一种原位检测单个活细胞内细胞器中CO

摘要

本发明公开了一种原位检测单个活细胞内细胞器中CO

说明书

技术领域

本发明涉及一种原位检测单个活细胞内细胞器中CO₂生成速率的方法，属于生物荧光标记与细胞生物学领域。

背景技术

细胞作为所有生物体内最小的功能和结构单元，其内部不停地进行着新陈代谢过程，而这一过程又与二氧化碳的循环密切相关。细胞内二氧化碳的含量在呼吸作用、核酸碱基对的形成、血液pH值的平衡、基因复制、细胞增殖及癌变等过程中起着至关重要的作用。细胞内各细胞器起着独一无二的生理作用，如线粒体行使着呼吸作用、提供能量的中转站，内质网负责运输和贮藏蛋白质，高尔基体与细胞的分泌过程密切相关，而溶酶体则作为“消化车间”分解衰老损伤的细胞器、吞噬并杀死侵入细胞的病毒和病菌等。因此，原位检测细胞内各细胞器中二氧化碳的生成速率对细胞器功能的深入研究、疾病的早期诊断和物种的进化有着十分重要的意义。

目前，大多数文献已报道，在气体混合物中检测二氧化碳的含量，如大气、海洋生态系统、天然气的燃烧等。其中，电化学和红外分析方法是两种探测二氧化碳的最常见方法，然而这两种方法由于对水较敏感而不适用于潮湿的环境下，因而更不能用于生物体系中二氧化碳的检测。另外，荧光蛋白、无机量子点等作为一种新型的荧光探针近年来被广泛用于活细胞成像，但由于对细胞的高毒性及对二氧化碳的无明显响应等问题而无法用于原位检测细胞内各细胞器新陈代谢的过程。(Cummins,E.P.；Selfridge,A.C.；Sporn,P.H.Sznajder,J.I.；Taylor,C.T.Cell Mol.Life Sci.,2014,71,831-845.Liu,Y.；Tang,Y.H.；Barashkov,N.N.；Irgibaeva,I.S.；Lam,J.W.Y.；Hu,R.R.；Birimzhanova,D.；Yu,Y.；Tang,B.Z.J.Am.Chem.Soc.,2010,132,13951-13953.Carballal,S.；Bartesaghi,S.；Radi,R.Biochimica et Biophysica Acta,2014,1840,768-780.Ali,R.；Lang,T.；Saleh,S.M.；Meier,R.J.；Wolfbeis,O.S.Anal.Chem.,2011,83,2846-2851.Guo,C.X.；Ng,S.R.；Khoo,S.Y.；Zheng,X.T.；Chen,P.；Li,C.M.Acs Nano.,2012,6,6944-6951.Waldrop,G.L.；Holden,H.M.；Maurice,M.S.Protein Science,2012,21,1597-1619.Guais,A.；Brand,G.；Jacquot,L.；Karrer,M.；Dukan,S.；Grevillot,G.；Molina,T.J.；Bonte,J.；Regnier,M.；Schwartz,L.Chem.Res.Toxicol.,2011,24,2061-2070)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种原位检测单个活细胞内细胞器中CO₂生成速率的方法，所述方法采用一种含有4,4',4”-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基)乙酯(TPP-TMAE)的荧光探针对活细胞各细胞器的新陈代谢过程进行检测，所述荧光探针用于活细胞荧光成像的同时可原位定量检测单个细胞内各细胞器二氧化碳的生成速率，并能有效甄别癌细胞和正常细胞。

本发明的目的由以下技术方案实现：

一种原位检测单个活细胞内细胞器中CO₂生成速率的方法，所述方法具体步骤如下：

(1)将TPP-TMAE溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为1×10^-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入高糖DMEM培养基，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液b；

所述TPP-TMAE为4,4',4”-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基)乙酯的简写，TPP-TMAE的结构式如下：

(2)将细胞器染料溶解于三蒸水中，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液c；

(3)将细胞传代至两组培养皿中，将培养皿置于培养箱中培养至细胞数达5×10⁵±0.05×10⁵个，移除培养基，洗涤；向其中一组培养皿中加入体积为v₁的溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养15～30min，移除溶液c，洗涤，加入体积为v₂的高糖DMEM培养基，得到待测样品1；向另外一组培养皿中加入体积为v₁的溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养15～30min，移除溶液c，洗涤，加入体积为v₁的溶液b，5秒后移除溶液b，洗涤，加入体积为v₂的质量浓度为4％的多聚甲醛溶液，静置10min，洗涤，加入1mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，得到含有失活细胞的待测样品2；

其中，所述培养皿为激光共聚焦显微镜专用底部带玻片培养皿，外径为20mm

所述培养箱培养环境：温度为37℃、CO₂的体积分数为5％；一组培养皿为3～5个；

所述洗涤采用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，洗涤次数为2～3次；所述PBS溶液为pH＝7.4的磷酸盐缓冲液的简称；所述v_1:v₂为1:10；

(4)向待测样品1中加入体积为v₁的溶液b，每间隔1h测试一次待测样品1中细胞内各细胞器的荧光强度，共测试6～10次；并根据测试结果绘制单个细胞细胞器内荧光强度变化率随时间t的变化曲线，得到曲线一；

其中，加入溶液b时，需保持待测样品1位置不变；

待测样品1中单个细胞细胞器内荧光强度变化率＝(I_i-I₀)/I₀，I₀表示单个细胞细胞器内的初始荧光强度，I_i表示第i次检测时单个细胞细胞器内的荧光强度，i为1～5的正整数；

(5)先测试出待测样品1中细胞内细胞器的初始荧光强度；再分次向待测样品2中注入气体，测试每次注入气体后待测样品2中失活细胞内各细胞器的荧光强度；其中，每次每个待测样品2中注入气体的体积为1μL，气体的注入总量为20μL；根据测试结果绘制待测样品2中失活细胞通入气体后单个细胞器的荧光强度变化率随通入气体体积的变化曲线，得到曲线二；

其中，所述气体为CO₂与空气的混合气体，CO₂与空气的体积比1:1；

待测样品2中失活单个细胞细胞器内荧光强度变化率＝(I′_k-I′₀)/I′₀，I′₀表示失活单个细胞细胞器内的初始荧光强度，I′_k表示第k次通入气体后失活单个细胞细胞器内的荧光强度，k为1～20的正整数；

(6)根据步骤(4)、(5)待测样品1和待测样品2中细胞内各细胞器荧光强度的测试结果计算单个细胞内各细胞器新陈代谢过程中CO₂含量，具体为：

当曲线一和曲线二中的荧光变化率相同时，分别得到曲线一中对应的时间t和曲线二中对应的通入气体的体积v；所述体积v中失活细胞内CO₂气体的含量即为单个细胞细胞器在时间t内自身新陈代谢产生的CO₂的量；

所述失活细胞内含有的CO₂气体的体积的测试方法如下：

(a)将细胞传代至一组培养皿中，将培养皿置于培养箱中培养8～20h，洗涤，加入1mL质量百分含量为4％的多聚甲醛溶液，静置10min，洗涤，加入1mL PBS溶液，向各培养皿中通入0～20μL¹³CO₂与空气的混合气体，立即用PBS溶液离心洗三次，去除上清液，收集细胞，冷冻抽真空干燥，得到含有失活细胞的待测样品3；

其中，¹³CO₂与空气的体积比为1:1；

所述培养箱培养环境：温度为37℃、CO₂的体积分数为5％；一组培养皿的个数为21个；

所述离心的转数优选1000rpm，离心时间优选10min；

(b)用同位素法测定待测样品3的失活细胞中¹³C的含量，从而得到通入CO₂后进入失活细胞内的CO₂气体的含量；

其中，步骤(4)和步骤(5)中所述荧光强度的测试均采用激光共聚焦显微镜；

步骤(2)所述细胞器染料优选线粒体染料、内质网染料、高尔基体染料和溶酶体染料中的一种；

步骤(3)所述细胞优选人子宫颈癌细胞(HeLa cell)、人乳腺癌细胞(MCF-7cell)和CD1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF cell)中的一种。

有益效果：

(1)本发明所述方法采用的TPP-TMAE对HeLa cell、MCF-7 cell及正常细胞模型MEF cell内各细胞器代谢产生的二氧化碳具有特异性荧光响应；可定量检测癌细胞及正常细胞细胞器中新陈代谢产生的二氧化碳的速率；

(2)本发明所述方法采用TPP-TMAE对同一个细胞中不同细胞器(线粒体(mitochondria)、内质网(endoplasmic reticulum)、高尔基体(golgi apparatus)、溶酶体(lysosome))代谢产生的二氧化碳荧光响应不同，说明同一个细胞中不同细胞器代谢产生二氧化碳速率不同，可用于比较各细胞器新陈代谢过程的快慢，并有效鉴别出新陈代谢过程的主要细胞器；

(3)本发明所述方法采用TPP-TMAE对癌细胞(HeLa cell、MCF-7 cell)和正常细胞(MEF cell)内同一细胞器代谢产生的二氧化碳的速率不同，导致荧光响应明显不同，能有效甄别癌细胞和正常细胞；

(4)本发明所述方法采用TPP-TMAE对细胞内细胞器代谢产生二氧化碳荧光响应时，与细胞器染料不发生任何化学或物理反应，说明采用细胞器染料进行标定特定细胞器时不会影响本荧光探针的任何性质，即本发明所述方法采用的荧光探针可与细胞器染料共同作用于细胞。

附图说明

图1为实施例中待测样品2中通入CO₂后，失活细胞内CO₂含量与通入CO₂体积的关系；

图2为实施例中活的HeLa cell内线粒体和内质网内的荧光强度的变化与时间的关系；

图3为实施例中活的HeLa cell内高尔基体和溶酶体内的荧光强度的变化与时间的关系；

图4为实施例中活的MCF-7 cell内线粒体和内质网内的荧光强度的变化与时间的关系；

图5为实施例中活的MCF-7 cell内高尔基体和溶酶体内的荧光强度的变化与时间的关系；

图6为实施例中活的MEF cell内线粒体和内质网内的荧光强度的变化与时间的关系；

图7为实施例中活的MEF cell内高尔基体和溶酶体内的荧光强度的变化与时间的关系。

图8为实施例中失活细胞内荧光强度的变化与通入CO₂体积的关系。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来详述本发明，但不限于此。

以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。

表1

表2

以下实施例中所述t均表示时间；所述TPP-TMAE为4,4',4”-(1H-吡咯-1,2,5-三基)三苯甲酸(2-二甲氨基)、乙酯的简写，TPP-TMAE的结构式如下：

实施例1

(1)将0.64mg TPP-TMAE溶解于的0.01mL二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为1×10^-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入10mL高糖DMEM培养基，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液b。

(2)为了检测TPP-TMAE在单个活细胞(人子宫颈癌细胞(HeLa cell)、人乳腺癌细胞(MCF-7 cell))和CD1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF cell))内线粒体新陈代谢过程中荧光强度的变化与时间关系，做了如下实验：

(a)将线粒体染料(Red FM)稀释于三蒸水中，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液c；

(b)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中；在37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱中培养8h，用血球计数板计数，此时HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell的个数均为5×10⁵±0.05×10⁵个，用移液枪移除培养皿中的培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，然后向培养皿中加入100μL溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养15min，用移液枪移除溶液c，用PBS冲洗3次，加入1mL高糖DMEM培养基，得到待测样品1；

其中，每组培养皿为5个；

(c)将待测样品1放置在激光共聚焦显微镜下观察，对准细胞的焦平面后，保持待测样品1位置不变，用200μL移液枪加入100μL溶液b，立即测试出待测样品1中细胞内线粒体的初始荧光强度I₀，然后每隔1小时测一次线粒体的荧光强度I_i，共测试6次；

(d)根据步骤(c)测试结果绘制出时间-待测样品1在细胞线粒体中荧光强度关系图，如图2、4、6所示，从图中可知，在三种细胞系的线粒体中，待测样品1中细胞内线粒体的荧光强度随着时间的增加而降低，且荧光强度随时间的变化呈现出较好的线性关系，具体为：HeLa cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.0274t-0.0041,R²＝0.997；MCF-7 cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.0016t+0.0201,R²＝0.9924；MEF cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.0003t-0.0018,R²＝0.998；其中，(I_i-I₀)/I₀表示待测样品1中单个细胞线粒体内荧光强度变化率；其中，i为1～5的正整数。

(3)为了检测TPP-TMAE在失活细胞(HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell)内线粒体新陈代谢过程中荧光强度的变化与二氧化碳体积关系，做了如下实验：

(a)将线粒体染料(Red FM)稀释于三蒸水中，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液c；

(b)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中，在37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱中培养8h，移除培养皿中的培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，然后向培养皿中加入100μL溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养15min，移除溶液c，用PBS冲洗3次，加入100μL溶液b，5秒后立即移除溶液b，并用PBS冲洗3次，加入1mL质量浓度为4％的多聚甲醛溶液，静置10min后用PBS洗3次，加入1mL PBS溶液，此时细胞失活，得到含有失活细胞的待测样品2；

其中，每组培养皿为5个；

(c)将待测样品2放置于激光共聚焦显微镜下，先测试出待测样品2中细胞内线粒体的初始荧光强度I′₀；再分次向待测样品2注入CO₂与空气的混合气体，测试每次注入气体后待测样品2中单个失活细胞内线粒体的荧光强度I′_k；其中，CO₂与空气的体积比为1:1；每次注入气体的体积为1μL，气体的注入总量为20μL；

(d)根据测试结果绘制待测样品2中失活细胞通入气体后单个线粒体的荧光强度变化率随通入气体体积的变化曲线，如图8所示，三种失活细胞外界通入CO₂与空气的混合气体后线粒体内荧光强度的变化与通入二氧化碳体积在一定范围内有一定线性关系：HeLa cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0159×[CO₂]-0.0106，R′²＝0.9953；MCF-7 cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0071×[CO₂]-0.0049，R′²＝0.9963；MEF cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0072×[CO₂]+0.0029，R′²＝0.9972。

所述[CO₂]为向待测样品2中通入二氧化碳的体积，R与R′均代表线性相关度；其中，k为1～20的正整数。

(4)为了检测通入CO₂后进入失活HeLa cell、失活MCF-7 cell和失活MEFcell内CO₂的含量，做了如下实验：

(a)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中，在温度37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱培养8h，移除培养皿中培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞三次，然后加入1mL质量百分含量为4％的多聚甲醛溶液，静置10min后用PBS洗三次，加入1mL PBS溶液，此时细胞失活，向各培养皿中通入0～20μL ¹³CO₂与空气的混合气体，通入后立即用PBS离心洗三次，去除上清液，收集细胞，冷冻抽真空干燥，得到含有失活细胞的待测样品3。

其中，一组培养皿的个数为21个；¹³CO₂与空气的体积比为1:1；所述离心的转数为1000rpm，离心时间为10min；

(b)用同位素法测定待测样品3的失活细胞中¹³C的含量，通过计算绘制出细胞内进入CO₂含量与通入CO₂体积的关系曲线，如图1所示，两者具有一定的线性关系：HeLa cell:m_13C＝0.0180×[CO₂]+0.6687,R²＝0.9978；MCF-7 cell:m_13C＝0.0192×[CO₂]+0.2723,R²＝0.9978；MEF cell:m_13C＝0.0008×[CO₂]+0.0597,R²＝0.9945。m_13C为进入细胞内CO₂含量，[CO₂]为向待测样品2中通入二氧化碳的体积，R代表线性相关度。

通过对比待测样品1中活细胞内线粒体自身新陈代谢产生CO₂导致荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞通入CO₂气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化，得到待测样品1中细胞内线粒体自身新陈代谢产生CO₂导致荧光强度变化率与待测样品2中失活细胞通入气体后的荧光强度变化率相同时分别对应的时间t以及通入气体的体积v；所述体积v中失活细胞线粒体内含有CO₂气体的体积即为活细胞线粒体在时间t内自身新陈代谢产生的CO₂的体积；

待测样品1和待测样品2中细胞用血球计数板计数，HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell的个数均为5×10⁵±0.05×10⁵个，根据待测样品1中活细胞内线粒体荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞荧光强度变化率随通入二氧化碳的体积的变化，计算出单个HeLa cell、MCF-7 cell、MEF cell线粒体每小时新陈代谢产生CO₂的速率分别为：HeLa cell:4.88×10^-6±5×10^-8μg/min；MCF-7 cell:2.56×10^-6±3×10^-8μg/min；MEF cell:4.12×10^-7±4×10^-9μg/min。

实施例2

(1)将0.64mg TPP-TMAE溶解于的0.01mL二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为1×10^-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入10mL高糖DMEM培养基，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液b。

(2)为了检测TPP-TMAE在单个活细胞(人子宫颈癌细胞(HeLa cell)、人乳腺癌细胞(MCF-7 cell))和CD1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF cell))内内质网新陈代谢过程中荧光强度的变化与时间关系，做了如下实验：

(a)将内质网染料(Green Assay Kit)稀释于三蒸水中，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液c；

(b)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中；在37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱中培养14h，用血球计数板计数，此时HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell的个数均为5×10⁵±0.05×10⁵个，用移液枪移除培养皿中的培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，然后向培养皿中加入100μL溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养20min，用移液枪移除溶液c，用PBS冲洗3次，加入1mL高糖DMEM培养基，得到待测样品1；

其中，每组培养皿为5个；

(c)将待测样品1放置在激光共聚焦显微镜下观察，对准细胞的焦平面后，保持待测样品1位置不变，用200μL移液枪加入100μL溶液b，立即测试出待测样品1中细胞内内质网的初始荧光强度I₀，然后每隔1小时测一次内质网的荧光强度I_i，共测试6次；

(d)根据步骤(c)测试结果绘制出时间-待测样品1在细胞内质网中荧光强度关系图，如图2、4、6所示，从图中可知，在三种细胞系的内质网中，待测样品1中细胞内内质网的荧光强度随着时间的增加而降低，且荧光强度随时间的变化呈现出较好的线性关系，具体为：HeLa cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.0023t-0.0015,R²＝0.9942；MCF-7 cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.0018t-0.0082,R²＝0.9961；MEF cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.0001t-0.0006,R²＝0.9933；其中，(I_i-I₀)/I₀表示待测样品1中单个细胞内质网内荧光强度变化率；其中，i为1～5的正整数。

(3)为了检测TPP-TMAE在失活细胞(HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell)内内质网新陈代谢过程中荧光强度的变化与二氧化碳体积关系，做了如下实验：

(a)将内质网染料(Green Assay Kit)稀释于三蒸水中，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液c；

(b)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中，在37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱中培养14h，移除培养皿中的培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，然后向培养皿中加入100μL溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养20min，移除溶液c，用PBS冲洗3次，加入100μL溶液b，5秒后立即移除溶液b，并用PBS冲洗3次，加入1mL质量浓度为4％的多聚甲醛溶液，静置10min后用PBS洗3次，加入1mL PBS溶液，此时细胞失活，得到含有失活细胞的待测样品2；

其中，每组培养皿为5个；

(c)将待测样品2放置于激光共聚焦显微镜下，先测试出待测样品1中细胞内内质网的初始荧光强度I′₀；再分次向待测样品2注入CO₂与空气的混合气体，测试每次注入气体后待测样品2中单个失活细胞内内质网的的荧光强度I′_k；其中，CO₂与空气的体积比为1:1；每次注入气体的体积为1μL，气体的注入总量为20μL；

(d)根据测试结果绘制待测样品2中失活细胞通入气体后单个内质网的荧光强度变化率随通入气体体积的变化曲线，如图8所示，三种失活细胞外界通入CO₂与空气的混合气体后内质网内荧光强度的变化与通入二氧化碳体积在一定范围内有一定线性关系：HeLa cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0159×[CO₂]-0.0106，R′²＝0.9953；MCF-7 cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0071×[CO₂]-0.0049，R′²＝0.9963；MEF cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0072×[CO₂]+0.0029，R′²＝0.9972。

所述[CO₂]为向待测样品2中通入二氧化碳的体积，R与R′均代表线性相关度；其中，k为1～20的正整数。

(4)为了检测通入CO₂后进入失活HeLa cell、失活MCF-7 cell和失活MEFcell内CO₂的含量，做了如下实验：

(a)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中，在温度37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱培养14h，移除培养皿中培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞三次，然后加入1mL质量百分含量为4％的多聚甲醛溶液，静置10min后用PBS洗三次，加入1mL PBS溶液，此时细胞失活，向各培养皿中通入0～20μL ¹³CO₂与空气的混合气体，通入后立即用PBS离心洗三次，去除上清液，收集细胞，冷冻抽真空干燥，得到含有失活细胞的待测样品3。

其中，一组培养皿的个数为21个；¹³CO₂与空气的体积比为1:1；所述离心的转数为1000rpm，离心时间为10min；

(b)用同位素法测定待测样品3的失活细胞中¹³C的含量，通过计算绘制出细胞内进入CO₂含量与通入CO₂体积的关系曲线，如图1所示，两者具有一定的线性关系：HeLa cell:m_13C＝0.0180×[CO₂]+0.6687,R²＝0.9978；MCF-7 cell:m_13C＝0.0192×[CO₂]+0.2723,R²＝0.9978；MEF cell:m_13C＝0.0008×[CO₂]+0.0597,R²＝0.9945。m_13C为进入细胞内CO₂含量，[CO₂]为向待测样品2中通入二氧化碳的体积，R代表线性相关度。

通过对比待测样品1中活细胞内内质网自身新陈代谢产生CO₂导致荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞通入CO₂气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化，得到待测样品1中细胞内内质网自身新陈代谢产生CO₂导致荧光强度变化率与待测样品2中失活细胞通入气体后的荧光强度变化率相同时分别对应的时间t以及通入气体的体积v；所述体积v中失活细胞内质网内含有的CO₂气体的体积即为活细胞内质网在时间t内自身新陈代谢产生的CO₂的体积；

待测样品1和待测样品2中细胞用血球计数板计数，HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell的个数均为5×10⁵±0.05×10⁵个，根据待测样品1中活细胞内内质网荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞荧光强度变化率随通入二氧化碳的体积的变化，计算出单个HeLa cell、MCF-7 cell、MEF cell线粒体每小时新陈代谢产生CO₂的速率分别为：HeLa cell:5.10×10^-6±5×10^-8μg/min；MCF-7 cell:2.78×10^-6±3×10^-8μg/min；MEF cell:4.06×10^-7±4×10^-9μg/min。

实施例3

(1)将0.64mg TPP-TMAE溶解于的0.01mL二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为1×10^-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入10mL高糖DMEM培养基，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液b。

(2)为了检测TPP-TMAE在单个活细胞(人子宫颈癌细胞(HeLa cell)、人乳腺癌细胞(MCF-7 cell))和CD1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF cell))内高尔基体新陈代谢过程中荧光强度的变化与时间关系，做了如下实验：

(a)将高尔基体染料(Red assay kit)稀释于三蒸水中，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液c；

(b)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中；在37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱中培养20h，用血球计数板计数，此时HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell的个数均为5×10⁵±0.05×10⁵个，用移液枪移除培养皿中的培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，然后向培养皿中加入100μL溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养30min，用移液枪移除溶液c，用PBS冲洗3次，加入1mL高糖DMEM培养基，得到待测样品1；

其中，每组培养皿为5个；

(c)将待测样品1放置在激光共聚焦显微镜下观察，对准细胞的焦平面后，保持待测样品1位置不变，用200μL移液枪加入100μL溶液b，立即测试出待测样品1中细胞内高尔基体的初始荧光强度I₀，然后每隔1小时测一次高尔基体的荧光强度I_i，共测试6次；

(d)根据步骤(c)测试结果绘制出时间-待测样品1在细胞高尔基体中荧光强度关系图，如图3、5、7所示，从图中可知，在三种细胞系的高尔基体中，待测样品1中细胞内高尔基体的荧光强度随着时间的增加而降低，且荧光强度随时间的变化呈现出较好的线性关系，具体为：HeLa cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.1665t-0.003,R²＝0.9986；MCF-7 cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.0922t-0.0134,R²＝0.9964；MEF cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.0138t+0.0016,R²＝0.9961；其中，(I_i-I₀)/I₀表示待测样品1中单个细胞高尔基体内荧光强度变化率；其中，i为1～5的正整数。

(3)为了检测TPP-TMAE在失活细胞(HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell)内高尔基体新陈代谢过程中荧光强度的变化与二氧化碳体积关系，做了如下实验：

(a)将高尔基体染料(Red assay kit)稀释于三蒸水中，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液c；

(b)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中，在37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱中培养20h，移除培养皿中的培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，然后向培养皿中加入100μL溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养30min，移除溶液c，用PBS冲洗3次，加入100μL溶液b，5秒后立即移除溶液b，并用PBS冲洗3次，加入1mL质量浓度为4％的多聚甲醛溶液，静置10min后用PBS洗3次，加入1mL PBS溶液，此时细胞失活，得到含有失活细胞的待测样品2；

其中，每组培养皿为5个；

(c)将待测样品2放置于激光共聚焦显微镜下，先测试出待测样品1中细胞内高尔基体的初始荧光强度I′₀；再分次向待测样品2注入CO₂与空气的混合气体，测试每次注入气体后待测样品2中单个失活细胞内高尔基体的荧光强度I′_k；其中，CO₂与空气的体积比为1:1；每次注入气体的体积为1μL，气体的注入总量为20μL；

(d)根据测试结果绘制待测样品2中失活细胞通入气体后单个高尔基体的荧光强度变化率随通入气体体积的变化曲线，如图8所示，三种失活细胞外界通入CO₂与空气的混合气体后高尔基体内荧光强度的变化与通入二氧化碳体积在一定范围内有一定线性关系：HeLa cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0159×[CO₂]-0.0106，R′²＝0.9953；MCF-7 cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0071×[CO₂]-0.0049，R′²＝0.9963；MEF cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0072×[CO₂]+0.0029，R′²＝0.9972。

所述[CO₂]为向待测样品2中通入二氧化碳的体积，R与R′均代表线性相关度；其中，k为1～20的正整数。

(4)为了检测通入CO₂后进入失活HeLa cell、失活MCF-7 cell和失活MEFcell内CO₂的含量，做了如下实验：

(a)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中，在温度37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱培养14h，移除培养皿中培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞三次，然后加入1mL质量百分含量为4％的多聚甲醛溶液，静置10min后用PBS洗三次，加入1mL PBS溶液，此时细胞失活，向各培养皿中通入0～20μL ¹³CO₂与空气的混合气体，通入后立即用PBS离心洗三次，去除上清液，收集细胞，冷冻抽真空干燥，得到含有失活细胞的待测样品3。

其中，一组培养皿的个数为21个；¹³CO₂与空气的体积比为1:1；所述离心的转数为1000rpm，离心时间为10min；

(b)用同位素法测定待测样品3的失活细胞中¹³C的含量，通过计算绘制出细胞内进入CO₂含量与通入CO₂体积的关系曲线，如图1所示，两者具有一定的线性关系：HeLa cell:m_13C＝0.0180×[CO₂]+0.6687,R²＝0.9978；MCF-7 cell:m_13C＝0.0192×[CO₂]+0.2723,R²＝0.9978；MEF cell:m_13C＝0.0008×[CO₂]+0.0597,R²＝0.9945。m_13C为进入细胞内CO₂含量，[CO₂]为向待测样品2中通入二氧化碳的体积，R代表线性相关度。

通过对比待测样品1中活细胞内高尔基体自身新陈代谢产生CO₂导致荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞通入CO₂气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化，得到待测样品1中细胞内高尔基体自身新陈代谢产生CO₂导致荧光强度变化率与待测样品2中失活细胞通入气体后的荧光强度变化率相同时分别对应的时间t以及通入气体的体积v；所述体积v中失活细胞高尔基体内含有CO₂气体的体积即为活细胞高尔基体在时间t内自身新陈代谢产生的CO₂的体积；

待测样品1和待测样品2中细胞用血球计数板计数，HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell的个数均为5×10⁵±0.05×10⁵个，根据待测样品1中活细胞内高尔基体荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞荧光强度变化率随通入二氧化碳的体积的变化，计算出单个HeLa cell、MCF-7 cell、MEF cell高尔基体每小时新陈代谢产生CO₂的速率分别为：HeLa cell:5.12×10^-6±5×10^-8μg/h；MCF-7 cell:2.86×10^-6±3×10^-8μg/h；MEF cell:4.10×10^-7±4×10^-9μg/h。

实施例4

(1)将0.64mg TPP-TMAE溶解于的0.01mL二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为1×10^-2mol/L的溶液a；向溶液a中加入10mL高糖DMEM培养基，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液b。

(2)为了检测TPP-TMAE在单个活细胞(人子宫颈癌细胞(HeLa cell)、人乳腺癌细胞(MCF-7 cell))和CD1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF cell))内溶酶体新陈代谢过程中荧光强度的变化与时间关系，做了如下实验：

(a)将溶酶体染料(and LysoSensor^TMProbes)稀释于三蒸水中，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液c；

(b)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中；在37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱中培养14h，用血球计数板计数，此时HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell的个数均为5×10⁵±0.05×10⁵个，用移液枪移除培养皿中的培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，然后向培养皿中加入100μL溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养20min，用移液枪移除溶液c，用PBS冲洗3次，加入1mL高糖DMEM培养基，得到待测样品1；

其中，每组培养皿为5个；

(c)将待测样品1放置在激光共聚焦显微镜下观察，对准细胞的焦平面后，保持待测样品1位置不变，用200μL移液枪加入100μL溶液b，立即测试出待测样品1中细胞内溶酶体的初始荧光强度I₀，然后每隔1小时测一次溶酶体的荧光强度I_i，共测试6次；

(d)根据步骤(c)测试结果绘制出时间-待测样品1在细胞溶酶体中荧光强度关系图，如图3、5、7所示，从图中可知，在三种细胞系的溶酶体中，待测样品1中细胞内溶酶体的荧光强度随着时间的增加而降低，且荧光强度随时间的变化呈现出较好的线性关系，具体为：HeLa cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.1126t+0.0036,R²＝0.9956；MCF-7 cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.0781t+0.0074,R²＝0.9956；MEF cell:(I_i-I₀)/I₀＝-0.0108t+0.0014,R²＝0.9964；其中，(I_i-I₀)/I₀表示待测样品1中单个细胞溶酶体内荧光强度变化率；其中，i为1～5的正整数。

(3)为了检测TPP-TMAE在失活细胞(HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell)内溶酶体新陈代谢过程中荧光强度的变化与二氧化碳体积关系，做了如下实验：

(a)将溶酶体染料(and LysoSensor^TMProbes)稀释于三蒸水中，得到浓度为1×10^-5mol/L的溶液c；

(b)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中，在37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱中培养20h，移除培养皿中的培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，然后向培养皿中加入100μL溶液c，并将所述培养皿置于培养箱中培养30min，移除溶液c，用PBS冲洗3次，加入100μL溶液b，5秒后立即移除溶液b，并用PBS冲洗3次，加入1mL质量浓度为4％的多聚甲醛溶液，静置10min后用PBS洗3次，加入1mL PBS溶液，此时细胞失活，得到含有失活细胞的待测样品2；

其中，每组培养皿为5个；

(c)将待测样品2放置于激光共聚焦显微镜下，先测试出待测样品1中细胞内溶酶体的初始荧光强度I′₀；再分次向待测样品2注入CO₂与空气的混合气体，测试每次注入气体后待测样品2中单个失活细胞内溶酶体的荧光强度I′_k；其中，CO₂与空气的体积比为1:1；每次注入气体的体积为1μL，气体的注入总量为20μL；

(d)根据测试结果绘制待测样品2中失活细胞通入气体后单个溶酶体的荧光强度变化率随通入气体体积的变化曲线，如图8所示，三种失活细胞外界通入CO₂与空气的混合气体后溶酶体内荧光强度的变化与通入二氧化碳体积在一定范围内有一定线性关系：HeLa cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0159×[CO₂]-0.0106，R′²＝0.9953；MCF-7 cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0071×[CO₂]-0.0049，R′²＝0.9963；MEF cell:(I′_k-I′₀)/I′₀＝-0.0072×[CO₂]+0.0029，R′²＝0.9972。

所述[CO₂]为向待测样品2中通入二氧化碳的体积，R与R′均代表线性相关度；其中，k为1～20的正整数。

(4)为了检测通入CO₂后进入失活HeLa cell、失活MCF-7 cell和失活MEFcell内CO₂的含量，做了如下实验：

(a)分别将HeLa cell,MCF-7 cell,MEF cell各传代至一组激光共聚焦显微镜(confocal)专用底部带玻片培养皿(Ф20mm)中，在温度37℃、CO₂的体积分数为5％的培养箱培养20h，移除培养皿中培养基并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞三次，然后加入1mL质量百分含量为4％的多聚甲醛溶液，静置10min后用PBS洗三次，加入1mL PBS溶液，此时细胞失活，向各培养皿中通入0～20μL ¹³CO₂与空气的混合气体，通入后立即用PBS离心洗三次，去除上清液，收集细胞，冷冻抽真空干燥，得到含有失活细胞的待测样品3。

其中，一组培养皿的个数为21个；¹³CO₂与空气的体积比为1:1；所述离心的转数为1000rpm，离心时间为10min；

(b)用同位素法测定待测样品3的失活细胞中¹³C的含量，通过计算绘制出细胞内进入CO₂含量与通入CO₂体积的关系曲线，如图1所示，两者具有一定的线性关系：HeLa cell:m_13C＝0.0180×[CO₂]+0.6687,R²＝0.9978；MCF-7 cell:m_13C＝0.0192×[CO₂]+0.2723,R²＝0.9978；MEF cell:m_13C＝0.0008×[CO₂]+0.0597,R²＝0.9945。m_13C为进入细胞内CO₂含量，[CO₂]为向待测样品2中通入二氧化碳的体积，R代表线性相关度。

通过对比待测样品1中活细胞内溶酶体自身新陈代谢产生CO₂导致荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞通入CO₂气体后的荧光强度变化率随通入气体体积的变化，得到待测样品1中细胞内溶酶体自身新陈代谢产生CO₂导致荧光强度变化率与待测样品2中失活细胞通入气体后的荧光强度变化率相同时分别对应的时间t以及通入气体的体积v；所述体积v中失活细胞溶酶体内含有CO₂气体的体积即为活细胞溶酶体在时间t内自身新陈代谢产生的CO₂的体积；

待测样品1和待测样品2中细胞用血球计数板计数，HeLa cell、MCF-7 cell和MEF cell的个数均为5×10⁵±0.05×10⁵个，根据待测样品1中活细胞内溶酶体荧光强度变化率随时间的变化与待测样品2中失活细胞荧光强度变化率随通入二氧化碳的体积的变化，计算出单个HeLa cell、MCF-7 cell、MEF cell溶酶体每小时新陈代谢产生CO₂的速率分别为：HeLa cell:4.88×10^-6±5×10^-8μg/h；MCF-7cell:2.46×10^-6±3×10^-8μg/h；MEF cell:4.08×10^-7±4×10^-9μg/h。

本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明精神的原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。