAT3-shRNA慢病毒载体，GV112用于构 建阴性对照慢病毒载体。

GV118元件顺序：U6-MCS-Ubi-EGFP GV112原件顺序：U6-MCS-CMV-uro(MCS含酶切 位点)

将2中连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子后，送测序验证；测序 结果经比对确认正确的克隆即为构建成功的目的基因RNAi及阴性对照慢病毒载体(上海吉 凯基因技术有限公司)。实验步骤参考分子克隆实验指南第二版，在此不再赘述。

4、RNAi及阴性对照慢病毒包装与滴度检测

制备3中编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒(pHelper 1.0载体、 pHelper 2.0载体，均由上海吉凯基因技术有限公司提供)，三种质粒载体分别进行高纯度 无内毒素抽提，按Invitrogen公司lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，转染 后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后 得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。

二、小鼠脾细胞的分选、活化。

1、实验动物

B10D2(Hc¹H2^d H2-T18^c)小鼠，雄性，8～10周龄用于实验研究。SPF级种鼠购自美国Jackson  laboratory，饲养于中山大学实验动物中心SPF级屏障环境。本研究所使用动物均符合《广东 省实验动物管理条例》要求，并通过广东省人民医院医学研究伦理委员会审查批准。

2、实验步骤：

(1)包被12孔板：1μL anti-mouse CD3e加入含有1mL PBS的12孔板中(1μg/mL)，在5％CO₂、 37℃培养箱中孵育包被2小时，2小时后去除PBS。

(2)颈椎脱臼法处死B10D2小鼠，立即放入75％乙醇中浸泡3～5min；无菌取出脾脏，小心 去除脾脏周围系膜组织，移入平皿内用RPMI 1640培养液洗涤3遍，然后置于无菌 70μm过滤筛网中用2mL注射器内芯轻轻碾磨，同时滴加RPMI 1640培养液使脾细胞 通过网眼，收集细胞冲洗液制成单细胞悬液，400-500×g，10℃离心5分钟，去上清 收集细胞。

(3)加入3mL红细胞裂解液，室温3-5分钟。

(4)加入27mLRPMI1640完全培养基(含10％胎牛血清及1％青链霉素)终止裂解。

(5)400-500×g，10℃离心5分钟，去上清。

(6)30mL磁珠分选buffer重悬细胞，计数，10℃离心10分钟，去上清。

(7)每10⁸总细胞数使用400μL磁珠分选buffer重悬细胞，每10⁸总细胞数再加入100μL CD4⁺T Cell Biotin-Antibody Cocktail II，混匀后置4-8℃孵育10分钟。

(8)每10⁸总细胞数再加入300μL磁珠分选buffer和200μLAnti-Biotin MicroBeads。

(9)混匀后，置4-8℃孵育15分钟。

(10)加入10mL磁珠分选buffer，4-8℃，300×g离心10分钟，去上清。每10⁸细胞数使 用500μL磁珠分选buffer重悬细胞。

(11)使用LS柱去除非CD4⁺T细胞：将75％乙醇消毒过的磁座置于超净工作台中，LS磁 柱安装于磁座上，磁柱下放置15mL离心管，将3mL磁珠分离buffer缓慢流过磁柱， 冲洗磁柱一遍。

(12)将适量总细胞悬液缓慢通过磁柱，用3mL磁珠分离buffer缓慢冲洗，重复两遍。收集 通过的液流，其中包含未标记的CD4⁺T细胞部分。

(13)300×g离心10分钟，完全去除上清；800μL磁珠分离buffer重悬细胞。

(14)加入200μL CD62L(L-selectin)MicroBeads。

(15)混匀后，置4-8℃孵育15分钟。

(16)加入10mL磁珠分选buffer，4-8℃，300×g离心10分钟，完全去上清。每10⁸细胞 数使用500μL磁珠分选buffer重悬细胞。

(17)使用MS磁柱，并更换磁柱下的离心管。将500μL磁珠分离buffer缓慢流过磁柱，冲 洗磁柱一遍。

(18)将细胞悬液缓慢通过磁柱，用500μL磁珠分离buffer缓慢冲洗，重复两遍。

(19)取下磁柱，离开磁座，并更换新的离心管。将1mL磁珠分离buffer加入磁柱，用推进 器用力加压(施压适中)，收集CD4⁺CD62L⁺naiveT细胞并计数。取1×10⁵细胞用于流 式细胞术检测分选纯度。

(20)剩余细胞悬液300×g离心10分钟，去上清；RPMI1640完全培养基洗涤1次，再加入 适量RPMI1640完全培养基重悬种板(已包被anti-mouse CD3e)，每孔1-2×10⁶/mL。 并加入终浓度为10μg/mL的anti-mouse CD28，置入5％CO₂、37℃培养箱中48-72h。 三、STAT3-RNAi慢病毒感染小鼠细胞。

(1)活化小鼠脾细胞48-72h后，收获各孔细胞，计数，离心去上清。

(2)用含有IL-2(终浓度40ng/mL)的1640完全培养基(含10％胎牛血清及1％青链霉素) 重悬细胞，平均加入5孔，每孔细胞数3-4×10⁶，感染时体积为500μL。

(3)分组：共分为5组，包括空白对照组、阴性对照组、STAT3-shRNA1组、STAT3-shRNA2 组、STAT3-shRNA 3组。

(4)感染：每孔均加入Polybrene工作液(终浓度5μg/ml)，除空白对照组外，每组均加入 对应病毒(MOI为30)，封口膜封板；800×g离心90分钟后去除封口膜，置入5％CO₂、 37℃培养箱中。

(5)8-12h后300×g离心10分钟，换液。每24小时观察细胞状态、GFP表达情况，中途可 半量换液，保持细胞活性。96h时收获细胞，300×g离心10分钟，留上清；PBS洗涤 细胞一次，去上清，每管加入1mL TRIzol充分溶解，置-80℃备用。

四、mRNA水平验证STAT3干扰效果，筛选出最佳STAT3-RNAi

(1)提取RNA：从-80℃取出样本，置冰上，5分钟后加入0.2mL氯仿，充分混匀，4℃，12000 rpm离心30min。小心吸取上层液至另一新的1.5mL离心管，加入0.5mL异丙醇并混 匀，室温静置10min后，4℃，12000rpm离心30min。去上清，并用1mL预冷的75％ 乙醇(-20℃)洗涤两次(2～8℃，10000rpm)，每次混匀30s后，离心10min。弃上 清，再离心2～3min，小心去除剩余的乙醇，置于超净台上自然干燥1～1.5h。加入 ddH2O(20～50μL)溶解。取2μL已溶解的RNA溶液经0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测 RNA的质量和完整性。

(2)合成cDNA：每合成20μLcDNA反应体系为：RNase Free dH₂O 4μL、5X PrimeScript Buffer  4μL、Random 6mers and Oligo dT 4μL、PrimerPrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、RNA  7μL；反应条件为：37℃30min，85℃5sec，4℃。

(3)荧光实时定量PCR法(染料法)检测各组内参照GAPDH及目的STAT3基因mRNA表 达水平：

1)设计、合成引物：引物序列见下表，引物由Invitrogen公司合成。

表2内参照及目的基因引物序列

2)配置引物工作液：将内参照及目的基因的引物干粉用dH₂O稀释为储存液(100μmol/L)， 再取出10μL用90μL dH₂O稀释为10μmol/L工作液。-20℃冰箱保存备用。

3)荧光实时定量PCR总反应体积为：RNase Free dH₂O 3μL、SYBR Premix Ex Taq(Tli  RNaseH Plus)(2X)5μL、ROX Reference Dye II(50X)0.2μL、PCR Forward Primer (10μM)0.4μL、PCR Reverse Primer 0.4μL、cDNA模板1μL。反应体系：95℃30sec， (95℃5sec，60℃34sec)x40cycles，95℃15sec，60℃1min，95℃15min。

4)相对mRNA表达水平的计算：应用相对定量公式：2^－△Ct×100％，计算各组样本的STAT3 目的基因相对内参照GAPDH mRNA表达水平，其中△Ct＝Ct(目的基因)－Ct(内 参基因)。

五、统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行数据的统计学分析。正态分布数据以均数±标准差描述。 采用One-Way ANOVA比较多组间数据，采用Levene检验方差齐性；各组方差齐时，组间 的比较选用可进行多个样本均数间两两均数比较的S-N-K(q检验)；若各组方差不齐则采用 校正的Welch统计量，组间比较采用Tamhane’s T2法进行多重比较。检验的显著性水准设为 α＝0.05。

以下表及图2是实施例1中通过荧光定量PCR检测STAT3-shRNA慢病毒感染小鼠脾 细胞96h时STAT3基因的相对表达量(内参照基因为GAPDH)

表3各组STAT3mRNA水平的相对表达量

^a Welch统计量

从上表可以看到，STAT3-shRNA2组[即表1中的shRNA2(22253-1)组]具有最佳的抑制 STAT3基因表达的干扰效果，因此，这一组为筛选得到的最佳的STAT3-RNAi。

实施例2

本例是采用流式细胞术检测Th亚群分布。

(1)采用最佳干扰效果的STAT3-shRNA2(22253-1)慢病毒感染小鼠细胞；同前。

(2)感染96h时收获各组细胞，每孔混匀后各取100μLx2管，1管用于刺激后标记；另一管 300×g离心5分钟，完全去上清，流式染色缓冲液FBS(配置：PBS+0.1％NaN3+5％胎 牛血清)洗涤一次，300×g离心5分钟，完全去上清；FBS重悬后分组标记流式抗体；

(3)Treg细胞的检测：

1)加入1μL Anti-MouseCD4-PE、1.5μL Anti-MouseCD25Alexa-Fluor700，室温避光孵育15 分钟。

2)旋涡振荡重悬细胞后，每管加入Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer固定/破膜工 作液(新鲜配制，3倍体积的固定/破膜稀释液#00-5223稀释固定/破膜浓缩液#00-5123) 1ml，再次旋涡混匀，避光4℃孵育50分钟。

3)无需洗涤，直接加入破膜缓冲液工作液#00-8333(去离子水1:9稀释成工作液)2mL， 300×g离心5分钟，去上清，重复洗涤1次。每管加入100μL FBS重悬。

4)分别加入1.5μLAnti-Mouse FOXP3PE-CY5.5及同体积的同型对照。混匀，室温避光孵 育20分钟。

5)加入破膜缓冲液工作液#00-8333(去离子水1:9稀释成工作液)2mL，300×g离心5分 钟，去上清，重复洗涤1次。

6)每管加入400μL FBS重悬，避光，上机检测并分析。如不能立即检测，用0.4mL 1％多 聚甲醛重悬，避光4℃保存24小时内上机分析。

(4)Th1/2/17细胞的检测：

1)分组：预实验设定复孔，刺激剂与阻断剂比例分别为0.5:1、1:1、2:1；据反映细胞活化 状态的CD69表达结果，确定正式实验采用的刺激剂与阻断剂的浓度。刺激组：细胞 悬液+刺激剂PMA/Ionomycin+阻断剂BFA/Monensin Mixture；不刺激对照组：细胞悬 液+阻断剂BFA/Monensin Mixture；

2)刺激：置入5％CO₂、37℃培养箱中，每1-2小时晃动、混匀细胞悬液一次；4小时后， 每小时吸取适量细胞悬液标记Mouse CD69PE，通过流式细胞仪检测CD69的表达， 了解细胞的活化程度，确定正式实验的刺激时间。

3)标记流式抗体：加入1μL Anti-MouseCD4-PE，室温避光孵育15分钟。加入FIX&PERM  Reagent A 100μL室温孵育15分钟，加入3mL流式染色缓冲液，300×g离心5分钟， 去上清收集细胞，液体尽量倒干净，不要残留；涡旋混匀沉淀，加入FIX&PERM Reagent  B 100μL和胞内抗体(1.5μL Anti-Mouse IFN gamma PE-eFluor 610、1.5μL Anti-Mouse  IL-4APC、2.5μL Anti-Mouse/Rat IL-17A PE-Cy7)，同型对照管加入同等剂量的抗体， 混匀，室温避光孵育20分钟；加入3mL流式染色缓冲液，300×g离心5分钟，去上清 收集细胞；用400μL FBS重悬，避光，上机检测并分析。如不能立即检测，用0.4mL 1％ 多聚甲醛重悬，避光4℃保存24小时内上机分析。

表4是实施例2中通过流式细胞术检测STAT3-shRNA2慢病毒感染小鼠脾 细胞96h时各亚群细胞比例。

表4

备注： *P<0.05shRNA2vs NC

实施例3

本例是检测STAT3-shRNA2(22253-1)对小鼠骨髓(c-kit)CD117⁺细胞增殖、分化的 影响。

一、准备半固体培养基

2.2％甲基纤维素溶液：根据文献方法配置。称取甲基纤维素粉剂1.1g，用洁净白纸包， 加于煮沸的25mL双蒸水中，用磁力搅拌器搅拌2小时，使之充分溶解。120℃消毒后待降温 至37℃左右，再加入2×RPMI1640液25ml，并继续搅拌4小时。置4℃过夜，使泡沫全部消 失，呈透明发亮胶液态。分装后4℃保存。配置培养体系时，以1mL注射器直接吸取。

二、配置、分装细胞因子

SCF贮存浓度：100μg/mL工作液浓度：10μL加入990μL 0.1％BSA稀释液，每管200μL分 装(1μg/mL)；使用时每孔0.5mL终体积中加50μL(100ng/mL)。

IL-3100μL无菌水溶解10μg，100μg/mL；贮存浓度：(10μL加入490μL 0.1％BSA稀释液) x10管(2μg/mL)；工作液浓度：取1管，(每50μL+450μL 0.1％BSA稀释液)x10管(200ng/mL)； 使用时每孔0.5mL终体积中加50μL(20ng/mL)。

EPO贮存浓度：10000IU/mL，工作液浓度：取3μL加入997μL RPMI1640培养基(30IU/mL)， 使用时每孔0.5mL终体积中加50μL(3IU/mL)。

IL-6100μL无菌水溶解10μg，100μg/mL；贮存/工作液浓度：10μL加入990μL 0.1％BSA稀释 液，每管200μL分装(1μg/mL)；使用时每孔0.5mL终体积中加50μL(100ng/mL)。

GM-CSF 200μL无菌水溶解20μg，100μg/mL；贮存浓度：(10μL加入490μL 0.1％BSA稀释 液)x10管(2μg/mL)；工作液浓度：取1管，(每50μL+450μL 0.1％BSA稀释液)x10管 (200ng/mL)；使用时再用1640对半稀释，每孔0.5mL终体积中加50μL(10ng/mL)。

TPO 100μL无菌水溶解10μg，100μg/mL；贮存/工作液浓度：10μL加入990μL 0.1％BSA稀 释液，每管200μL分装(1μg/ml)；使用时再用1640对半稀释，每孔0.5mL终体积中加50uL (50ng/mL)。

三、流式细胞术分选小鼠骨髓(c-kit)CD117⁺细胞

(1)颈椎脱臼法处死小鼠(5只B10D2♂6-8weeks)，无菌条件下取出小鼠双下肢胫骨、股 骨和髂骨，RPMI1640冲骨髓，离心去上清；FBS 2mL洗一遍；

(2)1mL FBS重悬细胞，取100μL空白对照、100μL标记RatIgG2bK PE同型对照、800ul 标记CD117(C-KIT)-PE，4℃、避光孵育30分钟；

(3)1X红细胞裂解液(1：3BM)5mL充分混匀，裂解5min；离心去上清，20mLFBS重 悬计数，300x g，离心5分钟，去上清；

(4)400μL FBS重悬对照组，800μL重悬分选组，上机分选。准备含5％胎牛血清、1％青 链霉素的RPMI1640培养基接收细胞。

四、STAT3-shRNA(22253-1)慢病毒感染小鼠骨髓(c-kit)CD117⁺细胞

(1)300xg，离心5分钟，去上清收集细胞，15％完全RPMI1640培养基重悬细胞，种板， 分3组，并加入细胞因子(SCF:50ng/mL、GM-CSF:20ng/mL、IL3:20ng/mL、IL6：20ng/mL、 EPO：3U/mL)诱导增殖。

(2)诱导48h，每组均加入Polybrene工作液(终浓度5μg/ml)，除空白对照组外，每组均 加入对应病毒(阴性对照病毒、STAT3-shRNA22253-1慢病毒，MOI均为30)，封口膜 封板；800×g离心90分钟后去除封口膜，置入5％CO₂、37℃培养箱中。

(3)8-12h后300×g离心10分钟，换液。每24小时观察细胞状态、GFP表达情况，中途可 半量换液，保持细胞活性。感染72h时收获细胞，300×g离心10分钟，留上清；一部分 PBS洗涤细胞一次，去上清，每管加入1mL TRIzol充分溶解，置-80℃备用。一部分用 于CCK8法检测增殖。一部分种入2.2％甲基纤维素半固体培养基中，分别加入不同细胞 因子，诱导分化。

五、干扰组及对照组小鼠骨髓(c-kit)CD117⁺细胞STAT3mRNA相对表达水平检测

提取RNA、合成cDNA、荧光定量PCR(染料法)检测：同前。

六、CCK8法检测干扰组及对照组小鼠骨髓(c-kit)CD117⁺细胞增殖情况

(1)感染72h，接种各组细胞液于96孔培养板中，每孔体积100μL(约～10⁴细胞数)；并 增设培养条件的空白对照孔，每组均设3个平行孔。分别向每孔内加入10μL CCK8液， 再置入37℃、饱和湿度、5％CO₂条件培养3h；

(2)取出96孔板，在酶标仪450nm波长处测定A450值(OD值)，间接反应活细胞数量。

七、流式细胞术检测干扰组及对照组小鼠骨髓(c-kit)CD117⁺细胞凋亡情况

(1)感染96h，收集细胞并重悬于Binding Buffer，加入APC标记的Annexin V和PI，室温 避光孵育5分钟；

(2)流式细胞仪检测。

八、2.2％甲基纤维素半固体培养基及不同细胞因子诱导干扰组及对照组小鼠骨髓(c-kit) CD117⁺细胞分化

(1)种板：24孔培养板，每组3孔，分别用于诱导红细胞集落BFU-E、粒细胞巨噬细胞集 落CFU-GM和巨核细胞集落CFU-Meg(细胞数较多时设复孔)。

红系孔：每孔0.5mL体系：依次加入75μL的胎牛血清(终体积百分数15％)、50μL的IL3 (终浓度20ng/mL)、50μL的SCF(终浓度100ng/mL)、50μL的EPO(终浓度30U/mL)、 100μL RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素，混匀，尽量避免气泡；最后每孔加入 50μL的细胞液(约1×10⁵)。

粒系孔：每孔0.5mL体系：依次加入75μL的胎牛血清(终体积百分数15％)、50μL的IL3 (终浓度20ng/mL)、50μL的IL6(终浓度20ng/mL)、50μL的SCF(终浓度100ng/mL)、 50μL的GM-CSF(终浓度10ng/mL)、50μL RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素， 混匀，尽量避免气泡；最后每孔加入50μL的细胞液(约1×10⁵)

巨核系孔：每孔0.5mL体系：依次加入75μL的胎牛血清(终体积百分数15％)、50μL的IL6 (终浓度100ng/mL)、50μL的SCF(终浓度100ng/mL)、50μL的TPO(终浓度50ng/mL)、 100μL RPMI1640培养基、125μL的甲基纤维素，混匀，尽量避免气泡；最后每孔加入 50μL的细胞液(约1×10⁵)

(2)计数：轻轻混匀后置于37℃、饱和湿度、5％CO₂条件下常规培养；14天后在显微镜下 计数各组BFU-E(＞50个细胞为1个集落)、CFU-GM(＞40个细胞为1个集落)、CFU-Meg (＞3个细胞为1个集落)的数量。

九、统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行数据的统计学分析。正态分布数据以均数±标准差描述；非正态分布数据以中位数描述。各组方差齐时，采用两样本t检验比较两组间均 数；若各组方差不齐，则采用两样本比较的秩和检验(Mann-Whitney Test)。检验的显 著性水平定义为α＝0.05。

表5感染96h CCK8法检测各组小鼠骨髓CD117⁺细胞OD值

^a Welch统计量

表6感染96h流式检测各组小鼠骨髓CD117⁺细胞早期凋亡率

^a Welch统计量

表7 STAT3-shRNA作用后各组分化的集落数

实施例4

本例为STAT3-shRNA2(22253-1)慢病毒应用于活体内治疗小鼠cGVHD模型的实施例。 实施例4中本发明的抑制STAT3表达的shRNA应用于活体内治疗小鼠cGVHD模型，cGVHD 临床评分(表8及图10)及肺脏靶器官病理评分(表9)均降低，与阴性对照组比较，差异 均有统计学意义(P<0.05)。图11、12所示为各组靶器官病理形态及评分。

表8各时间点不同组临床评分的均数

表9不同组肺脏病理评分的均数

一、制备小鼠慢性移植物抗宿主病模型

1、实验动物

供鼠为B10D2(Hc¹H2^d H2-T18^c)小鼠，雄性，8～10周龄，购自美国Jackson实验室；受鼠 为近交系BALB/c(H2^d)小鼠，雌性，8～10周龄，购自中山大学实验动物中心，均为SPF 级动物。

2、受鼠预处理及分组

20只BALB/c小鼠于移植前1周开始饮用添加抗生素(红霉素250mg/L，庆大霉素32万U/L) 的灭菌水进行肠道准备，并维持至移植后2周。分组处理：A、空白对照组，同步饲养，无 干预；B、放射对照组：放射后输注RPMI 1640液；C、移植对照组：放射后输注BMC液； D、cGVHD实验组：放射后输注BMC和SpC混合液。移植当日(0d)，B、C、D组受鼠接 受直线加速器(瑞典医科达Precise 151337)SSD100，30x30照射野，700cGy，698跳，单次 全身照射(TBI)预处理，源皮距为100cm。照射后立即补充饮水，休息4～6小时后经尾静 脉注射终体积为0.4mL的移植细胞液。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

3、骨髓移植

B10D2供鼠BMC悬液的制备方法如下：以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75％乙醇中浸泡3～5 min，无菌条件下剥离股骨和胫骨，用RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔，收集含有骨髓的冲洗 液制成单细胞悬液。单细胞悬液过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，RPMI 1640洗涤，计数 并用RPMI 1640重悬细胞，调整BMC计数至4×10⁷/mL备用。供鼠SpC悬液的制备方法如 下：以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75％乙醇中浸泡3～5min，无菌条件下取出脾脏，去除 脾脏周围系膜组织，移入培养皿内用RPMI 1640培养液洗涤、碾磨，收集细胞冲洗液制成单 细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，RPMI1640洗涤，计数并用RPMI 1640重悬 细胞，调整SpC计数至4×10⁷/mL备用。移植对照组和cGVHD实验组每只小鼠分别经尾静 脉注射8×10⁶BMC，或8×10⁶BMC+8×10⁶SpC的细胞悬液。

4、一般状态观察

移植后每天观察小鼠一般状态，包括体质量、皮疹、脱毛、弓背、腹泻等，14d后每3 天进行一次临床评分，标准见表10：

表10慢性GVHD的临床评分标准

注：耳朵、尾巴、脚掌每处脱皮或结痂记0.3分，皮肤临床表现最低得0分，最高得3.9分； 皮肤得分超过0.6分视为发生cGVHD；即使症状消退、小鼠自然死亡或人为因素造成死亡也 视为发生cGVHD；小鼠无症状死亡视为无cGVHD。

5、外周血白细胞计数及转归判断

每组小鼠于移植后7，10和14d断尾采血计数外周血白细胞(white blood cell，WBC)，以 监测造血重建情况。计数方法：断尾取血10μL，加入190μL白2％冰醋酸细胞稀释液中混匀， 然后滴加到细胞计数板上，水平静置1min后计数4个大方格中细胞数(N)，WBC＝(N÷20) ×10^9/L。同时涂片2张，瑞氏染色后镜下观察白细胞形态并分类。转归的判断标准：(1) 造血重建：WBC≥1×10^9/L；(2)造血功能衰竭：死亡前WBC<1×10^9/L；(3)cGVHD：出 现脱毛、皮肤脱皮或结痂、体重下降等临床表现，且WBC≥1×10^9/L，小肠、肺、皮肤、肝 脏组织等病理学检查存在cGVHD病理改变；(4)移植相关死亡：除cGVHD和造血衰竭之 外原因导致的死亡，包括感染、出血和器官功能衰竭等原因，小鼠死亡前WBC≥1×10^9/L， 但无cGVHD临床表现和病理改变。

6、cGVHD的病理评分

濒死小鼠或实验终点颈椎脱位处死各组小鼠，解剖，取皮肤(肩胛部或病变部位)、肝脏、小 肠、肺等器官。

(1)固定：取各脏器组织切成小块，10％中性福尔马林溶液内固定24小时；

(2)以下程序在Shandon全自动密闭脱水机中完成：把固定好的组织标本分别在80％乙醇 50min，90％乙醇50min，95％乙醇III各40min，100％乙醇III各40min；将脱水后标本 分别在二甲苯I、II、III中放置30min；低熔点石蜡I、II、III中放置各25min(温度设置 为62摄氏度)；高熔点石蜡I缸25min(温度设置为64摄氏度)；

(3)组织处理程序结束后，取出标本，置于包埋机的蜡槽中,进行包埋(温度设置为62摄 氏度)；

(4)切片：在切片机上切下4μm切片，漂在干净的水面上，在50-57摄氏度温水中展开， 再将组织切片捞起；在70摄氏度烤箱中烘烤15-20min；

(5)从烤箱中取出切片，室温稍冷却，将切片放到染色机上进行全自动HE染色，染色程 序如下：二甲苯I、II、III中放置各7min，100％乙醇III、95％乙醇III、80％乙醇、蒸馏 水各1min。苏木精染液中15分钟，水洗,0.5％盐酸酒精10s；2％碳酸锂水溶液1min； 流水冲洗10min，80％乙醇、95％乙醇III，80％乙醇，100％乙醇IIIIII、二甲苯I、II各1min；

(6)取出切片，将切片挂上Shandon封片机进行封片。

(7)光学显微镜下观察HE染色组织切片。镜下观察并评分，标准见表11。肺的病理评分 参考Cooke KR在1996年所定评分标准(表12)。

表11 cGVHD的病理评分标准

注：得分超过2视为发生cGVHD。

表12移植小鼠肺组织病理变化

损伤的范围根据肺组织受累的比例来评分(5％-25％＝1；>25％-50％＝2；>50％＝3)

总分为腔周浸润和肺炎评分的总和。

·浸润指巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、混有纤维蛋白，或水肿液。

二、应用本发明的抑制STAT3表达的shRNA活体内治疗cGVHD小鼠：

1、治疗时间及方法：

随机分配发病状态小鼠(cGVHD临床评分达到0.6分或以上)，shRNA治疗组、阴性对照组及 空白对照组各6只。shRNA治疗组：每只小鼠通过尾静脉注射冷的0.3-0.4mLRPMI 1640液[含 1x10⁷TU的STAT3-shRNA2(22253-1)慢病毒]；阴性对照组：每只小鼠通过尾静脉注射冷 的0.3-0.4mLRPMI 1640液(含1x10⁷TU的阴性对照慢病毒)；空白对照组：每只小鼠通过尾静 脉注射冷的0.3-0.4mLRPMI 1640液。操作迅速、保持病毒活性。

2、治疗后临床观察：同前。观察终点为移植后+58d，治疗+30d左右。比较各组治疗后临床 评分的变化特点。

移植后7d内，受鼠均出现竖毛、活力下降、体重减轻；+7～+10d，骨髓植入，造血恢复，受 鼠活力恢复，体重回升。+17d，受鼠开始逐步出现cGVHD的相关临床表现，轻重不一；至 +28d，18只实验对象均发病，评分均在0.6或以上；以+28d作为治疗点，根据临床评分将实 验对象分为轻(0.6～2分)、中(2.3分～)二个程度，随机分配至shRNA治疗组、阴性对照 组、空白对照组，每组6只，每组均有轻度3只、中度3只。以治疗后30d，移植后+58d最为实 验观察终点，处死所有受试对象。

+28d至+50d，各组实验对象临床表现加重，cGVHD评分的均数持续呈上升趋势。+50d 开始，shRNA治疗组实验对象出现脱毛减轻、气促减轻、活力恢复、体重上升，cGVHD评分 的均数下降；阴性对照组和空白对照组实验对象仍有脱毛、皮肤结痂，活力差，气促重、弓 背影响运动，体重轻，进入临床表现重度的平台期，cGVHD评分持续在较高水平。(表8、 图10)

+28d开始治疗，至观察终点+58d，应用重复测量设计的方差分析，结果显示：时间效应 有统计学意义(F＝19.886，P<0.001)，说明cGVHD临床评分随时间变化；时间与处理交互 效应也有统计学意义(F＝2.256，P<0.001)，说明在shRNA治疗组和阴性对照组，观察对象 的cGVHD临床评分随时间变化的趋势不同。阴性对照组和空白对照组比较，处理效应并无统 计学意义(F＝0.171，P＝0.844)，说明两组cGVHD临床评分随时间变化的趋势一致。观察终 点+58d，经两样本t检验，按α＝0.05水准，认为shRNA治疗组和阴性对照组cGVHD临床评 分总体均数的差别有统计学意义(t＝2.370，P＝0.039，n＝6)。(表8、图10)

3、观察终点处死小鼠，取靶器官(皮肤、肺、肝脏、肠道)行cGVHD病理评分：同前。

病理提示：各组cGVHD靶器官出现不同程度的肺血管/支气管周围炎症细胞浸润，肝 门管区炎症细胞；肠道轻度炎症，无溃疡；皮肤毛囊减少，局灶炎症，脂肪细胞减少、胶原 沉积(图11)。进一步分析干扰组和阴性对照、空白对照组的靶器官病理评分，提示干扰组肺 脏的病理评分明显低于阴性对照组(t＝2.449，P＝0.034，n＝6)(表9)；干扰组皮肤、肠道病 理评分与对照组比较并无显著性优势(图12)；除阴性对照组有少数小鼠出现轻度肝门管区炎 症细胞，各组肝脏并无明显肝脏cGVHD特异性表现。

三、统计学分析

本研究数据采用SPSS20.0统计学软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用表示。cGVHD实验组与移植对照组的数据比较，采用两样本t检验；不同时间点连续测量的 样本，采用重复测量设计的方差分析。以P＜0.05示差异有统计学意义。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为 等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。