一种需氧菌或兼性需氧菌的简易批量培养方法

摘要

本发明公开了一种需氧菌或兼性需氧菌的简易批量培养方法，采用密封箱体多层方盘固体平面发酵装置培养。所述的密封箱体和方盘是以不易变形的耐热薄板材质制作，密封箱体的大小以仅能容纳指定数量层叠放置的方盘为准，密封盖的对角处分别设置有2个接种孔。采用一次性注入培养基、一次性灭菌、一次性形成多层培养表面、一次性接种、一次性洗涤收获。其设备简单、成本低廉、操作方便、不易污染、生产效率高，与传统发酵罐液体发酵培养方法相比，其培养效率可提高50倍以上，细菌浓度可高达1500~2000亿个/ml，降低生产成本50%以上，解决了在需氧菌或兼性需氧菌的批量生产制备过程中普遍存在生产效率低、菌液浓缩困难、污水排放多或生产成本高等瓶颈问题。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种需氧菌或兼性需氧菌的简易批量培养方法。

背景技术

发酵是指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程（邱立友，王明道主编 ．微生物学 ：化学工业出版社 ，2012 ：343）。随着生物技术的不断发展，在微生物发酵领域对需氧菌或兼性需氧菌的纯培养需求日益增多，目前，需氧菌或兼性需氧菌的实验室培养是一种常见、简单、成熟技术，如液体、固体培养；试管、平皿、茄形瓶培养等，但大批量生产制备，其工艺难度较大。在大批量需氧菌或兼性需氧菌的纯培养发酵领域，多采用传统的发酵罐液体通气培养方法，该方法普遍存在生产环节易污染、生产效率较低、菌液浓缩困难、污水排放多及生产成本高等瓶颈。

密封箱体多层固体发酵培养方法，其设备简单、成本低廉、操作方便、不易污染、生产效率高；该技术的应用可显著降低培养基的用量，节约产品浓缩成本，降低能耗，减少污水排放。与传统发酵罐液体发酵培养方法相比，其培养效率可提高50倍以上，细菌浓度可高达1500 ~2000亿个/ml，降低生产成本50%以上。

经百度搜索引擎、维普中文科技期刊数据库等搜索“固体平面发酵”、“固体平面培养”、“多层方盘发酵培养”等词汇，均未查阅到相同或相近的内容。现行的微生物固体发酵培养，是在本领域广泛应用的传统技术、方法，其工艺特征在于混菌发酵培养，即微生物与固体培养基颗粒混合在一起。本专利技术提供的密封箱体多层固体培养方法，工艺特征是浓缩纯培养，即单一细菌的纯化培养。细菌的批量纯化培养在许多生物技术领域如菌种生产、疫苗生产、微生态制剂和生物酶制剂生产等都有着广泛的技术需求。

发明内容

本发明的目的在于针对在需氧菌或兼性需氧菌的批量生产制备过程中普遍存在生产效率低、菌液浓缩困难、污水排放多或生产成本高等瓶颈问题，提供一种需氧菌或兼性需氧菌的简易批量培养方法，该培养方法设备简单、成本低廉、操作方便、不易污染、生产效率高，与传统发酵罐液体发酵培养方法相比，其培养效率可提高50倍以上，细菌浓度可高达1500~2000亿个/ml，降低生产成本50%以上。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种需氧菌或兼性需氧菌的简易批量培养方法，采用密封箱体多层方盘固体平面发酵装置培养；所述的密封箱体和方盘是以不易变形的耐热薄板材质制作，方盘的数量为10~20个，密封箱体的大小以仅能容纳指定数量层叠放置的方盘为准，密封盖的对角处分别设置2个直径为22mm的接种孔，接种孔用硅胶塞密封；所述密封箱体开口处设有封闭开口的密封盖，所述密封盖与箱体开口边缘之间设有密封胶垫，所述密封盖、密封胶垫及箱体经贯穿三者的锁闭螺丝固定连接；锁闭螺丝设置于密封盖四角。

所述的不易变形的耐热薄板材质是不锈钢。

每个方盘的尺寸根据生产需求进行设定，如根据生产需求设置为：长45㎝~60㎝；宽30㎝~45㎝；高1.5㎝~2.5㎝。

所述的需氧菌或兼性需氧菌的简易批量培养方法，包括以下步骤：     1）通过密封盖上预留的接种孔，注入按方盘内表面积计算能形成厚度为3mm~5mm凝胶的琼脂培养基混悬液，用硅胶塞密封接种孔，置高温灭菌设备中常规灭菌，待箱体温度降至50℃~60℃，震荡箱体混匀培养基，以方盘位置为基准竖立箱体，静置片刻使琼胶从缝隙中流入方盘，待琼胶液面平衡稳定，然后快速水平放置箱体并使方盘开口朝上，使融化的琼脂均匀分布于每个方盘中；

2）待琼脂降温凝固，按箱体容积的1%~2%接种液体菌种，接种采取无菌术式，借助超净工作台或火焰封闭将菌种注入或滴入接种孔中，菌种浓度保持5亿个/ml以上，接种后以方盘位置为基准竖立箱体，静置片刻使菌液从缝隙中流入方盘，待菌种液面平衡稳定，然后快速水平放置箱体并使方盘开口朝上，轻轻倾斜、往返震荡箱体，使菌种充分涂布于琼脂培养基表面，置适温条件下培养24 h~72 h形成菌苔；

3）培养物收获时按箱体容积的15%~20%注入冲洗液，震荡箱体充分洗涤菌苔后倾斜箱体，通过接种孔导出洗涤液即获得浓缩纯培养菌液。

所述的需氧菌或兼性需氧菌的简易批量培养方法，细菌在多层方盘固体培养基上发酵培养，采用一次性注入培养基、一次性灭菌、一次性形成多层培养表面、一次性接种、一次性洗涤收获。

为防止产品污染，通过无菌操作采用注射针头、胶管连接和过滤空气箱体内增压的方法，将浓缩菌液导入容器中，获得无污染的浓缩纯培养菌液。

箱体中残留的培养基，通过加热或高温灭菌后，在培养基降温凝固前通过接种孔倒出，注水冲洗，将接种孔倒置、淋干备用。

本发明是将实验室中细菌的琼脂平板培养方法进行有效放大。在实验室常用的平皿或茄形瓶琼脂平板培养细菌的方法，因其有效培养面积较小，仅应用于小批量细菌培养，不适用于细菌的大量生产制备。1个密封箱体多层方盘的有效培养面积约为30000 cm²，相当于200个规格为500ml茄形瓶的培养面积或468个直径为9 cm平皿的培养面积。密封箱体多层方盘培养技术在大批量需氧菌或兼性需氧菌生产制备中具有显著的应用优势。

本发明的有益效果在于：本发明的设备简单、成本低廉、操作方便、不易污染、生产效率高，与传统发酵罐液体发酵培养方法相比，其培养效率可提高50倍以上，细菌浓度可高达1500~2000亿个/ml，降低生产成本50%以上；解决了在需氧菌或兼性需氧菌的批量生产制备过程中普遍存在生产效率低、菌液浓缩困难、污水排放多或生产成本高等瓶颈问题。

附图说明

图1为方盘的结构示意图；

图2为密封培养箱部分分解结构示意图；

图3为密封培养箱整体结构分解结构示意图；

图中，10—方盘，20—箱体，30—密封胶垫，40—密封盖，410—锁闭螺丝，50—接种孔。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

福建某动物微生态制剂厂，曾应用液体发酵罐通气发酵方法生产大肠埃希氏菌C600，生产工艺较为复杂，离心浓缩过程中的人工劳动繁重，易受杂菌污染，生产效率低下。也曾改用茄形瓶营养琼脂平面培养，显著降低了原材料消耗，因其有效培养面积较小，人工劳动繁重，操作环节繁琐、污染机率高，生产效率受到限制。应用本发明的密封箱体多层方盘固体平面发酵培养技术，设备简单，投入少，生产工艺简化，产品污染机会减少，降低了生产成本，减少了污水排放，生产效率显著提高，连续生产液体微生态制剂成品200余吨，取得了良好的效益。

现以生产10 L浓度为1500亿个/ml的大肠埃希氏菌（C600）浓缩菌液为例，对上述三种培养方法进行比较如下：

实施例1液体发酵罐通气培养发酵

1)设备

500 L发酵罐；超净工作台（1400×690×520mm）；大容量冷冻离心机（DL-4000B，500 ml×6)。

2)培养基制备

普通肉汤培养基：蛋白胨5 kg、牛肉膏1.5 kg、氯化钠2.5 kg、蒸馏水500 L（牛肉膏、蛋白胨为北京奥博星生物公司生产）。

混匀培养基后，用10%氢氧化钠调节至pH7.4，发酵罐以121℃高压灭菌15 min，冷却备用（氯化钠为市售分析纯试剂）。

3)接种培养

通过无菌术式接入大肠埃希氏菌C600菌种100 ml，菌种浓度为5亿个/ml，发酵罐底部通入无菌超滤空气，打开发酵罐顶部的无菌超滤排气孔，37 ℃通气培养36 h，细菌浓度达到30亿个/ml。

4)菌液浓缩

细菌培养液的分装在超净工作台上进行，将培养菌液分别、多次导出至塑料离心瓶中，离心机每次离心容量为3000 ml(500 ml×6)，密封离心瓶后，分别置于离心杯中、对角离心杯平衡。4000 rpm离心沉淀10 min弃上清，取60 ml灭菌生理盐水依次洗涤6个离心瓶中的沉淀物，获得约60 ml浓度为1500亿个/ml的浓缩菌液。500 L发酵培养菌液,共累计离心167次，收集洗涤液，获得约10 L浓度为1500亿个/ml的浓缩菌液。

5)主要设备投资、生产成本

设备：10.2万元（发酵罐4.8万元；超净工作台1.2万元；大容量冷冻离

心机4.2万）。

培养基：1480元（蛋白胨5 kg×200元；牛肉膏1.5 kg×300元；氯化钠

2.5 kg×12元）。

水电费：591元（灭菌15 KV×3 h×1元；培养1 KV×36/2 h×1元；

离心1 KV×167/6 h×1元；蒸馏水500 L×1元）。

人员工资：800元（2人×2 d×200元）。

6)废物排放

废弃培养基500 L；器具洗刷用水200 L。

实施例2 茄形瓶营养琼脂平面培养

1) 设备器材

卧式矩形压力蒸汽灭菌器（规格：30L，1018×500×600mm）；恒温培养箱（规格：610×530×1360 mm）；超净工作台（规格：1400×690×520mm）；大容量振荡器；茄形瓶（规格：500ml）；

2)培养基制备

营养琼脂培养基：蛋白胨0.1 kg；牛肉膏0.03 kg；氯化钠0.05 kg；琼脂0.15 kg；蒸馏水10 L。

混匀培养基，用10%氢氧化钠调节至pH7.4，分装至200个茄形瓶中，每瓶50 ml，用硅胶塞密封瓶口，置121 ℃高压灭菌15 min，待温度降至50℃~60℃，震荡茄形瓶混匀培养基，水平放置，待琼脂降温凝固，形成厚度为3mm~5mm营养琼脂凝胶备用。

3) 接种培养

借助超净工作台，通过无菌术式，每个茄形瓶接入大肠埃希氏菌C600菌种3 ml，菌种浓度为5亿个/ml，硅胶塞密封瓶口。倾斜、摇动茄形瓶，使菌种充分涂布于琼脂培养基表面，置37 ℃培养36 h, 待菌种生长形成菌苔。

4)菌液收集

通过无菌术式每个茄形瓶注入灭菌生理盐水50ml，密封瓶口后将茄形瓶稳定于振荡机上，50次/min震荡15 min，充分洗涤菌苔，导出洗涤液至无菌容器，获得约10 L浓度为1500亿个/ml的浓缩菌液。

5)主要设备投资、生产成本

设备器材：6.7万元（蒸汽灭菌器2.8万元；恒温培养箱2万元；超净工作台1.2万元；大容量振荡器0.3万元；茄形瓶200×20元）

培养基：44.6元（蛋白胨0.1 kg×200元；牛肉膏0.03 kg×300元；氯化

钠0.05 kg×12元；琼脂0.15 kg×100元）。

水电费：103元（灭菌5 KV×3 h×5次×1元；培养1 KV×36/2 h×1元；

蒸馏水10 L×1元；器材洗刷用自来水1000 L）。

人员工资：1200元（2人×3 d×200元）。

6)废物排放

废弃培养基10 L；器具洗刷用水1000 L。

实施例3 密封箱体多层方盘固体平面培养

1) 设备

卧式矩形压力蒸汽灭菌器（规格：30L，1018×500×600 mm）；恒温培养箱（规格：750×600×600 mm）；超净工作台（规格：1400×690×520 mm）；大容量振荡器；不锈钢密封箱体多层方盘，包括：不锈钢方盘12个，长宽高60×45×2.0㎝；不锈钢密封箱体1个，长宽高60×45×24㎝；密封盖1个，长宽49×28㎝，密封盖表面对角处分别设置2个可用硅胶塞密封的接种孔操作，借助硅胶垫将密封盖和箱体连接，用螺栓锁闭密封（注：密封箱体大小以将能容纳12个层叠的不锈钢方盘为准，见附图）。

2)培养基制备

营养琼脂培养基：蛋白胨0.1 kg；牛肉膏0.03 kg；氯化钠0.05 kg；琼脂0.15 kg；蒸馏水10 L。

将培养基混匀，用10%氢氧化钠调节至pH7.4，通过密封箱的接种孔将培养基注入密封箱，用硅胶塞密封接种孔，置121 ℃高压灭菌15 min，待箱体温度降至50℃～60℃，震荡箱体混匀培养基，以方盘位置为基准竖立箱体静置片刻，使琼胶从缝隙中流入方盘，然后快速水平放置箱体并使方盘朝上，使融化的营养琼脂均匀分布于每个方盘中，待琼脂降温凝固，形成厚度为3 mm～5 mm营养琼脂凝胶备用。

3) 接种培养

借助超净工作台，通过无菌术式经密封箱的接种孔接入大肠埃希氏菌C600菌种1000 ml，菌种浓度为5亿个/ml，硅胶塞密封接种孔。以方盘位置为基准竖立箱体静置片刻使菌液从缝隙中流入方盘，待菌种液面平衡稳定，快速水平放置箱体并使方盘朝上，轻轻倾斜、往返震荡箱体使液体菌种充分涂布于琼脂培养基表面，置37 ℃培养36 h, 使菌种生长形成菌苔。

4)菌液收集

通过无菌术式经密封箱的接种孔注入灭菌生理盐水10 L，密封接种孔后将箱体置于振荡机上，50次/min震荡15 min，充分洗涤菌苔，导出洗涤液至无菌容器，获得约10 L浓度为1500亿个/ml的浓缩菌液。

5)主要设备投资、生产成本

设备器材：5.5万元（蒸汽灭菌器2.8万元；恒温培养箱1万元；超净工作台1.2万元；大容量振荡器0.3万元；密封箱体多层方盘2000元）

培养基：44.6元（蛋白胨0.1 kg×200元；牛肉膏0.03 kg×300元；氯化钠0.05 kg×12元；琼脂0.15 kg×100元）。

水电费：34元（灭菌5KV×3 h×1元；培养0.5 KV×36/2 h×1元；蒸馏水10 L×1元；器材洗涤用自来水200 L）。

人员工资：200元（1人×1 d×200元）。

6)废物排放

废弃培养基10 L；器材洗刷用自来水200 L。

将实施例1、实施例2、实施例3的三种发酵培养方法进行比较

发酵罐液体培养方法，设备投入高(10.2万元)，发酵培养工艺简单，原料成本较高，菌液浓缩工艺繁琐、人员劳动强度大、产品易污染，材料消耗成本高。

茄形瓶营养琼脂平面培养方法，设备投入较高(6.7万元)，发酵培养、收获工艺繁琐、人员劳动强度大、产品易污染，材料消耗成本较低。

多层方盘固体平面培养方法，设备投入较低(5.5万元)，发酵培养、收获工艺简单，人员劳动强度低，产品污染机率低，材料消耗成本较低。具体见表1。

表1 三种发酵培养方法生产10 L浓缩菌液主要成本比较表

                                                 

实施例4

通辽市某大型养猪场因生产需要，培养大量大肠杆菌k88、k99基因工程菌，利用液体培养方法和茄形瓶营养琼脂平面培养方法，但产品污染较多，培养物的成品率较低，不能满足生产需求。应用多层方盘固体平面培养方法后，降低了人员劳动强度和产品污染机率，培养物的成品率显著提高，累计生产大肠杆菌k88、k99基因工程菌浓缩菌液数吨，取得了良好的生产效益。应用多层方盘固体平面培养制备大肠杆菌k88、k99基因工程菌的所需设备和具体操作方法如下：

1) 设备

卧式矩形压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、超净工作台、振荡器、不锈钢密封箱和多层方盘（包括：不锈钢方盘12个，长宽高60×45×2.0㎝；不锈钢密封箱体1个，长宽高60×45×24㎝；密封盖1个，长宽49×28㎝），密封盖表面对角处分别设置2个可用硅胶塞密封的接种孔操作，借助硅胶垫将密封盖和箱体连接，用螺栓锁闭密封。

2)培养基制备

营养琼脂培养基：蛋白胨0.1 kg；牛肉膏0.03 kg；氯化钠0.05 kg；琼脂0.15 kg；蒸馏水10 L。

将培养基各组分混匀，用10%氢氧化钠调节至pH7.4，通过密封箱的接种孔将培养基注入密封箱，用硅胶塞密封接种孔，置121 ℃高压灭菌15 min，待箱体温度降至50 ℃～60 ℃，震荡箱体混匀培养基，以方盘位置为基准竖立箱体静置片刻，使琼胶从缝隙中流入方盘，然后快速水平放置箱体并使方盘朝上，使融化的营养琼脂均匀分布于每个方盘中，待琼脂降温凝固，形成厚度为3 mm～5 mm 营养琼脂凝胶备用。

3) 接种培养

借助超净工作台，通过无菌术式经密封箱的接种孔接入大肠杆菌k88、k99基因工程菌菌种液1000 ml，菌种浓度保持5亿个/ml以上，硅胶塞密封接种孔。以方盘位置为基准竖立箱体静置片刻使菌液从缝隙中流入方盘，待菌种液面平衡稳定，快速水平放置箱体并使方盘朝上，轻轻倾斜、往返震荡箱体使液体菌种充分涂布于琼脂培养基表面，置37 ℃培养48 h, 使菌种生长形成菌苔。

4)菌液收集

通过无菌术式经密封箱的接种孔注入灭菌生理盐水10 L，密封接种孔后将箱体置于振荡机上，50次/min震荡15 min，充分洗涤菌苔，导出洗涤液至无菌容器，获得10 L浓度约为1500亿个/ml的浓缩菌液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。