P47phox介导氧暴露后单个核细胞内活性氧簇产生的机制

摘要

目的:观察32周以下早产儿不同浓度氧暴露后，外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)内p47phox与活性氧簇产生的变化;以及运用NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘(DPI)和夹竹桃麻素(apocynin)联合高浓度氧处理PBMCs后，p47phox与活性氧簇水平的改变，来探讨NADPH氧化酶亚单位p47phox调节PBMCs内活性氧簇升高的机制，为临床中减轻早产儿氧化应激损伤寻找新的靶点。　　方法:实验分两部分进行。第一，以临床中32周以下早产儿为对象，将其中入院时诊断为新生儿呼吸窘迫综合征(Neonatal respiratory distresssyndrom，NRDS)且需要吸氧的患儿作为氧暴露组，根据吸氧浓度不同分为三组:FiO2＜30％为低浓度吸氧组、FiO2在(30-40)％为中浓度吸氧组、FiO2＞40％为高浓度吸氧组，每组患儿各10例，其中男18例，女12例。胎龄(28-32)周，体重(1350±138)g，组间患儿胎龄、出生体重无显著性差异。同期选择10例32周以下暂未吸氧的早产儿作为空气组，其中男5例，女5例。胎龄(30-32)周，体重(1347±116)g。氧暴露组与空气组间患儿胎龄、出生体重无显著性差异，具有可比性。该实验通过四川医科大学附属医院伦理委员会的批准，所有患儿进行实验前均征得家属同意并签署知情同意书。空气组及氧暴露组患儿不同浓度氧疗48小时后，均经桡动脉采血3ml。分离取得PBMCs及血清标本用于检测。实验第二部分，出生后即入我科的32周以下早产儿，尚未吸氧前，征得家属同意并签署知情同意书后经桡动脉采血2 ml，经Ficoll密度梯度离心法，分离纯化PBMCs，以PBMCs为对象，将其分为以下四组:常规培养组，置于37℃、50 ml/L的CO2培养箱中培养48 h;高氧处理组，按3 L/min通入950ml/L的O2与50 ml/L的CO2混合气体，10 min后，立即用封口胶密封培养瓶，置于培养箱中培养48 h;高氧联合DPI处理组与高氧联合夹竹桃麻素(apocynin)处理组根据文献报道和预实验结果，分别选择5μmol/L、100μmol/L处理细胞后再按上述方法建立高氧损伤模型并培养48 h;高氧及相应处理组培养48 h后，均用CYS-1数字式测氧仪检测培养瓶中O2的浓度，将低于900 ml/L O2的标本弃去。离心采集PBMCs和培养液作为标本。将两部分实验中所获得的标本，均采用Mitosox Red标记结合激光共聚焦显微镜检测PBMCs内ROS的生成量、硫代巴比妥酸比色法检测血清/培养液中丙二醛含量、免疫荧光检测p47phox在细胞内的定位及移位率、Western blot检测p47phox的蛋白表达量。　　结果:第一，临床样本中，随着早产儿吸氧浓度的升高，PBMCs内活性氧与血清丙二醛明显升高，p47phox由包质向包膜移位的细胞数增多，p47phox的移位率明显增加，p47phox的蛋白表达量也随之增加（P均＜0.05）;第二，培养PBMCs各组中，PBMCs经高氧及相应药物处理48h后，与高氧处理组相比，其余三组活性氧和丙二醛明显减少，p47phox移位率与表达量也显著降低(P均＜0.05）;与常规培养组相比，高氧联合DPI处理组及高氧联合apocynin处理组中ROS、丙二醛、p47phox移位率与表达量并无显著差异(P均＞0.05）。　　结论:早产儿和PBMCs经氧暴露后，p47phox可增加向胞膜移位，上调其表达量，这与ROS和丙二醛增加是一致的。而对PBMCs运用NADPH氧化酶抑制剂DPI和apocynin处理后，p47phox移位率、表达量出现减少，此时，ROS和丙二醛也相应减少。这提示p47phox可增加向胞膜移位，上调其表达量来调节PBMCs内活性氧簇的升高，而DPI和apocynin能通过降低p47phox移位与表达来减少高氧诱导的PBMCs内活性氧簇的产生。

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论文说明

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

英文缩写及中英文对照

致谢

综述 P47phox介导活性氧产生与疾病的关系

攻读硕士学位期间发表和撰写的论文

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