一类海洋真菌来源的缩酚酸类化合物及其治疗II型糖尿病的应用

摘要

本发明属于药物化合物领域，具体公开了一类缩酚酸化合物及其治疗II型糖尿病的应用。所述缩酚酸化合物的结构式如式（Ⅰ）所示。化合物 1–6能显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其IC

说明书

技术领域

本发明涉及药物化合物领域，具体涉及海洋真菌来源的药物化合物，更具体 地，涉及一类海洋真菌来源的缩酚酸类化合物及其治疗II型糖尿病的应用。

背景技术

目前，全球范围内的II型糖尿病患病人数超过3.7亿人，而且患者的人数还正 在快速增长。该增长与经济发展、人口老龄化、日益城市化、饮食习惯改变、体 力活动减少和其他生活方式的改变有关。因而，II型糖尿病被认为是21世纪全 球各国公共卫生安全最严峻的挑战之一。在II型糖尿病中，机体能够产生胰岛素， 但因胰岛素分泌相对不足或作用缺陷(也称为胰岛素抵抗)，导致血糖升高。而 α-葡萄糖苷酶是治疗早期II型糖尿病的一种重要的靶标。它是一类能够从含有α- 葡萄糖苷键底物的非还原端催化水解α-葡萄糖基的酶的总称。α-葡萄糖苷酶广泛 分布于生物体中，参与食物消化、糖蛋白的生物合成，多糖及糖复合物的合成与 分解代谢等许多生物过程。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸 收而达到治疗糖尿病的口服降糖药，其作用原理是：竞争性抑制位于小肠的各种 α-葡萄糖苷酶，使分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，改 善餐后血糖的高峰。研究证实，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以防治餐后高血糖症和缓 解高胰岛素血症，同时可以提高糖耐量。当前，临床用药的α-葡萄糖苷酶抑制剂 主要有阿卡波糖和伏格列波糖。为了避免或减少当前药物的不良副作用或耐药 性，同时提供更多候选药物，因此寻找新的α-葡萄糖苷酶抑制剂并发展成为药 物是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于针对目前II型糖尿病治疗药物存在的缺陷，提供一类海 洋真菌来源的缩酚酸类化合物。

本发明的另一个目的是提供一类海洋真菌来源的缩酚酸类化合物的制备方 法。

本发明的在一个目的是提供一类海洋真菌来源的缩酚酸类化合物在制备治 疗II型糖尿病药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一类海洋真菌来源的缩酚酸类化合物，其结构式如式(Ⅰ)所示：

所述缩酚酸类化合物1–6是从海洋真菌Meyerozyma sp.HZ-Y2的发酵液中 分离获得的；所述海洋真菌Meyerozyma sp.HZ-Y2于2015年4月6日保藏在中 国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC  NO：M 2015203。

优选地，上述缩酚酸类化合物的制备方法如下：

S1.将海洋真菌Meyerozyma sp.HZ-Y₂接入种子培养基，摇床培养，得到种 子培养液；

S2.将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养；

S3.将发酵产物过滤得到菌体，菌体用甲醇浸泡，减压浓缩，得到浸膏，再 经层析分离，得到缩酚酸类化合物1–6。

作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤S1所述种子培养基的组分为： 马铃薯200g，葡萄糖20g，水1L。

作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤S2所述发酵培养基的组分为： 东北大米7000g，海盐210g，水7L。

作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤S1所述摇床培养条件为：转速 200rpm，温度28℃，培养时间72h。

作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤S2所述静置培养温度为25℃， 培养时间为28天。

作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤S3所述浸膏用硅胶柱层析进行 分离，分离用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、100％的乙酸 乙酯/石油醚梯度淋洗。

浸膏经层析分离时，第6组分采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体 积比为1：1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱，再用硅胶柱层，25％乙酸乙酯-石油 醚为洗脱剂，获得化合物2和6。第8组分采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析， 用体积比为甲醇为洗脱剂进行洗脱，再用硅胶柱层，30％乙酸乙酯-石油醚为洗 脱剂，获得化合物3和4。第15组分采用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用 体积比为1：1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱，再用半制备反相高效液相色谱制 备得到化合物1和5。

本发明的缩酚酸类化合物1-6对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，可用于制备α-葡 萄糖苷酶抑制剂药物，治疗II型糖尿病。因此，本发明要求保护缩酚酸类化合 物1-6在制备治疗II型糖尿病药物中的应用。另外，本发明还保护缩酚酸类化合 物1-6在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明从广东惠州海域红树植物秋茄的根部分离获得一株真菌Meyerozyma  sp.HZ-Y₂，并从该菌株的发酵液中首次分离获得一类缩酚酸类化合物1–6，这些 化合物具有显著抑制α-葡萄糖苷酶活性，在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物，治疗 II型糖尿病中具有良好的市场前景。另外，本发明的缩酚酸类化合物1–6来源于 海洋真菌，从真菌提取分离的方法简单，成本低廉。

附图说明

图1为化合物1的α-葡萄糖苷酶抑制作用的双倒数酶动力学曲线。

图2为化合物3的α-葡萄糖苷酶抑制作用的双倒数酶动力学曲线。

图3为化合物5的α-葡萄糖苷酶抑制作用的双倒数酶动力学曲线。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实 施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试 验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明， 为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

本发明海洋真菌Meyerozyma sp.HZ-Y₂是从广东惠州海域红树植物秋茄的 根部分离得到，分离方法参考本领域常规分离方法。分离后将海洋真菌 Meyerozyma sp.HZ-Y₂于2015年4月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏 地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015203。

从海洋真菌Meyerozyma sp.HZ-Y₂的发酵液中分离获得缩酚酸类化合物，具 体步骤如下：

S1.种子培养：

S11.配制种子培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1L，平均分装于5 个500mL锥形瓶，121℃灭30分钟。

S12.种子的培养：将海洋真菌Meyerozyma sp.HZ-Y₂的菌株接入种子培养基， 在28℃的温度下，置摇床上以200rpm的转速，培养72小时得种子培养液。

S2.发酵培养：

S21.配制发酵培养基：东北大米7000g，海盐210g，自来水水7L，121℃灭 30分钟。

S22.发酵培养：无菌操作将种子液5mL接入装有发酵培养基的锥形瓶中， 于25℃静置培养28天。

S3.提取分离：

发酵物用甲醇浸泡，浸泡液在低于50℃下减压浓缩得浸膏12.2g。该浸膏经 硅胶柱层析进行分离，分别用10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％， 100％的乙酸乙酯-石油醚梯度淋洗，分成30组分。其中第6组分采用葡聚糖凝 胶Sephadex LH-20层析，用体积比为1：1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱，再 用硅胶柱层，25％乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂，获得化合物2和6。第8组分采用 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体积比为甲醇为洗脱剂进行洗脱，再用硅 胶柱层，30％乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂，获得化合物3和4。第15组分采用葡 聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体积比为1:1的甲醇-氯仿为洗脱剂进行洗脱， 再用半制备反相高效液相色谱制备得到化合物1和5。

实施例2

对实施例1中的化合物进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：

化合物1：淡黄色粉末，熔点146-147℃(温度计未校正)，EI-MS(m/z)： 288[M]⁺。

化合物2：淡黄色针状晶体，熔点165-166℃(温度计未校正)，EI-MS(m/z)： 300[M]⁺。

化合物3：白色粉末，熔点147-148℃(温度计未校正)，EI-MS(m/z)： 302[M]⁺。

化合物4：淡黄色粉末，熔点143-144℃(温度计未校正)，EI-MS(m/z)： 316[M]⁺。

化合物5：淡黄色油状物，EI-MS(m/z)：302[M]⁺。

化合物6：淡黄色针状晶体，熔点169-170℃(温度计未校正)，EI-MS(m/z)： 314[M]⁺。

化合物1–3的NMR数据见表1，4–5的NMR数据见表2。

表1化合物1–3的NMR数据(100MHz/400MHz，TMS，ppm)

表2化合物4–6的NMR数据(100MHz/400MHz，TMS，ppm)

根据以上数据，得知化合物1–6的结构式如式(Ⅰ)所示：

实施例3

对实施例1中的化合物1–6进行α-葡萄糖苷酶抑制实验：

采用对硝基苯酚-α-葡萄糖苷(pNPG)为底物，在0.01M磷酸缓冲液(pH＝7.0) 中进行。pNPG被α-葡萄糖苷酶酶解为对硝基苯酚，用紫外-可见分光光度计在 400nm波长处测量其吸光度的变化而计算酶的活性。样品和阳性对照(阿卡波糖) 均配成DMSO溶液(均为10μmol/mL)，酶和底物用0.01M磷酸缓冲液配成适 宜浓度溶液，1mL初始反应体系内含0.1unit酶，20μL底物，20μL DMSO。取适 量酶液，加入空白DMSO溶液或样品的DMSO溶液，混匀，37℃下，恒温20分 钟，加入底物，混匀，立即在400nm波长处检测1min内体系的吸光度的变化 值。用如下公式来计算酶活性：抑制率(％)＝[(B–S)/B]×100％，其中B为加 空白DMSO时的吸光度变化值，S为样品的吸光度变化值。测定5个浓度的样 品，绘制剂量—抑制率曲线，得出其IC₅₀值。每个样品重复测定三次，结果用平 均值±标准偏差表示。

结果测得化合物1–6能显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其IC₅₀值分别为 10.4μM，13.3μM，2.1μM，12.4μM，9.8μM和11.7μM，其中阳性对照阿卡波 糖的IC₅₀为553.7μM。此外3组抑制剂浓度下的抑制双倒数曲线如图1～3所示, 反应速度Vmax随抑制剂浓度增大而变小，而在不同抑制剂浓度下α-葡萄糖苷 酶的米氏常数(Km)保持不变,双倒数曲线交于横坐标上,是典型的非竞争性 抑制动力学曲线。因此，化合物1,3和5都是非竞争性抑制剂。