治疗光敏感性皮肤病的药物组合物及制剂和制备应用

摘要

本发明涉及药物组合物，具体涉及一种治疗光敏感性皮肤病的药物组合物及制剂和制备应用。该药物组合物含有下述组分：青蒿、水牛角、生地黄、秦艽、牡丹皮、赤芍、防风和甘草。本发明所用药物组合物，具有改善皮肤光敏感状态，缓解患者临床症状，疗效较佳，副作用小的优点，可清热除湿、凉血消斑，缓解红斑、水疱等体征，且可缓解皮疹肿胀、灼热刺痛、口干欲饮、心烦易怒、大便干结、小便短黄等症状，既可治疗光敏感性皮肤病，亦可提高患者对日光毒邪的耐受性及适应性。

说明书

技术领域

本发明涉及药物组合物，具体涉及一种治疗光敏感性皮肤病的药物组合 物及制剂和制备应用。

背景技术

光敏感性皮肤病是日益引起国民重视的、医疗资源花费逐渐增加的、皮肤 科领域患病率呈递增趋势的、常见、多发、顽固性、带有病谱性质的皮肤病。 其医疗资源花费呈增加趋势，国民日益关注防光治光的重要性。其以暴露在日 光照射部位出现红斑、水疱或多形性皮损，自觉灼热瘙痒，一般有明显的季节 性为特征。光敏感性皮肤病属于物理性皮肤病，在临床上大致可分为外源性过 敏性皮炎、特发性光敏性皮肤病、遗传性皮肤病、日光照射诱发或加重的皮肤 病四个类别。光敏感性皮肤病见于所有种族，我国各地区都有发生。

随着工业发展，环境污染日益严重，大气层破坏，紫外线诱发引起光敏感 性皮肤病损伤发病率呈增加趋势，据报道海拔每升高100m，紫外线的强度就 比在海平面的水平增加3％～4％，因而在日照长、紫外线(UV)强的高海拔地 区，其患病人群多于低海拔地区人群，且女性患病率高于男性。其中多形性日 光疹约占光敏感性皮肤病的1/4，其患病率达0.65％。患者呈损容性病变，暴 露于外界的皮肤，如面部、前胸、臂部等处呈灼热、疼痛，甚则肿胀、渗出， 严重影响了患者的日常生活及社会交往，患者处于终日不敢见“光”的尴尬境 地。

目前，西医系统治疗光敏感性皮肤病的系统内服药物主要有羟氯喹、抗组 胺药、糖皮质激素、非甾体类消炎药以及沙利度胺等，可抗炎、抗过敏、抑制 紫外线照射后角质形成细胞释放炎症介质产生及抑制炎症细胞浸润，具有避光 和减轻皮肤炎症损伤的作用，临床上应用较普遍。但由于羟氯喹对视网膜的损 害，抗组胺药、沙利度胺的致畸作用，糖皮质激素不适合于骨质疏松、糖尿病 患者，非甾体类消炎药对消化道系统的不良反应而限制了以上药物的使用。而 单纯外用防晒药品及化妆品亦疗效不甚稳定。因此，迫切需要研究疗效可靠， 安全性高，副作用小的药物。

中医将光敏感性皮肤病称之为“日晒疮”，中医历代医家在探索本病的病 因病机、治疗方法、常用中药、中药基础研究方面积累了宝贵的经验。尤其是 近几年随着科技的进步，对本病的研究方法及对本病的实验与治疗经验也得到 了长足进步。中医药对皮肤的光保护及治疗作用正逐渐为临床经验所证实。对 近年中医证治光敏感性皮肤病的文章分析表明，以清热凉血解毒，利湿消斑为 法，治疗日光性皮炎、多形性日光疹、慢性光化性皮炎等光敏感性皮肤病及红 斑狼疮光敏感，临床上取得了一定的疗效。

发明内容

本发明解决的技术问题是现有西医治疗光敏感性皮肤病的毒副作用严重， 临床应用受到极大的限制，甚至会导致光敏感，而单纯外用防晒药品及化妆品 的疗效不甚稳定。因此，迫切需要研究疗效可靠，安全性高，副作用小的药物。 同时既往尚无以严格、客观的临床流行病学评价方法和手段，客观、科学、准 确地从中药对紫外线损伤的治疗和预防作用及其改善患者光敏感状态、提高患 者光耐受的疗效机制方面进行系统深入地探讨与研究的方药，无市售治疗光敏 感性皮肤病的中成药。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种治疗光敏感性皮肤病的药物组合 物及制剂和制备应用。

具体来说，本发明是通过下述技术方案解决技术问题的：

本发明提供了一种治疗光敏感性皮肤病的药物组合物，其含有下述组分： 青蒿、水牛角、生地黄、秦艽、牡丹皮、赤芍、防风和甘草。

优选的，所述的药物组合物还含有凌霄花、石膏、金银花和龙葵，或者还 含有白茅根，或者还含有地骨皮，或者还含有茵陈、栀子、黄芩、苦参和薏苡 仁作为选择性添加组分。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿6～30份；水牛角15～30 份；生地黄10～15份；秦艽3～10份；牡丹皮6～15份；赤芍6～15份；防风5～10 份；和甘草2～10份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿15～30份；水牛角15～20 份；生地黄12～15份；秦艽5～10份；牡丹皮10～15份；赤芍10～15份；防风 5～8份；和甘草5～10份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿6～30份；水牛角15～30 份；生地黄10～15份；秦艽3～10份；牡丹皮6～15份；赤芍6～15份；防风5～10 份；甘草2～10份；凌霄花5～9份；石膏15～30份；金银花6～15份；和龙葵 6～9份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿15～30份；水牛角15～20 份；生地黄12～15份；秦艽5～10份；牡丹皮10～15份；赤芍10～15份；防风 优选5～8份；甘草5～10份；凌霄花7～9份；石膏20～30份；金银花10～15份； 和龙葵8～9份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿6～30份；水牛角15～30 份；生地黄10～15份；秦艽3～10份；牡丹皮6～15份；赤芍6～15份；防风5～10 份；甘草2～10份；和白茅根9～30份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿15～30份；水牛角15～20 份；生地黄12～15份；秦艽5～10份；牡丹皮10～15份；赤芍10～15份；防风 5～8份；甘草5～10份；和白茅根15～30份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿6～30份；水牛角15～30 份；生地黄10～15份；秦艽3～10份；牡丹皮6～15份；赤芍6～15份；防风5～10 份；甘草2～10份；和地骨皮9～15份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿15～30份；水牛角15～20 份；生地黄12～15份；秦艽5～10份；牡丹皮10～15份；赤芍10～15份；防风 5～8份；甘草5～10份；和地骨皮10～15份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿6～30份；水牛角15～30 份；生地黄10～15份；秦艽3～10份；牡丹皮6～15份；赤芍6～15份；防风5～10 份；甘草2～10份；茵陈6～15份；栀子6～10份；黄芩3～10份；苦参5～9份； 薏苡仁9～30份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿15～30份；水牛角15～20 份；生地黄12～15份；秦艽5～10份；牡丹皮10～15份；赤芍10～15份；防风 5～8份；甘草5～10份；茵陈10～15份；栀子8～10份；黄芩5～10份；苦参6～9 份；薏苡仁15～30份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物包含青蒿30份、水牛角15份、 生地黄15份、秦艽10份、牡丹皮15份、赤芍15份、防风6份和甘草6份。

优选的，按重量份计，所述的药物组合物由下述组分制成：青蒿30份、 水牛角15份、生地黄15份、秦艽10份、牡丹皮15份、赤芍15份、防风6 份和甘草6份。

本发明同时提供了一种治疗光敏感性皮肤病的中药制剂，其通过含有以上 任一所述的药物组合物的原料制成。

优选的，所述的中药制剂，其剂型为汤剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、 散剂、酊剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、气雾剂、喷雾剂或搽剂。

本发明同时提供了一种治疗光敏感性皮肤病汤剂的制备方法，其包括如下 步骤：将以上任一所述的药物组合物的原料加水浸泡，煎煮，分出水煎剂；向 剩余药材中加水，煎煮过筛，分出水煎剂；合并水煎剂。

本发明同时提供了以上任一所述的药物组合物或以上所述的中药制剂在 制备治疗光敏感皮肤病药物中的应用。

以上任一所述的药物组合物或以上所述的中药制剂在制备治疗多形性日 光疹药物中的应用。

以上任一所述的药物组合物或以上所述的中药制剂在制备治疗热毒蕴肤 证光敏感性皮肤病药物中的应用。

以上任一所述的药物组合物或以上所述的中药制剂在制备治疗由 280-340nm的中波紫外线辐射引起的光敏感皮肤病药物中的应用。

以上任一所述的药物组合物或以上所述的中药制剂在制备治疗皮肤中包 括呈现Bid、Bax、Bad、组织蛋白酶D、Caspase-3或Caspase-9蛋白中的一种 或几种以上含量升高现象，或者在制备治疗皮肤中包括呈现Bcl-2、Bcl-x或 Bcl-w蛋白中的一种或几种以上含量降低现象的皮肤病药物中的应用。

本方治证由光热毒邪炽盛蕴于肌肤所致。“光毒”为毒邪之一，系日光所 致。日光性之属阳热，发病暴速，蔓延亦快，其性炎上，多发于人体上部，化 火易灼伤营血。日光曝晒，毒热袭肤，即为肌肤红肿、灼热；邪毒引动体内之 湿热外发于肌肤，而见肿胀水疱、糜烂渗出。心主血，又主神明，热入血分， 一则热扰心神，致心烦躁扰；二则热迫肌肤，郁于血分，至肌肤红肿、灼热； 三则血分热毒耗伤血中津液，致口干舌燥。此际不清其热则血不宁，不凉其血 则斑不去，不滋其阴则火不熄，正如叶天士所谓“入血就恐耗血动血，直须凉 血散血。”治当以清热解毒、凉血化斑为法。

本发明用苦辛而寒之青蒿为君；青蒿善清暑邪及日光之毒邪，其气芳香， 清中有透散之力，清热透络，引邪外出；宣化湿热，又可使血分伏热外透而出， 且芳香气清，苦寒而不伤脾胃，不损阴血。清·陈士铎《洞天奥旨》即提出了 治疗日晒疮以“青蒿消暑热”的疗法。故为本方之君药。

光毒作为阳热之邪侵袭人体，伤及肌肤，其皮损表现为红斑灼热，肿胀刺 痛；光毒之热毒入里，劫灼阴液，亦可出现口干咽燥欲饮、大便干结、小便短 黄等。臣以咸寒之水牛角，清热解毒，专入血分，善清血热及心肝胃三经之火 而凉血清心解热毒，使火平热降，毒解血宁；以甘苦寒之生地黄，协水牛角清 热凉血化斑、滋阴生津；并关注到皮肤受日光毒邪曝晒而出现红斑肿胀，兼以 受暑湿之邪侵袭而出现水疱、渗液、糜烂，兼以受风邪侵袭而瘙痒剧烈，故以 能驱一身之风的秦艽祛风除湿，清热利尿，利湿与泄热并进，通利二便，前后 分消，湿邪得除，瘀热得去，湿浊自退。三药相配为臣，既可以用于光毒之邪 病热入营血，血热毒盛，身热口干、皮肤灼热，舌绛或红等症状；亦可以养阴 生津，用于热盛津伤口渴。凉血与活血散瘀并用，使热清血宁而无耗血动血之 虑，凉血止血又无冰伏留瘀之弊。

同时并用辛苦微寒之牡丹皮与苦微寒之赤芍共为佐药，清热凉血，活血 散瘀，可收化斑之功。牡丹皮味苦性辛微寒入心、肝肾经，善清血中伏热，且 活血散瘀之力亦佳；赤芍清热凉血、散瘀消肿；能使血流畅而不流瘀，尤宜于 瘀而有热者，二药相配为佐，既可以用于光毒之邪病热入营血，血热毒盛，身 热口干、皮肤灼热，舌绛或红等症状；亦可以养阴生津，用于热盛津伤口渴。 凉血与活血散瘀并用，使热清血宁而无耗血动血之虑，凉血止血又无冰伏留瘀 之弊。此证兼以受风邪侵袭、风热在肤而瘙痒剧烈，故以祛风解表之防风祛风 解表止痒，三药相配为佐，以祛风凉血止痒。

甘草既可清热解毒，辛凉解肌，又可调和药性，护胃安中为方之使药。李 时珍在《本草纲目》中所释：“诸药中甘草为君，治七十二种乳石毒，解一千 二百草木毒，调和众药有功，故有‘国老’之号。”

以上诸药共奏清热解毒、凉血化斑之功，对多形性日光疹等光敏感性皮 肤病标本兼顾，起到积极治疗作用。以上含有青蒿、水牛角、生地黄、秦艽、 牡丹皮、赤芍、防风和甘草的处方，其临床等效剂量为0.76g/kg/天～1.93g/kg/ 天。

光毒作为阳热之邪侵袭人体，首先伤及人体气分，其皮损表现为红斑灼热， 肿胀刺痛，且可见口干欲饮、大便干结、小便短黄等症状，故针对重症者，此 时可用清热解毒药、清热泻火药清解气分之热，可加用凌霄花、石膏、金银花 和龙葵。含有青蒿、水牛角、生地黄、秦艽、牡丹皮、赤芍、防风、甘草、凌 霄花、生石膏、金银花、龙葵的处方，其临床等效剂量为1.21g/kg/天～2.83g/kg/ 天。

若光毒之热毒入里，劫灼阴液，除外皮损表现，甚可出现发热、头痛甚则 谵妄，此时为热入血分，则“入血就恐耗血动血，直须凉血散血”，可用清热 凉血之品清血分之热，可加用白茅根；光毒热邪久而伤阴，故加用地骨皮清热 养阴。含有青蒿、水牛角、生地黄、秦艽、牡丹皮、赤芍、防风、甘草和白茅 根的处方，其临床等效剂量为0.89g/kg/天～2.36g/kg/天。含有青蒿、水牛角、 生地黄、秦艽、牡丹皮、赤芍、防风、甘草和地骨皮的处方，其临床等效剂量 为0.89g/kg/天～2.14g/kg/天。

夏季为光敏感性皮肤病的多发季节，暑乃夏季之主气，暑多挟湿，因而此 时皮肤受日光暴晒后不仅可出现红斑丘疹，还可出现水疱、渗液、糜烂等湿热 浸淫表现，多伴有舌苔黄腻、脉滑数等湿热蕴结之征象，此时可应用清热燥湿 之品，茵陈、栀子、黄芩、苦参、薏苡仁。含有青蒿、水牛角、生地黄、秦艽、 牡丹皮、赤芍、防风、甘草、茵陈、栀子、黄芩、苦参和薏苡仁的处方，其临 床等效剂量为1.17g/kg/天～2.99g/kg/天。

本发明中药药物组合物所用原料均为本领域常用的中药材。其中：

青蒿，为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分。秋季花盛开 时采摘，除去老茎，阴干。茎成圆柱形，上部多分枝，长30～80cm，直径0.2～0.6cm； 表面黄绿色或棕黄色，具纵棱线；质略硬，易折断，断面中部有髓。叶互生， 暗绿色或棕绿色，卷缩易碎，完整者展平后为三回羽状深裂，裂片和小裂片矩 圆形或长椭圆形，两面被短毛。气香特异，味微苦。

水牛角，为牛科动物水牛Bubalus bubalis Linnaeus的角。取角后，水煮， 除去角塞，干燥。呈稍扁平而弯曲的锥形，长短不一。表面棕黑色或灰黑色， 一侧有数条横向的沟槽，另一侧有密集的横向凹陷条纹。上部渐尖，有纵纹， 基部略呈三角形，中空。角质，坚硬。气微腥，味淡。

生地黄，为玄参禾斗植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根。 秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，缓缓烘焙至约八成干。生地黄多呈不规则 的团块状或长圆形，中间膨大，两端稍细，有的细小，长条状，稍扁而扭曲， 长6～12cm，直径2～6cm。表面棕黑色或棕灰色，极皱缩，具不规则的横曲纹。 体重，质较软而韧，不易折断，断面棕黑色或乌黑色，有光泽，具黏性。气微， 味微甜。

秦艽，为龙胆科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.、麻花秦艽Gentiana  straminea Maxim.、粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽 Gentiana dahurica Fisch.的干燥根。前三种按性状不同分别习称“秦艽”和“麻 花艽”，后一种习称“小秦艽”。春、秋二季采挖，除去泥沙；秦艽和麻花艽晒 软，堆置“发汗”至表面呈红黄色或灰黄色时，摊开晒干，或不经"发汗"直接 晒干；小秦艽趁鲜时搓去黑皮，晒干。秦艽：呈类圆柱形，上粗下细，扭曲不 直，长10～30cm，直径l～3cm。表面黄棕色或灰黄色，有纵向或扭曲的纵皱纹， 顶端有残存茎基及纤维状叶鞘。质硬而脆，易折断，断面略显油性，皮部黄色 或棕黄色，木部黄色。气特异，味苦、微涩。麻花艽：呈类圆锥形，多由数个 小根纠聚而膨大，直径可达7cm。表面棕褐色，粗糙，有裂隙呈网状孔纹。质 松脆，易折断，断面多呈枯朽状。小秦艽：呈类圆锥形或类圆柱形，长8～15cm， 直径0.2～1cm。表面棕黄色。主根通常1个，残存的茎基有纤维状叶鞘，下部多 分枝。断面黄白色。

牡丹皮，毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮。秋季采挖 根部，除去细跟和泥沙，剥取根皮，晒干或刮去粗皮，除去木心，晒干。前者 习称连丹皮，后者习称刮丹皮。连丹皮，呈筒状或半筒状，有纵剖开的裂缝， 略向内卷曲或张开，长5～20cm，直径0.5～1.2cm，厚0.1～0.4cm。外表面灰褐 色或黄褐色，有多数横长皮孔样突起和细根痕，栓皮脱落处粉红色；内表面淡 灰黄色或浅棕色，有明显的细纵纹，常见发亮的结晶。质硬而脆，易折断，断 面较平坦，淡粉红色，粉性。气芳香，味微苦而涩。刮丹皮，外表面有刮刀削 痕，外表面红棕色或淡灰黄色，有时可见灰褐色斑点状残存外皮。

赤芍，为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii  Lynch的干燥根。呈圆柱形，稍弯曲，长5～40cm，直径0.5～3cm。表面棕褐色， 粗糙，有纵沟和皱纹，并有须根痕和横长的皮孔样突起，有的外皮易脱落。质 硬而脆，易折断，断面粉白色或粉红色，皮部窄，木部放射状纹理明显，有的 有裂隙。气微香，味微苦、酸涩。

防风，为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的干燥 根。春、秋二季采挖未抽花茎植物的根，除去须根和泥沙，晒干。呈长圆锥形 或长圆柱形，下部渐细，有的略弯曲，长15～30cm，直径0.5～2cm。表面灰棕 色，粗糙，有纵皱纹、多数横长皮孔样突起及点状的细根痕。根头部有明显密 集的环纹，有的环纹上残存棕褐色毛状叶基。体轻，质松，易折断，断面不平 坦，皮部浅棕色，有裂隙，木部浅黄色。气特异，味微甘。

甘草，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza  inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎。春、秋二季采挖， 除去须根，晒干。甘草根呈圆柱形，长25～100cm，直径0.6～3.5cm。外皮松紧 不一。表面红棕色或灰棕色，具显著的纵皱纹、沟纹、皮孔及稀疏的细根痕。 质坚实，断面略显纤维性，黄白色，粉性，形成层环明显，射线放射状，有的 有裂隙。根茎呈圆柱形，表面有芽痕，断面中部有髓。气微，味甜而特殊。胀 果甘草：根和根茎木质粗壮，有的分枝，外皮粗糙，多灰棕色或灰褐色。质坚 硬，木质纤维多，粉性小。根茎不定芽多而粗大。光果甘草：根和根茎质地较 坚实，有的分枝，外皮不粗糙，多灰棕色，皮孔细而不明显。

凌霄花，为紫葳科植物凌霄Campsis grandiflora(Thunb.)K.Schum.或美洲 凌霄Campsis radicans(L.)Seem.的干燥花。夏、秋二季花盛开时采摘，干燥。 凌霄多皱缩卷曲，黄褐色或棕褐色，完整花朵长4～5cm。萼筒钟状，长2～2.5cm, 裂片5，裂至中部，萼筒基部至萼齿尖有5条纵棱。花冠先端5裂，裂片半圆形， 下部联合呈漏斗状，表面可见细脉纹，内表面较明显。雄蕊4，着生在花冠上， 2长2短，花药个字形，花柱1，柱头扁平。气清香，味微苦、酸。美洲凌霄完 整花朵长6～7cm。萼筒长1.5～2cm，硬革质，先端5齿裂，裂片短三角状，长约 为萼筒的1/3，萼筒外无明显的纵梭；花冠内表面具明显的深棕色脉纹。

石膏，为硫酸盐类矿物硬石膏族石膏，主含含水硫酸钙(CaSO₄·2H₂O)， 采挖后，除去杂石及泥沙。本品为纤维状的集合体，呈长块状、板块状或不规 则块状。白色、灰白色或淡黄色，有的半透明。体重，质软，纵断面具绢丝样 光泽。气微，味淡。

金银花，忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的 花。夏初花开放前采收，干燥。本品呈棒状，上粗下细，略弯曲，长2～3cm， 上部直径约3mm，下部直径约1.5mm。表面黄白色或绿白色(贮久色渐深)， 密被短柔毛。偶见叶状苞片。花萼绿色，先端5裂，裂片有毛，长约2mm。开 放者花冠筒状，先端二唇形；雄蕊5，附于筒壁，黄色；雌蕊1，子房无毛。气 清香，味淡、微苦。

白茅根，禾本科植物白茅Imperata cylindricaBeauv.var.major(Nees)C.E. Hubb.的干燥根茎。春、秋二季采挖，洗净，晒干，除去须根和膜质叶鞘，捆 成小把。本品呈长圆柱形，长30～60cm，直径0.2～0.4cm。表面黄白色或淡黄色， 微有光泽，具纵皱纹，节明显，稍突起，节间长短不等，通常长1.5～3cm。体 轻，质略脆，断面皮部白色，多有裂隙，放射状排列，中柱淡黄色，易与皮部 剥离。气微，味微甜。

地骨皮，茄科植物枸杞Lycium chinense Mill.或宁夏枸杞Lycium barbarum  L.的干燥根皮。舂初或秋后采挖根部，洗净，剥取根皮，晒干。本品呈筒状或 槽状，长3～10cm，宽0.5～1.5cm，厚0.1-0.3cm。外表面灰黄色至棕黄色，粗糙， 有不规则纵裂纹，易成鳞片状剥落。内表面黄白色至灰黄色，较平坦，有细纵 纹。体轻，质脆，易折断，断面不平坦，外层黄椋色，内层灰白色。气微，味 微甘而后苦。

茵陈，为菊科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陈蒿Artemisia  capillaries Thunb.的干燥地上部分。春季幼苗高6～10cm时采收或秋季花蕾长成 至花初开时采割，除去杂质和老茎，晒干。春季采收的习称“绵茵陈”，秋季 采割的称“花茵陈”。绵茵陈，多卷曲成团状，灰白色或灰绿色，全体密被白 色茸毛，绵软如绒。茎细小，长1.5～2.5cm，直径0.1～0.2cm,除去表面白色茸 毛后可见明显纵纹；质脆，易折断。叶具柄；展平后叶片呈一至三回羽状分裂， 叶片长1～3cm，宽约lcm；小裂片卵形或稍呈倒披针形、条形，先端锐尖。气 清香，味微苦。花茵陈，茎呈圆柱形，多分枝，长30～100cm，直径2～8mm； 表面淡紫色或紫色，有纵条纹，被短柔毛；体轻，质脆，断面类白色。叶密集， 或多脱落；下部叶二至三回羽状深裂，裂片条形或细条形，两面密被白色柔毛； 茎生叶一至二回羽状全裂，基部抱茎，裂片细丝状。头状花序卵形，多数集成 圆锥状，长1.2～1.5mm,直径1～1.2mm，有短梗；总苞片3～4层，卵形，苞片3 裂；外层雌花6～10个，可多达15个，内层两性花2～10个。瘦果长圆形，黄棕色。 气芳香，味微苦。

栀子，为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。9～11 月果实成熟呈红黄色时采收，除去果梗和杂质，蒸至上气或置沸水中略烫，取 出，干燥。本品呈长卵圆形或椭圆形，长1.5～3.5cm，直径1～1.5cm。表面红黄 色或棕红色，具6条翅状纵梭，梭间常有1条明显的纵脉纹，并有分枝。顶端残 存萼片，基部稍尖，有残留果梗。果皮薄而脆，略有光泽；内表面色较浅，有 光泽，具2～3条隆起的假隔膜。种子多数，扁卵圆形，集结成团，深红色或红 黄色，表面密具细小疣状突起。气微，味微酸而苦。

黄岑，为唇形科植物黄岑Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。春、秋 二季采挖，除去须根和泥沙，晒后撞去粗皮，晒干。本品呈圆锥形，扭曲，长 8～25cm，直径1～3cm。表面棕黄色或深黄色，有稀疏的疣状细根痕，上部较 粗糙，有扭曲的纵皱纹或不规则的网纹，下部有顺纹和细皱纹。质硬而脆，易 折断，断面黄色，中心红棕色；老根中心呈枯朽状或中空，暗棕色或棕黑色。 气微，微苦。栽培品较细长，多有分枝。表面浅黄棕色，外皮紧贴，纵皱纹较 细腻。断面黄色或浅黄色，略呈角质样。味微苦。

苦参，为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根。春、秋二季采挖， 除去根头和小支根，洗净，干燥，或趁鲜切片，干燥。本品呈长圆柱形，下部 常有分枝，长10～30cm，直径l～6.5cm。表面灰棕色或棕黄色，具纵皱纹和横长 皮孔样突起，外皮薄，多破裂反卷，易剥落，剥落处显黄色，光滑。质硬，不 易折断，断面纤维性；切片厚3～6mm；切面黄白色，具放射状纹理和裂隙，有 的具异型维管束呈同心性环列或不规则散在。气微，味极苦。

薏苡仁，为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var.mayuen(Roman.)Stapf 的干燥成熟种仁。秋季果实成熟时采割植株，晒干，打下果实，再晒干，除去 外壳、黄褐色种皮和杂质，收集种仁。本品呈宽卵形或长椭圆形，长4～8mm， 宽3～6mm。表面乳白色，光滑，偶有残存的黄褐色种皮；一端钝圆，另端较宽 而微凹，有1淡棕色点状种脐；背面圆凸，腹面有1条较宽而深的纵沟。质坚实， 断面白色，粉性。气微，味微甜。

龙葵，为茄科茄属植物龙葵Solanum nigrum L.，以全草入药。夏季采收， 鲜用或晒干。性苦寒。一年生草本，高约25-100cm。茎直立，有棱角或不明显， 近无毛或稀被细毛。叶互生；叶柄长1-2cm；叶片卵形，先端短尖，基部楔形 或宽楔形并下延至叶柄，通常长2.5-10cm，宽1.5-5.5cm，全缘或具不规则波状 粗锯齿，光滑或两面均被稀疏短柔毛。蝎尾状聚伞花序腋外生，由3-6朵花组 成；花梗长，5深裂，裂片卵圆形，长约2mm，雄蕊5，着生花冠筒口，花丝分 离，花药黄色，顶孔向内；雌蕊1，球形，子房2室，花柱下半部密生白色柔毛， 柱头圆形。浆果球形，有光泽，直径约8mm，成熟时黑色；种子多数扁圆形。 花、果期9-10月。

本发明的有益效果是：

光毒作为阳热之邪侵袭人体，其皮损表现为红斑灼热，还可出现水疱、渗 液、糜烂等湿热浸淫表现，肿胀刺痛，且可见口干欲饮、心烦易怒、大便干结、 小便短黄等症状，采用青蒿、水牛角、生地黄、秦艽、牡丹皮、赤芍、防风和 甘草等八味药物，可清热除湿、凉血消斑，缓解红斑、水疱等体征，且可缓解 皮疹肿胀、灼热刺痛、口干欲饮、心烦易怒、大便干结、小便短黄等症状，既 可治疗光敏感性皮肤病，亦可提高患者对日光毒邪的耐受性及适应性。

光毒作为阳热之邪侵袭人体，首先伤及人体气分，其皮损表现为红斑灼热， 肿胀刺痛，且可见口干欲饮、大便干结、小便短黄等症状，故针对重症者，此 时可在以上八味药物的基础上加用凌霄花、石膏、金银花和龙葵，用以清热解 毒药、清热泻火药清解气分之热。

若光毒之热毒入里，劫灼阴液，除外皮损表现，甚可出现发热、头痛甚则 谵妄，此时为热入血分，则“入血就恐耗血动血，直须凉血散血”，可在以上 八味药物的基础上加用白茅根，用以清热凉血之品清血分之热；光毒热邪久而 伤阴，可在以上八味药物的基础上加用地骨皮用以清热养阴。

夏季为光敏感性皮肤病的多发季节，暑乃夏季之主气，暑多挟湿，因而此 时皮肤受日光暴晒后不仅可出现红斑丘疹，还可出现水疱、渗液、糜烂等湿热 浸淫表现，多伴有舌苔黄腻、脉滑数等湿热蕴结之征象，此时可在以上八味药 物的基础上加用茵陈、栀子、黄芩、苦参和薏苡仁，用以清热燥湿。

总之，本发明充分发挥中医药“简、便、廉、验”的优势特点，具有改善 皮肤光敏感状态，清热解毒、凉血化斑的效果，缓解患者临床症状，疗效较佳， 副作用小的优点。

附图说明

图1为急性UVB辐射后不同处理组BALB/c小鼠皮肤Bcl-2表达的免疫组化 染色评分。

图2为急性UVB辐射后不同处理组BALB/c小鼠皮肤组织蛋白酶D表达的 免疫组化染色评分。

图3为急性UVB辐射后不同处理组BALB/c小鼠皮肤Bid表达的免疫组化染 色评分。

图4为急性UVB辐射后不同处理组BALB/c小鼠皮肤Bax表达的免疫组化 染色评分。

图5为不同处理组小鼠皮肤中蛋白的Western Blot表达条带，从左向右依次 为正常对照组，阴性对照组，中药干预组，阳性对照组；其中位于上层的为 Caspase-3蛋白的Western Blot表达条带，位于下层的为Beta actin蛋白的Western  Blot表达条带。

图6为急性UVB辐射后不同处理组BALB/c小鼠皮肤Caspase-3与Beta actin 蛋白表达的净光密度值比值

图7为不同处理组小鼠皮肤中蛋白的Western Blot表达条带，从左向右依次 为正常对照组，阴性对照组，中药干预组，阳性对照组；其中位于上层的为 Caspase-9蛋白的Western Blot表达条带，位于下层的为Beta actin蛋白的Western  Blot表达条带。

图8为急性UVB辐射后不同处理组BALB/c小鼠皮肤Caspase-9与Beta actin 蛋白表达的净光密度值比值

具体实施方式

本发明继承名老中医的经验，深入研究，充分发挥中医药“简、便、廉、 验”的优势特点，开发出针对光敏感性皮肤病的有效药物，可改善患者的皮肤 的光敏感状态，疗效可靠，安全性高，副作用小。

具体而言，本发明提供了一种治疗光敏感性皮肤病的药物组合物，其含有 下述组分：青蒿、水牛角、生地黄、秦艽、牡丹皮、赤芍、防风和甘草。

在本发明的一种优选实施方式中，治疗光敏感性皮肤病的药物组合物，按 重量份计，由下述几种组分制成：青蒿15～30份；水牛角15～20份；生地黄 12～15份；秦艽5～10份；牡丹皮10～15份；赤芍10～15份；防风5～8份；和 甘草5～10份。

在本发明的另一种优选实施方式中，治疗光敏感性皮肤病的药物组合物， 按重量份计，由下述几种组分制成：青蒿15～30份；水牛角15～20份；生地黄 12～15份；秦艽5～10份；牡丹皮10～15份；赤芍10～15份；防风5～8份；甘 草5～10份；凌霄花7～9份；石膏20～30份；金银花10～15份；和龙葵8～9份。

在本发明的又一种优选实施方式中，治疗光敏感性皮肤病的药物组合物， 按重量份计，由下述几种组分制成：青蒿15～30份；水牛角15～20份；生地黄 12～15份；秦艽5～10份；牡丹皮10～15份；赤芍10～15份；防风5～8份；甘 草5～10份；和白茅根15～30份。

在本发明的又一种优选实施方式中，治疗光敏感性皮肤病的药物组合物， 按重量份计，由下述几种组分制成：青蒿15～30份；水牛角15～20份；生地黄 12～15份；秦艽5～10份；牡丹皮10～15份；赤芍10～15份；防风5～8份；甘 草5～10份；和地骨皮10～15份。

在本发明的再一种优选实施方式中，治疗光敏感性皮肤病的药物组合物， 按重量份计，由下述几种组分制成：青蒿15～30份；水牛角15～20份；生地黄 12～15份；秦艽5～10份；牡丹皮10～15份；赤芍10～15份；防风5～8份；甘 草5～10份；茵陈10～15份；栀子8～10份；黄芩5～10份；苦参6～9份；和薏 苡仁15～30份。

同时，根据病人的具体情况，还可以酌情增加其他的药物。

本发明还提供了一种治疗光敏感性皮肤病的中药制剂，其通过含有所述的 药物组合物的原料制成。

本发明同时提供了一种治疗光敏感性皮肤病汤剂的制备方法，其特征在 于，包括如下步骤：将以上任一所述的药物组合物的原料加8倍水浸泡 20-40min，煎煮40-60min，分出水煎剂；向剩余药材中加6倍水，煎煮40-60min 后过筛，然后分出水煎剂；最后合并所有水煎剂。

以上所述的药物组合物或以上所述的中药制剂在制备治疗光敏感皮肤病 药物中的应用。

以上所述的药物组合物或以上所述的中药制剂在制备治疗多形性日光疹 药物中的应用。

以上所述的药物组合物或以上所述的中药制剂在制备治疗热毒蕴肤证光 敏感性皮肤病药物中的应用。

以上所述的药物组合物或以上所述的中药制剂在制备治疗由280-340nm 的中波紫外线辐射引起的光敏感皮肤病药物中的应用。

以上所述的药物组合物或以上所述的中药制剂在制备治疗皮肤中包括呈 现Bid、Bax、Bad、组织蛋白酶D、Caspase-3或Caspase-9蛋白中的一种或几 种以上含量升高现象，或者在制备治疗皮肤中包括呈现Bcl-2、Bcl-x或Bcl-w 蛋白中的一种或几种以上含量降低现象的皮肤病药物中的应用。

下面通过具体实施例来阐述本发明的实施过程和技术效果，本领域技术人 员应当理解的是，这不应被理解为对本发明权利要求范围的限制。

本发明实施例中所用的各中药组分和设备均是商购的。

其中各中药组分的具体来源列于下面的表1中。

表1本发明实施例中用到的各原料组分厂商

组分 出售厂家及批号

青蒿 北京杏林药业有限责任公司，批号11081302 水牛角 北京杏林药业有限责任公司，批号11091501 生地黄 北京杏林药业有限责任公司，批号12021901 秦艽 北京杏林药业有限责任公司，批号11031701 牡丹皮 北京杏林药业有限责任公司，批号11062301 赤芍 北京杏林药业有限责任公司，批号10010802 防风 北京杏林药业有限责任公司，批号12031901 甘草 北京杏林药业有限责任公司，批号11113001 普洱茶 玉溪市维和生物技术有限公司，批号20090420 糊精(食品级) 西王药业有限公司，批号2012052 淀粉(食品级) 涿鹿玉晶淀粉有限公司，批号20120527 焦糖色素 上海爱普食品有限公司，批号20120519

实施例一

实施例一从临床研究和实验研究两部分分别进行描述。

第一部分临床研究

下面将从研究目标、研究内容、研究对象和方法、研究结果以及研究结论 五个部分来阐述。

一、研究目标

研究中医药防治光敏感性皮肤病的特色治疗方剂，形成中医临床诊疗技术 与方案，为其治疗提供新的途径和效果。

二、研究内容

1.应用现代流行病学方法，采用随机、双盲、安慰剂对照和多变量统计 分析方法，观察多形性日光疹的皮损面积、皮疹颜色、皮疹形态等临床体征， 及瘙痒程度、心烦、口渴、尿黄、大便干、舌质、舌苔等中医证候，进行客观 定量评分观察。

2.进行安全性观察。

3.利用先进的MED/MPD测试系统(德国Waldmann公司生产)，客观准 确定量地测定患者治疗前后皮肤最小红斑量(MED)值，以系统规范判断治 疗作用机制。

三、研究对象和方法

1.研究对象

1.1诊断标准

(1)西医诊断标准：参照《临床皮肤病学》、《现代皮肤性病学》、《杨国 亮皮肤病学》^[1-3]，制订多形性日光疹诊断标准。曝光病史，接受相对强烈的 日光照射后2小时至5天后；皮损以光暴露部位为主，暴露部位发生多形性皮 疹，可表现为红斑、丘疹、水肿性斑块和水疱，而每个患者常以一种皮疹为主 要表现；病程反复，多在春季及夏初发病，常复发；部分患者有光感家族史。 皮疹自觉瘙痒。

(2)中医病证诊断标准：“日晒疮”热毒蕴肤证临床证候标准(参照《中 西医结合皮肤性病学》、《皮肤病中医特色治疗》、《中药新药临床研究指导原则》 ^[4-6])：主症：日光曝晒之后，身体裸露皮肤鲜红灼热，表面光亮，甚则肿胀明 显；或日光曝晒之后，见红血疹集簇；或日光曝晒之后，见水疱集簇，局部糜 烂结痂。次症：口渴；小便短赤；局部灼热刺痛或瘙痒；舌红苔薄白或黄，脉 滑数。凡具备以上主症1项，酌加次症，即可诊断为日晒疮，热毒蕴肤证。

1.2纳入标准

(1)符合西医多形性日光疹诊断标准；

(2)符合中医热毒蕴肤证“日晒疮”证候诊断标准；

(3)年龄18～65岁。

(4)病情严重程度：5cm²<皮疹面积<20cm²。

(5)病程：纳入研究前本次病程时间不超过两周。

1.3排除标准

(1)暴露部位的其他炎症性皮肤病，如染发皮炎、接触性皮炎等；

(2)患有光敏感性增加的系统性疾病如红斑狼疮、皮肌炎等；

(3)合并心脑血管、肝肾、内分泌、造血系统等严重原发性疾患，或精 神疾患等影响实验完成者；

(4)妊娠或哺乳妇女；

(5)已知或可疑对研究药物成分过敏者；

(6)伴呼吸困难、胸闷、心悸、气促、恶心、呕吐、头晕等其他系统不 适症状者。

(7)正在参加其他药物临床试验的患者。

(8)研究者认为不宜参加本试验者。

1.4病例的脱落与处理

(1)脱落病例的标准：所有填写了知情同意书并筛选合格进入试验的受 试者，均有权利随时退出临床试验，无论何时何因退出，只要没有完成方案所 规定观察周期的受试者，称为脱落病例。

(2)可能的原因：发生不良事件、发生并发症、或特殊生理变化不宜继 续接受试验、缺乏疗效、违背试验方案(包括依从性差者)、失访(包括受试 者自行退出、受试者工作环境变动等)、被申办者中止和其它等。统计分析时 应结合实际情况处理，如发生不良反应者应计入不良反应的统计；因无效而自 行脱落者应计入疗效分析。

(3)病例脱落的处理：当受试者脱落后，研究者应尽可能与受试者联系， 完成所能完成的评估项目，并填写试验结论表，尽可能记录最后一次服药时间。 对因不良反应而脱落者，经随访最后判断与试验药物有关者，应必须记录在 CRF表中，并通知中心课题负责人。

1.5研究病例的终止

发生严重不良反应的受试者，根据研究者判断应终止该病例临床试验者； 病程中病情加重，出现严重并发症或病情迅速恶化者应中止试验者；试验中出 现了其他影响试验观察的病证，根据研究者判断应中止试验者；研究者从医学 角度考虑受试验者有必要中止试验者；临床试验方案实施过程中发生了重要偏 差，如依从性太差等，难以评价药物效应者；受试者认为缺乏疗效，自愿退出 者；受试者在临床试验方案实施过程中不愿意继续进行临床试验者。

1.6研究病例的剔除

纳入后发现不符合纳入标准的病例，予以剔除。

2.研究方法

2.1样本量计算方法及数值

采用随机、双盲、对照的临床研究方法，进行分组。将受试者分为治疗组 与对照组。根据统计学的要求、参考文献、临床病例分布及伦理学要求，治疗 组和对照组按1：1对照原则。

治疗组＝99例，对照组＝99例。

2.2随机方法和流程

用计算机统计软件产生随机数字和相应的药品编码，医生按随机号开出符 合入组程序的处方，写明受试者的随机号。受试者持专用处方领取药品。发药 人员核对处方并登记后，发放相应药物，并强调用药注意事项，受试者签字领 药。

2.3治疗方法

(1)治疗组：将由下述组分制成的中药方药作为治疗组的给药处方：青 蒿30份、水牛角15份、生地黄15份、秦艽10份、牡丹皮15份、赤芍15 份、防风6份和甘草6份。

分别称取青蒿90kg、水牛角45kg、生地黄45kg、秦艽30kg、牡丹皮45kg、 赤芍45kg、防风18kg和甘草18kg八味药物，备用，然后制备水煎剂，其制 备方法如下：

将称好的药材投入煮提灌中，加8倍量的水浸泡30分钟，然后煎煮50 分钟，分出水煎剂，向剩余药材中加6倍量水煎煮50分钟，合并药液并采用 160目筛网过滤，蒸发皿浓缩至药液量为300L。然后每瓶灌装100ml，每箱装 40瓶，共75箱。灌装完成之后立即采用辐射灭菌。

服药方法：于早餐后1小时及晚餐后1小时，每次口服50ml，同时给予 3％硼酸溶液外用湿敷10min，1次/日。

(2)对照组：根据多形性日光疹的临床特点并符合伦理学要求，应用安 慰剂。安慰剂其物理特性如外观、颜色、剂型、重量、味道和气味都与试验药 物相仿，但不含有研究药物的有效成份。

服药方法：于早餐后1小时及晚餐后1小时，每次口服50ml，同时给予 3％硼酸溶液外用湿敷10min，1次/日。

安慰剂按照以下处方，生产3000瓶，每瓶100ml。

制法如下：淀粉、糊精用少量水沏开，普洱茶用水煮沸，把沏开后的淀粉、 糊精缓缓的加入到煮沸的普洱茶中，不断搅拌，煮沸50分钟，部分水分挥发， 过滤，加入焦糖色混匀，定容至300L即可。灌装完后辐射灭菌。

治疗组和对照组均给药4周，观察并记录治疗结果。同时治疗期间停用其 他一切相关治疗药物。

2.4疗效指标及判定标准

(1)西医临床体征面积和疾病严重程度评分指标

参照《临床皮肤病学》、《现代皮肤性病学》、《杨国亮皮肤病学》^[1-3]结合 制订多形性日光疹临床体征面积和疾病严重程度评分指标标准，以客观评定临 床疗效。

表2多形性日光疹临床体征面积和疾病严重程度评分指标标准

其疗效判定标准如下：

按照以上标准，记录治疗组和对照组患者在治疗开始后的第1、14、28 天的积分情况，参照《中药新药临床研究指导原则》，根据下列公式计算症状 改善率，评价疗效。

综合疗效指标＝靶皮损[治疗前(面积+颜色+形态)积分－治疗后(面积+ 颜色+形态)积分]/治疗前积分×100％。

临床痊愈：皮损全部消退，症状基本消失，积分值减少≥90％；

显效：皮损大部分消退，症状明显减轻，90％>积分值减少≥60％；

有效：皮损部分消退，症状有所改善，60％>积分值减少≥30％；

无效：皮损消退不明显，症状未见减轻，甚或加重，积分值减少不足30 ％。

愈显率：(临床痊愈例数+显效)/可供疗效评价的病例总数×100％。

总有效率：(临床痊愈例数+显效+有效)/可供疗效评价的病例总数×100 ％。

即临床痊愈：疗效指数为90％～100％；显效：疗效指数为60％～89％；有 效：疗效指数为30％～59％；无效：疗效指数为0～29％。

同时参照EASI评分法，对治疗组与对照组治疗前后EASI改善进行评价， 其评价标准如下：

EASI评分法，是1998年Charil及Hanifin等参照银屑病的评分法，根据 特定性皮炎的特点提出的湿疹面积及严重度指数(eczema area and severity  index，简称EASI)评分法。同时，改良后的该法可用于其他皮炎湿疹的评分。 该法并未将瘙痒纳入评分中，从而避免了主观因素的影响。

其临床表现分为四项，即红斑(E)，丘疹/水肿(I)，表皮剥失(Ex)，苔 藓化(L)，每一临床表现的严重度以0～3分计分，其中：

0分＝无，此体征仔细观察后也不能确定

1分＝轻，此体征确实存在，但需仔细观察才能见到

2分＝中，此体征可立即看到

3分＝重，此体征非常明显

EASI评分时间为每周复诊时，总疗程为4周。

(2)中医主要临床证候评分指标

参照《中西医结合皮肤性病学》、《皮肤病中医特色治疗》、《中药新药临床 研究指导原则》^[4-6]，结合多形性日光疹的中医证候特点，采用症状积分表的 方法，通过治疗前后症状体征证候积分的变化，以客观评定临床疗效。

表3多形性日光疹中医主要临床证候评分指标

(3)最小红斑量(MED)测定

在特定条件下，人体皮肤接受紫外线照射后出现肉眼可辨的最弱红斑需要 一定的照射剂量，即皮肤红斑阈值，通常称之为最小红斑量(minimal erythema  dose，MED)，单位为J/cm²。

设备：采用德国Waldmann公司生产的MED/MPD测试系统测定。光源 为德国Waldmann公司UV801治疗仪产生，其中UVA(长波紫外线)波长为 320－400nm，UVB(中波紫外线)280－340nm，应用该公司生产的皮肤最小 红斑量和UV强度测试仪测定。

方法：根据不同皮肤类型设定不同照射剂量，测定部位选择患者后背或腹 部无皮损衣物覆盖区。终点指标为照射后24h照射部位刚可察觉(无明显边 界)的红斑。

2.5安全性观察指标

血、尿常规、肝功能(ALT、AST)、肾功能(Bun、Cr)：治疗前、治疗 后各检查1次。

不良事件：用药后复诊时询问并记录患者可能出现的不良反应及程度，皮 肤损害是否加重，或其他不良反应。详细记录不良反应的表现症状、发生时间、 持续时间、与试验药物相关性(无关、可能无关、可能相关、相关)，采取的 措施及转归等。不良反应发生率＝不良反应发生例数/总病例数×100％。

3.统计分析方法

3.1符合方案数据分析

所有符合试验方案、依从性好、试验期间未服禁止用药、完成CRF规定 填写内容的病例，或服用试验用药数量在80％～120％者，对其疗效进行统计分 析。

3.2统计分析及内容

(1)统计分析将采用SPSS 15.0统计分析软件进行计算。

(2)所有的统计检验均采用双侧检验，P值小于或等于0.05将被认为所 检验的差别有统计意义。不同试验组各次就诊的计量资料将采用均数上标准差 进行统计描述。与筛选期基础值进行比较，采用配对t检验比较组内前后差异。 两组治疗前后的变化采用方差分析(ANOVA)和Wilcoxon秩和检验进行比 较。

(3)不同试验组各次就诊的计数资料采用频数(构成比)进行统计描述。 两组治疗前后的变化采用卡方检验。

(4)脱落分析：两组总脱落率和由于不良事件而脱落率的比较将采用卡 方检验。

(5)基础值的均衡性分析：采用方差分析或卡方检验来比较人口学资料 和其它基础值指标，以衡量两组均衡性如何。

(6)有效性分析：采用方差分析方法评估有效性指标。

(7)安全性分析：卡方检验采用比较两组不良事件发生率，并列表描述 本次试验所发生的不良事件；实验室检验结果在试验前后正常/异常的变化情 况以及发生异常改变时与试验药物的关系。

四、研究结果

所有研究病例均来源于各研究中心的住院及门诊患者，符合中西医纳入标 准，共198例，其中脱落26例(治疗组共脱落11例，0例因副作用，11例失 访，0例其他原因；对照组共脱落15例，0例因副作用，15例失访，0例其他 原因)，因此纳入病例共计172例，其中治疗组88例，对照组84例，具体数 据见表4。

表4病例分布

  治疗组 对照组 入组数 99 99 完成数 88 84 脱落数 11 15 全分析集(FAS) 99 99 符合方案集(PPS) 88 84

(一)一般资料

本研究治疗组88例，年龄23-65岁，平均48.5岁；男性18例，女性70 例；病程1月-46年，平均12.3年；家族史23例。对照组84例，年龄23-63 岁，平均44.3岁；男性12例，女性72例；病程1月-42年，平均11.9年；家 族史19例。经t检验、卡方检验，P值均＞0.05，患者年龄、性别、家族史、 甲状腺疾病史以及病程方面的具体资料见表5，从表5可以看出，两组资料在 年龄、性别、家族史、甲状腺疾病史以及病程方面均无显著差异，两组资料具 有可比性。同时对患者皮损形态进行分析，包括皮损红斑、丘疹、水疱、渗出、 糜烂以及苔藓样变的患者数以及百分比，具体资料见表6。从表6可以看出， 两组患者皮损均以红斑、丘疹为主要表现，两组之间并无显著差异性。

表5一般资料、病史及治疗史检验

表6治疗组与对照组皮损表现

  治疗组 对照组 红斑(例数，百分比) 88(100％) 84(100％) 丘疹(例数，百分比) 85(96.6％) 82(97.6％) 水疱(例数，百分比) 11(12.5％) 9(10.7％) 渗出(例数，百分比) 16(18.2％) 15(17.9％) 糜烂(例数，百分比) 6(6.8％) 5(6.0％) 苔藓样变(例数，百分比) 34(38.6％) 32(38.1％)

(二)治疗组与对照组临床综合疗效评价

1.分别对治疗组和对照组患者治疗前后的临床各项指标记录积分情况， 治疗四周后，根据临床综合疗效的判定标准，计算症状改善率，评价其疗效， 评价结果见表7。研究结果显示治疗组共88例，其中痊愈39例，显效23例， 有效16例，无效10例；对照组共84例，其中痊愈8例，显效20例，有效 22例，无效34例。结果显示治疗组痊愈率、显效率及有效率明显高于对照组， 而无效率则明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表7治疗组与对照组临床综合疗效评价n(％)

2.治疗组与对照组治疗前后EASI改善评价

表8治疗前后EASI评分比较

  治疗组 对照组

第1次访视(治疗0周) 1.93±1.15 2.11±1.33 第2次访视(治疗1周)，改善％ 0.89±1.25，53.9 1.53±1.19，27.5 第3次访视(治疗2周)，改善％ 0.41±0.52，78.8 1.13±0.79，46.4 第4次访视(治疗3周)，改善％ 0.26±0.42，86.5 1.02±0.61，51.7 第5次访视(治疗4周)，改善％ 0.19±0.41，90.2 0.91±0.44，56.9

从表8治疗前后EASI评分中可以看出，本研究治疗组治疗前后EASI评 分改善率明显高于对照组。将治疗组与对照组治疗前比较，其中t＝0.173， P＝0.863，无明显差异，具有可比性；治疗组治疗前后比较t＝7.36，P＝0.013， 对照组治疗前后比较t＝4.71，P＝0.041，具有统计学差异，说明治疗组及对照 组对多形性日光疹的症状改善均有一定疗效。同时将治疗组与对照组治疗后的 效果进行比较，t＝4.21，P＝0.032，两组之间具有统计学差异，说明治疗组的疗 效较对照组较好。

3.治疗组与对照组治疗前后临床体征改善评价

表9两组治疗前后临床体征变化

其中，P*值代表治疗组与对照组两组患者治疗后临床症状改善比较。

对表9中的数据进行比较分析，可以看出：

(1)对治疗组和对照组患者治疗前的红斑数据分析比较，其中t＝0.256， P＝0.799，无显著差异，具有可比性；对治疗组患者自身治疗前后对照比较， 其中t＝3.122，P＝0.026，表现出差异，有显著性，显示出较好的治疗效果；对 照组患者治疗前后自身对照比较，t＝2.782，P＝0.042，表现出差异，具有显著 性，显示出较好的治疗效果；对治疗组和对照组治疗后的红斑数据分析比较， 其中t＝2.791，P＝0.039，表现出差异，具有显著性，治疗组较对照组差异具有 统计学意义。

(2)对治疗组和对照组患者治疗前的丘疹数据分析比较，其中t＝0.372， P＝0.876，无显著性差异，具有可比性；对治疗组患者自身治疗前后对照比较， 其中t＝2.671，P＝0.031，表现出差异，具有显著性，显示出较好的治疗效果； 对照组患者治疗前后自身对照比较，其中t＝3.152，P＝0.043，表现出差异，具 有显著性，具有较好的治疗效果；对治疗组和对照组治疗后的丘疹数据分析比 较，其中t＝2.613，P＝0.045，表现出显著性差异，治疗组较对照组差异具有统 计学意义。

(3)对治疗组和对照组患者治疗前的水疱数据分析比较，其中t＝0.413， P＝0.692，无显著性差异，具有可比性。治疗组治疗前后自身对照比较，其中 t＝2.412，P＝0.047；对照组治疗前后自身对照比较，其中t＝2.612，P＝0.044， 对两组治疗后的水疱数据分析比较，其中t＝1.248，P＝0.221；治疗组和对照组 治疗前后对水疱改善程度均具有统计学差异，但两组间差异无明显统计学意 义。

(4)对治疗组和对照组患者治疗前的渗出数据分析比较，其中t＝0.379， P＝0.657，无显著性差异，具有可比性；治疗组治疗前后自身对照比较，其中 t＝1.673，P＝0.042；对照组治疗前后自身对照比较，其中t＝1.724，P＝0.045， 对两组治疗后的渗出数据分析比较，其中t＝1.412，P＝0.327；两组治疗前后对 渗出改善程度具有统计学差异，但两组间差异无明显统计学意义。

(5)对治疗组和对照组患者治疗前的糜烂数据分析比较，其中t＝0.452， P＝0.724，无显著性差异，具有可比性；治疗组治疗前后自身对照比较，其中 t＝2.152，P＝0.043；对照组治疗前后自身对照比较，其中t＝2.122，P＝0.047， 对两组治疗后的糜烂数据分析比较，其中t＝1.132，P＝0.296；两组治疗前后对 糜烂改善程度具有统计学差异，但两组间差异无明显统计学意义。

(6)对治疗组和对照组患者治疗前的苔藓化数据分析比较，其中t＝0.457， P＝0.723，无显著性差异，具有可比性；治疗组治疗前后自身对照比较，其中 t＝1.632，P＝0.039；对照组治疗前后自身对照比较，其中t＝1.735，P＝0.041， 对两组治疗后的苔藓化数据分析比较，其中t＝2.927，P＝0.312；两组治疗前后 对苔藓化改善程度具有统计学差异，但两组间差异无明显统计学意义。

(7)对治疗组和对照组患者治疗前的面积数据分析比较，其中t＝0.491， P＝0.625，无显著性差异，具有可比性；治疗组治疗前后自身对照比较，其中 t＝0.891，P＝0.032；对照组治疗前后自身对照比较，其中t＝1.042，P＝0.046， 两组治疗前后对面积改善程度差异具有显著性，具有统计学意义；对两组治疗 后的面积数据分析比较，其中t＝0.942，P＝0.041，治疗组较对照组差异具有统 计学意义。

(三)治疗组与对照组中医主要临床证候评价

表10两组中医症状改善情况

其中，P*值代表治疗组与对照组两组患者治疗后中医症状改善情况比较。

从表10的结果可以看出，本研究中治疗组对部分中医症状(包括瘙痒、 心烦)的改善均有良好的效果，相较对照组差异具有统计学意义。治疗前两组 患者中医症状比较，瘙痒程度t＝-0.924，P＝0.721；心烦t＝1.125，P＝0.690；口 渴t＝1.372，P＝0.402；小便黄赤t＝1.132，P＝0.513；大便干燥t＝1.421，P＝0.419， 各项症状差异均不显著，具有可比性。治疗后两组患者中医症状比较，瘙痒程 度t＝3.427，P＝0.037；心烦t＝3.215，P＝0.045；口渴t＝4.132，P＝0.145；小便 黄赤t＝2.891，P＝0.762；大便干燥t＝2.971，P＝0.651，其中治疗组对瘙痒程度 及心烦程度的改善较对照组差异具有统计学意义，而在口渴、小便黄赤、大便 干燥方面，两组之间虽无明显差异性，但治疗组的改善率较对照组稍高。综合 而言，治疗组对缓解患者瘙痒及心烦程度较对照组有更好的效果，能有效的提 高患者的日常生活治疗。

(四)最小红斑量(MED)测定

表11治疗组与对照组治疗前后MED值比较

将治疗组与对照组治疗前的UVA-MED与UVB-MED数据分别进行分析， 其中UVA-MED(t＝0.79，P＝0.495)，UVB-MED(t＝1.231，P＝0.402)均未表 现出显著差异，具有可比性。治疗组治疗前后的UVA-MED与UVB-MED数 据分别分析比较，其中UVA-MED(t＝3.291，P＝0.032)，UVB-MED(t＝3.241， P＝0.029)均表现出显著性差异。对照组治疗前后的UVA-MED与UVB-MED 数据分别分析比较，其中UVA-MED(t＝1.413，P＝0.274)与UVB-MED(t＝1.701， P＝0.095)均未表现出显著性差异。

(五)安全性评价

治疗组中有11例患者服药后出现一过性腹泻现象，嘱患者减少用药剂量， 症状得以缓解，并坚持完成临床观察；未发现血常规、血常规、便常规+潜血、 肝肾功能治疗后较治疗前明显异常。

五、研究结论

多形性日光疹(PLE)属于日光性皮肤病的一种，在西医范畴，本病被认 为是光诱导皮肤产生的一种内源性抗原所引起的一种迟发型变态反应；中医将 本病归于“日晒疮”范畴，系患者先天禀赋不耐，或素体湿热内蕴，加以春夏 季皮肤腠理不密，外受阳光毒热之邪，内外之邪相搏于肌肤，郁久化热，毒热 侵袭肌肤而致病。

北京中医医院皮肤科在大量前期基础、临床研究及专家临床实践基础上， 依据赵炳南老先生临床经验，认为光敏感性皮肤病是由光热毒邪炽盛蕴于肌肤 所致，故治疗上法以清热解毒、凉血化斑，并研制出中药方药治疗光敏感性皮 肤病。

本研究结果应用随机双盲安慰剂对照临床研究，研究表明治疗组痊愈率、 显效率及有效率明显高于对照组，而无效率则明显低于对照组，差异具有统计 学意义(P＜0.05)，说明中药方药治疗多形性日光疹具有较好的疗效。

两组EASI评分方面，治疗组及对照组均有不同程度的改善，但治疗组评 分较对照组显著降低，说明治疗组方药有较好的疗效。治疗组至第2周时患者 评分均数较治疗前评分均数下降较为明显，此时已初步显示出治疗效果(达到 有效标准：评分减少30～59％)，说明中药治疗多形性日光疹起效快，效果好。

入组患者在治疗前均存在一定的红斑、丘疹、水疱等不同形态皮损，治疗 前两组患者体征间的差异不具有统计学意义。治疗组自身治疗前后相较于对照 组，其中红斑、丘疹、及皮损面积的差异具有统计学意义，说明中药方药可有 效改善多形性日光疹患者的临床体征。本研究结果表明中药干预组较对照组在 改善瘙痒、心烦等症状方面疗效为优，差异具有统计学意义(P＜0.05)，说明 口服中药对改善患者的瘙痒、心烦等不适方面具有较好效果，可较好的提高患 者生活质量。

治疗组患者治疗前后血、尿常规及肝功能检测均未发现明显异常；研究过 程中患者的耐受性良好，没有严重不良反应的报道。

综上所述，本研究以中药方药与安慰剂进行随机、双盲、对照临床疗效研 究，表明中药方药总有效率为88.6％，对照组的总有效率为59.5％，具有统计 学差异；经治疗患者皮损颜色变淡，皮疹消退，面积缩小；且中药方药可显著 缓解患者的瘙痒、心烦、口干等症状，说明本发明中药方药治疗多形性日光疹 疗效显著，安全性好，毒副作用小。

第二部分实验研究

小鼠皮肤光损伤模型细胞凋亡机制的基础研究

一、实验材料

1.实验仪器及产地

Leica EG1160包埋机，德国；

H93/RM2126切片机，德国；

尼康显微镜ECLIPSE LV100POL/50IPOL，日本；

SHA-C水浴锅，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；

沸水浴箱，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；

恒温水浴锅，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；

OLYMPUS BX-41荧光显微镜及NIKON DIGITAL SIGHT彩色CCD，日 本；

Image Pro Plus6.0数据分析软件，Media Cybernetics公司；

高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；

酶标仪，Thermo Fisher Scientific；

转膜仪，上海天能科技有限公司；

电泳仪，Bio-Rad，USA；

酸度计，德国赛多利斯集团；

振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

匀浆器，Fluka公司；

试管，爱思进生物技术(杭州)有限公司；

微量移液器，北京吉尔森科技有限公司；

漩涡混匀器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；

37℃水浴箱，上海博讯实业有限公司；

2.实验试剂

采用本领域常用的实验试剂，其中主要试剂生产厂商如下：

免疫组化染色试剂盒(包括Bax、Bid、Bcl-2、组织蛋白酶抗体，Cat.No. 85-6743)，Invitrogen，USA；

DAB Kit(Cat.No.00-2014)，Invitrogen，USA)；

组织蛋白裂解液，优科卓业生物医学技术(北京)有限公司；

BCA蛋白定量试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；

蛋白标准品，北京博迈德生物技术有限公司；

PVDF膜，0.45um，Merck Millipore，USA；

丙烯酰胺，Amresco，USA；

甲叉丙烯酰胺，Amresco，USA；

甘氨酸，Sigma，USA；

十二烷基磺酸钠，Sigma，USA；

过硫酸铵，Amresco，USA；

TEMED，Amresco，USA；

吐温-20，Amresco，USA；

溴酚蓝，Amresco，USA；

二硫苏糖醇，Amresco，USA；

三羟基氨基甲烷，Sigma，USA；

蛋白酶抑制剂，Roche，瑞士；

脱脂牛奶，伊利脱脂牛奶；

ECL发光液，Millipore，USA；

甲醇，国药控股股份有限公司；

氯化钠，国药控股股份有限公司；

丽春红染色液，碧云天生物技术有限公司；

细胞骨架蛋白beta-actin，北京中杉金桥生物技术有限公司；

辣根过氧化物标记山羊抗兔子二抗，Jackson Immuno Research  Laborations，InC.；

辣根过氧化物标记山羊抗小鼠二抗，Jackson Immuno Research  Laborations，InC.；

大鼠抗小鼠caspase-3、caspase-9抗体，Cell Signaling Technology(CST)， USA。

3.实验动物

BALB/c小鼠，购自北京药物研究所动物实验中心，共48只，均为雌性 小鼠，平均体重20g。

4.主要研究药物配制

4.1中药制备

小鼠给药体积：每20g体重给药0.4ml，根据“人和动物体表面积折算的 等效剂量比率表”，以人为70kg，本实验所选具体剂量为：

小鼠用药剂量(g/kg.d)＝人用药剂量*70kg*0.0026/0.02(小鼠重量) (g/kg.d)＝9.1*人的用药剂量＝9.1*112/70＝14.56g/kg.d。

小鼠每日总给药量：14.56g/kg.d×0.02kg×12只＝3.494g，

小鼠每日总给药体积：0.4ml*12＝4.8ml，

给药浓度：3.494g÷4.8ml≈0.73g/ml，

药液体积：112g÷0.73g/ml≈153ml。

中药煎煮液制备：分别称取青蒿30g、水牛角15g、生地黄15g、秦艽10g、 牡丹皮15g、赤芍15g、防风6g和甘草6g，共计112g，浸泡8倍量饮用水浸 泡半小时，煎煮2小时，过滤煎煮液，再加入6倍量饮用水，煎煮1小时，合 并煎煮液，浓缩至153ml。

4.2阳性药物羟氯喹配制

小鼠给药体积：0.4ml/20g体重，根据“人和动物体表面积折算的等效剂 量比率表”，以人为70kg，人最高每日0.4g，即0.2g×2片，本实验所选具体 剂量为：

小鼠用药剂量(g/kg.d)＝人用药剂量×70kg×0.0026/0.02(小鼠重量) (g/kg.d)＝9.1*人的用药剂量＝0.4/70×9.1＝0.052g/kg.d。

小鼠每日给药量：0.052g/kg.d*0.02g*12≈0.0125g，

小鼠每日总给药体积：0.4ml*12＝4.8ml，

给药浓度：0.0125g/4.8ml≈0.0026g/ml，

药液体积：0.2g/0.0026g/ml≈77ml，因此可将2片药溶解在77ml水中。

二、实验方法

1.UVB剂量的测算

应用德国Wa1dmann公司中波紫外线辐射仪，UVB剂量＝UVB辐照度X 时间(S)，照射剂量为300mJ/cm²。时间(S)＝UVB剂量/UVB辐照度＝300mJ/cm²÷1.85mw/cm²＝162s。

2.实验动物处理及UVB急性损伤BALB/c小鼠皮肤模型建立

健康BALB/c小鼠48只，雌性，6～8周左右，体重20g，于实验前适应环 境1周，室温控制在18～22℃(20℃左右)，湿度45～65％，清洁，安静，自由 进食饮水。

小鼠随机分成4组，分别命名为正常对照组、阴性对照组、中药干预组和 阳性对照组，其中正常对照组12只(不应用药物，无紫外线照射)、阴性对照 组12只(应用生理盐水+UVB照射)、中药干预组12只(应用中药方药+UVB 照射)、阳性对照组12只(应用西药羟氯喹+UVB照射)。中药干预组、阳性 对照组、阴性对照组各组分别连续灌药7天，每天灌胃2次，每次0.2ml，最 后一天剔除小鼠背部毛发，暴露其背部皮肤，将小鼠麻醉后固定，再以中波紫 外线300mJ/cm²，进行照射，最后一次实验结束24小时后处死小鼠。

3.取材及组织切片、组织匀浆的制备

(1)材料准备：提前准备好固定架、眼科剪、无菌纱布、EP管、手套、 4％中性甲醛、冰盒。采用脊椎脱臼法处死小鼠，迅速用眼科剪剪下小鼠背部 照光部位皮肤2*3cm。

(2)组织切片制备：剪下1/3的组织，将组织块在4℃冰冷的生理盐水中 漂洗后，立即投入4％多聚甲醛固定(每只小鼠皮肤单独放置于一离心管，标 号)，切取小块，流水冲洗，按照75％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇I、 95％乙醇II、无水乙醇I、无水乙醇II、无水乙醇III顺序，由低向高的梯度脱 水；二甲苯透明；石蜡浸透组织，包埋；修整蜡块，将石蜡切片机厚度调节器 调整到4微米，连续切片；将切片机切下的蜡片分别贴附在载玻片上，然后置 于恒温箱中烘干，备用。

(3)组织匀浆制备：将另外的组织剪成组织块，除去组织块上的血液， 称重，放入5-10ml的小烧杯中；预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂 Protease inhibitor cocktail(Roche)(磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂)， 加入组织块重量的3倍的蛋白抽提试剂，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎(操 作时将盛有组织块的烧杯放入冰水中进行)；加入200ul裂解液于匀浆器中(内 切式组织匀浆机制备)进行匀浆，匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3-5 次，在冰水中进行，重复几次至组织无肉眼可见碎片，然后用涡轮机涡5s， 将制备好的10％匀浆用移液器将裂解液移至lml离心管中；然后用低温低速离 心机于4℃下13000rpm离心20分钟，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-80 ℃保存，为下一步实验做准备。

4.免疫组化测量Bcl-2、Bid、Bax、组织蛋白酶D实验步骤

按照免疫组化染色试剂盒使用说明操作，测量Bcl-2、Bid、Bax、组织蛋 白酶D的表达，其步骤如下：

(1)将组织切片取出并恢复至室温，PBS冲洗3次，每次3分钟。

(2)3％H₂O₂去离子水(无色液体)孵育10分钟，以消除内源性过氧化 物酶活性，PBS冲洗3次，每次3分钟。

(3)滴加试剂A(蓝色液体，封闭用正常血清工作液)室温孵育20分钟， 倾去，勿洗。

(4)滴加适当比例稀释的一抗Bcl-2、Bax(1：400倍稀释)，Bid、组织 蛋白酶D(1：500倍稀释)，放入湿盒内，于4℃过夜。

(5)取出并恢复至室温，PBS冲洗3次，每次3分钟。

(6)滴加试剂B(黄色液体，生物素化二抗工作液)，室温孵育10～15分 钟。

(7)PBS冲洗3次，每次3分钟。

(8)滴加试剂C(橙色液体，辣根酶标记链霉卵白素工作液)，室温孵育 15分钟。

(9)PBS冲洗3次，每次3分钟。

(10)DAB显色剂显色。

(11)自来水充分冲洗(约5分钟)。

(12)苏木素复染，脱水，透明。

(13)中性树脂封片。

(14)显微观察：对制好的切片采用显微镜进行观察，随机选择表达较好 的部位，采集400倍图像一张。

(15)采用Image Pro Plus6.0数据分析软件对图像进行分析，方法如下：

A：打开软件界面，出现相应的选择图标，打开要分析的图片，

B：用矩形工具选择要分析的条带，此矩形框为黄色，选定分析条带；

C：按数字键“1”，弹出另一个图片框，并且在所选定的条带出现红色定 量框；

D：移动黄色分析框到要分析的第二个条带，按数字键“2”，第二条条带 也被定量；依次重复上述操作，直到最后条带被定量框框住。

E：按数字键“3”，出现峰形图；改用直线工具在每个峰形图下面划基线， 可用手形工具移动。

F:点击曲线面积，得到相应的IOD值。

5.Western Blot实验步骤

5.1 BCA法蛋白定量用小鼠组织匀浆，按照BCA蛋白定量试剂盒使用 说明操作，测定蛋白浓度。

(1)根据样品数量，试剂A：B＝50：1配制适量BCA工作液，充分混匀。 BCA工作液室温24小时内稳定。

(2)完全溶解蛋白标准品，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。

(3)将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加至96孔板的标准品 孔中，并用标准品稀释液补足20μl。

(4)将待测样品滴加至样品孔中，用标准品稀释液补足20μl。

(5)各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。

(6)测定A570nm，绘制标准曲线图并计算蛋白浓度。

(7)样品蛋白含量

原样品的蛋白含量(mg/m1)＝稀释倍数×预测Y(ug)/10ul

其中，根据标准曲线图得到方程为：Y＝0.099+1.366x-0.592x²+0.116x³

5.2蛋白浓度调整

以RIPA调整蛋白浓度，使样品终浓度为3.5ug/ul，加入5×蛋白样品缓冲 液，95度孵育5min。

5.3 Western Blot法(蛋白印迹试验)检测Caspase-3、Caspase-9表达水平

(1)根据目的蛋白的分子量，分别配制10％分离胶，5％的浓缩胶。

(2)待检测蛋白样品上样量：28ug/孔

(3)电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压120V，通过预 染蛋白marker来确定电泳停止时间。

(4)湿转法，转膜条件：300mA恒流；0.45um孔径PVDF膜，转膜时间 90min。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。

(5)封闭：将膜完全浸没于5％BSA-TBST中，水平摇床孵育1h(RT)。

(6)一抗孵育：按照下表的要求，用5％BSA-TBST稀释一抗，4℃水平 摇床孵育过夜。

表12一抗来源及稀释比

(7)次日，洗膜：TBST洗3次，每次10min。

(8)二抗孵育：5％BSA-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP和 山羊抗鼠IgG(H+L)HRP 1：10000，室温孵育40min。

洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。

(9)ECL滴加到膜的蛋白面，反应3-5min；胶片曝光：10s-5min(曝光 时间随不同光强度而调整)，显影2min，定影。

5.4结果判断及统计

(1)用Imagine5灰度分析软件分析Caspase-3、Caspase-9和内参条带Beta  actin目标条带的净光密度值并计算出各组Caspase-3、Caspase-9分别与Beta  actin条带的净光密度值的比值。

(2)统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析。 先对数据进行正态检验，再进行方差齐性检验，若方差齐同应用SNK及Dunnett 法，若方差不齐同，进行秩和检验；数据均用表示。每个指标各个组间 进行两两比较。P<0.05为有统计学意义，p<0.01则有显著统计学差异。

三、实验结果

1.免疫组化法测量急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤Bcl-2、 Bid、Bax、组织蛋白酶D表达水平的影响

1.1急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤Bcl-2表达的影响

表13急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤Bcl-2表达的影响

注：*P＜0.05有统计学意义，**P＜0.01有显著统计学意义。

在经UVB(300mJ/cm²)照射后24小时，显微镜下(*400倍)观察BALB/c 小鼠的表皮和真皮中可见大量Bcl-2染色阳性细胞。由于急性单次UVB辐射 剂量较大，与正常对照组相比，阴性对照组BALB/c小鼠表皮Bcl-2染色阳性 细胞明显减少。中药干预组及阳性对照组BALB/c小鼠的表皮和真皮中Bcl-2 染色阳性细胞较阴性对照组有所增加。

对各组免疫组化评分，评分数据见图1，同时对免疫组化评分数据进行正 态检验，每组数据均为正态分布；再对四组数据进行方差齐性检验，方差齐， 应用SNK及Dunnett法计算。

从表13可以看出，中药干预组与正常对照组及与阴性对照组比较，有显 著性差异(P＜0.01)，与阳性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；阳 性对照组与正常对照组及与阴性对照组及中药干预组有显著性差异(P＜ 0.05)。中药方药可减轻急性UVB辐射对BALB/c小鼠皮肤Bcl-2表达的影响， 但其效果逊于羟氯喹。

1.2急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤组织蛋白酶D表达水 平的影响

表14急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤组织蛋白酶D表达的影 响

注：*P＜0.05有统计学意义，**P＜0.01有显著统计学意义。

在经UVB(300mJ/cm²)照射后24小时，显微镜下(*400倍)正常对照组 BALB/c小鼠的表皮和真皮中可见少量组织蛋白酶D染色阳性细胞，与正常对 照组相比，阴性对照组BALB/c小鼠表皮组织蛋白酶D染色阳性细胞明显增 多，中药干预组及阳性对照组BALB/c小鼠的表皮和真皮中组织蛋白酶D染 色阳性细胞较生理盐水组有所减少。

对各组免疫组化评分，评分数据见图2同时对各组免疫组化评分数据进行 正态检验，每组数据均为正态分布；再对四组数据进行方差齐性检验，方差齐， 应用SNK及Dunnett法计算。

从表14可以看出，中药干预组与正常对照组及与阴性对照组比较，有显 著性差异(P＜0.01)，与阳性对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；阳 性对照组与正常对照组及与阴性对照组有显著性差异(P＜0.01)。中药方药可 减轻急性UVB辐射对BALB/c小鼠皮肤组织蛋白酶D表达的影响，但其效果 与羟氯喹类似。

1.3急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤Bid表达水平的影响

表15急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤组织Bid表达的影响

注：*P＜0.05有统计学意义，**P＜0.01有显著统计学意义。

在经UVB(300mJ/cm²)照射后24小时，显微镜下(*400倍)正常对照 组BALB/c小鼠的表皮和真皮中可见少量Bid染色阳性细胞。与正常对照组相 比，阴性对照组BALB/c小鼠表皮Bid染色阳性细胞明显增多。中药干预组 BALB/c小鼠的表皮和真皮中Bid染色阳性细胞较正常对照组仍有明显增多， 但相较阴性对照组有所减少。阳性对照组BALB/c小鼠的表皮和真皮中Bid染 色阳性细胞较生理盐水组有所减少。

对各组免疫组化评分，评分数据见图3，同时对各组免疫组化评分数据进 行正态检验，每组数据均为正态分布；再对四组数据进行方差齐性检验，方差 齐，应用SNK及Dunnett法计算。

从表15可以看出，中药干预组与正常对照组及与阳性对照组比较，有显 著性差异(P＜0.01)，与阴性对照组组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)； 阳性对照组与正常对照组及与阴性对照组有显著性差异(P＜0.01)。中药方药 对急性UVB辐射造成的BALB/c小鼠皮肤Bid表达有一定的抑制作用，但作 用不明显，而羟氯喹效果较好。

1.4急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤Bax表达水平的影响

表16急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤组织Bax表达的影响

注：*P＜0.05有统计学意义，**P＜0.01有显著统计学意义。

在经UVB(300mJ/cm²)照射后24小时，显微镜下(*400倍)正常对照 组BALB/c小鼠的表皮和真皮中可见少量Bax染色阳性细胞，与正常对照组相 比，阴性对照组BALB/c小鼠表皮Bax染色阳性细胞明显增多。中药干预组及 阳性对照组BALB/c小鼠的表皮和真皮中Bax染色阳性细胞较正常对照组仍有 明显升高。

对各组免疫组化评分，评分数据见图4，同时对各组免疫组化评分数据进 行正态检验，每组数据均为正态分布；再对四组数据进行方差齐性检验，方差 齐，应用SNK及Dunnett法计算。

从表16可以看出，中药干预组与正常对照组比较，有显著性差异(P＜ 0.01)，与阴性对照组及阳性对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；阳性 对照组与正常对照组相比有显著性差异(P＜0.01)，与中药干预组及阳性对照 组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。中药方药及羟氯喹可减轻急性UVB 辐射对BALB/c小鼠皮肤中Bax表达的影响，但效果均不明显。

2.Western Blot法检测急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤 Caspase-3、Caspase-9的影响

2.1 Western Blot法检测急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤 Caspase-3的影响

表17 BALB/c小鼠各组皮肤中Caspase-3蛋白与Beta actin净光密度值比值

注：*P＜0.008有统计学意义。

从图5可以看出，在经UVB(300mJ/cm²)照射后24小时，应用Western  Blot法检测Caspase-3表达，可见阴性对照组的Caspase-3明显高于正常对照 组，中药干预组及阳性对照组Caspase-3的表达高于正常对照组，但低于阴性 对照组。

各组净光密度值比值数据见图6，同时对各组净光密度值比值数据进行正 态检验，正常对照组为非正态分布，应用秩和检验各组之间两两比较(P＜0.008 有统计学意义)。

从表17可以看出，阴性对照组与正常对照组比较P＜0.008，阳性对照组 与正常对照组比较、中药干预组与正常对照组比较P值均大于0.008。中药干 预组与阴性对照组、阳性对照组比较差异不显著(P＞0.008)及正常对照组比较 差异有显著性(P＜0.008)。从Caspase-3表达结果来看，中药方药对抑制UVB 辐射引起的表皮角质形成细胞凋亡有一定的作用，但不明显，疗效与羟氯喹类 似。

2.2 Western Blot法检测急性UVB辐射对不同处理组BALB/c小鼠皮肤 Caspase-9的影响

表18 BALB/c小鼠各组皮肤中Caspase-9蛋白与Beta actin净光密度值比值

注：*P＜0.008有显著统计学意义。

从图7可以看出，在经UVB(300mJ/cm²)照射后24小时，应用Western  Blot法检测Caspase-9表达，可见阴性对照组的Caspase-9明显高于正常对照 组，中药干预组及阳性对照组Caspase-9的表达高于正常对照组，但低于阴性 对照组。

各组净光密度值比值数据见图8，同时对各组净光密度值比值数据进行正 态检验，正常对照组及阴性对照组为非正态分布，应用秩和检验两两比较。

从表18可以看出，中药干预组与阴性对照组、阳性对照组、正常对照组 比较无显著性差异(P＞0.008)。阳性对照组与阴性对照组、正常对照组相比也 无差异(P＞0.008)。从Caspase-9表达结果来看，中药方药对抑制UVB辐射引 起的表皮角质形成细胞凋亡有效，其效果与羟氯喹类似，虽在本实验中表现不 明显，但有一定的抑制作用趋势。

四、实验讨论

将紫外线对皮肤造成的光损伤按照对皮肤造成损伤的时间划分，分为急性 光损伤与慢性光损伤。紫外线造成的急性光损伤包括日晒伤反应、色素沉着、 免疫抑制^[1]等；而紫外线造成的慢性光损伤主要表现为光老化。随着现代社会 环境污染的加重，紫外线造成皮肤疾病，尤其是紫外线造成的急性光损伤的几 率也在逐步升高。紫外线造成的急性光损伤可导致皮肤发生病理性改变，如对 细胞凋亡和细胞增殖造成影响，导致细胞周期阻滞，或造成细胞DNA的损伤。 紫外线造成的急性光损伤主要是由中波紫外线(UVB)诱导的，针对这一情 况，许多学者对造成皮肤光损伤的机制进行了探讨，并对许多中药单体对其的 防治作用进行了不懈研究^[2-6]。

在各项对紫外线光损伤防治机制的研究中，许多以往的研究多针对中药单 体，很少针对中药复方进行探讨。本实验针对紫外线急性光损伤的防治，选用 北京中医医院皮肤科自制方药，在光敏感性皮肤病的临床治疗中发挥了较好的 疗效。本课题组前期基础研究建立了BALB/c小鼠皮肤光损伤模型，总结了建 立BALB/c小鼠皮肤光损伤模型所需的UVB照射剂量^[7]，且在体外细胞实验 中研究了中药方药对中波紫外线所致HaCaT细胞增殖活性变化、细胞凋亡及 周期的影响^[8]，为本实验的进一步研究奠定了基础。

本研究针对UVB对皮肤造成的急性光损伤，建立BALB/c小鼠急性光损 伤模型，通过中药干预组、阳性对照组、阴性对照组及正常对照组之间的比较， 从机制上证明本发明中药方药对紫外线造成的急性光损伤具有一定的治疗作 用。UVB造成皮肤急性光损伤的病理过程，这些病理过程均与UVB诱导角质 形成细胞损伤及凋亡有关联^[9]，我们的研究意在揭示中药方药对UVB辐射所 致光敏感性皮肤病的治疗机理。

细胞线粒体凋亡途径与Bcl-家族成员在其中的调控作用息息相关。如今， Bcl-2介导的线粒体凋亡途径已被国内外的许多研究证实，并在各个造成凋亡 的节点中被细化。Bcl-2家族蛋白存在于细胞质或定位于线粒体膜、内质网膜 及核膜上,它们在线粒体水平上调节细胞凋亡^[10]。Bcl-2蛋白属于Bcl-2家族蛋 白中的抗凋亡蛋白，Zerihun Assefa等^[11]通过研究证明，在HaCaT细胞，Bcl-2 的过表达抑制UVB诱导的细胞凋亡，抑制procaspase-3和procaspase-8的活化， 以阻碍上游caspase凋亡信号激活的方式抑制UVB诱导的细胞死亡。

从另一个角度来说，在细胞凋亡的线粒体通路，细胞凋亡的发生也会直接 引起Bcl-2水平的下调，Sudjit Luanpitpong等^[12]研究影响阿霉素诱导细胞凋亡 的机制，发现线粒体超氧化物通过MAP激酶ERK1/2的失活诱导Bcl-2去磷 酸化，从而促进Bcl-2蛋白的泛素化，下调Bcl-2水平，导致细胞凋亡。且许 多研究表明^[10,11]，细胞凋亡对胚胎发育、组织稳态的维持和对恶性转化保护是 至关重要的。

Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡内在通路中起着关键作用，这种关键作用通过 控制线粒体外膜的完整性起作用，Bcl-2过表达可维持紫外线照射细胞溶酶体 膜的完整性，并可以通过抑制ROS的产生和心磷脂的降解以防止细胞色素C 释放^[13-15]。Tejia Zhang^[16]列举神经酰胺和双磷脂酰甘油的两个关键的例子，认 为脂质对Bcl-2家族诱导的线粒体途径的凋亡起着不可忽视的作用。Bax、Bid 蛋白属于Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白。其中，Bid属于BH3-only，通过抑 制Bcl-2抗凋亡成员的活性或激活Bax/Bak样促凋亡成员的活性来调节细胞 凋亡，Bid可插入线粒体外膜形成通道，释放凋亡活性物质^[17,18]。Bax是线粒 体途径的主要介导者^[19]。Bax经活化后，从胞质转入线粒体，线粒体膜通透 性破坏，致Cytc等释放而介导线粒体途径的细胞凋亡^[17]。Yao-Ping Lu等^[20]的研究表明，去毛的Bax基因敲除C57BL/6J小鼠和未经基因敲除的小鼠同 时进行UVB照射(60兆焦耳/平方厘米)。在经UVB照射6小时后，经检测， Bax基因敲除小鼠诱导的细胞凋亡仅有未经基因敲除小鼠的14％。Allal Ouhtit 等^[21]研究，UV辐射后的24-72小时中引起小鼠皮肤细胞凋亡过程中，表现为 Bax高表达，并伴随着Bcl-2的表达降低，这证实了Bax在细胞凋亡中发挥促 凋亡的作用。组织蛋白酶D是调控细胞凋亡的一个限速酶，在角质形成细胞 的凋亡过程中，溶酶体膜的通透性增加，促使其释放组织蛋白酶B和D，组 织蛋白酶D通过激活Bax而导致线粒体膜电位下降，参与凋亡过程^[22]。Heinrich  M等认为，组织蛋白酶D可以使Bid蛋白激活并诱导线粒体途径相关的凋亡 ^[23]。我们通过免疫组化的实验方法，对各组小鼠表皮的Bcl-2、Bax、Bid及组 织蛋白酶D进行检测，其实验结果表明，本发明中药方药可明显升高急性光 损伤小鼠表皮Bcl-2表达，降低组织蛋白酶D的表达；虽然与其他组对比，中 药干预组Bax及Bid表达的降低无统计学意义，但其下降趋势明显，无统计 学意义可能与实验样本量较小及实验重复次数不足相关。故中药方药可抑制由 UVB照射所导致的小鼠表皮细胞凋亡，并体现在对Bcl-2家族蛋白的影响上， 这与以往对Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡中所发挥的作用的类似研究也是相一致 的^[24]，表明中药方药对细胞凋亡的抑制作用同线粒体凋亡通路存在相关性。

在线粒体凋亡通路，经受外界刺激导致Bcl-2家族蛋白激活后，经过一系 列反应，半胱天冬酶家族被激活，引发核蛋白水解，DNA断裂，最终导致细 胞凋亡。半胱天冬酶家族中被研究最多、也最具代表性的两个半胱天冬酶即 Caspase-3、Caspase-9。本实验采用Western Blot法对4个不同实验组的小鼠表 皮中的Caspase-3及Caspase-9进行了检测，实验结果显示，中药干预组的 Caspase-9表达水平与阳性对照组的表达水平类似，虽在统计学上与阴性对照 组相比无统计学意义，但其抑制Caspase-9表达的趋势明显；Caspase-3表达水 平与阴性对照组的对比虽也无统计学意义，但是从表达水平图来看，其降低 Caspase-3表达的的趋势明显，但是其效果不如羟氯喹。在其他的一些研究中， 也证明了细胞凋亡与Caspase-3、Caspase-9呈正相关，据Leverkus M^[25]，Assefa  Z^[26]等人的研究，细胞损伤导致细胞色素C从线粒体释出,其与细胞凋亡激活 因子1(Apaf-1)结合，活化Caspase-9前体，继而激活Caspase-3，引发半胱天 冬酶级联反应，从而诱发细胞凋亡。虽然也有一些最新研究表明^[27-29]，处于凋 亡级联下游的Caspase-3在细胞中也介导许多非细胞凋亡功能，譬如Hadi  Khalil^[30]等通过实验发现，相比于野生型小鼠，Caspase-3缺陷小鼠经UVB辐 射后，其Akt活化蛋白表达阳性百分比降低，并且两者相比有统计学意义，表 明Caspase-3也可保护应激状态下器官对抗细胞死亡，但都是在在某些特殊情 况下发生的。在实验中常常应用Western Blot法、免疫组化法等测量Caspase-3、 Caspase-9等实验指标，并作为衡量一些单体或复合制剂影响细胞凋亡的标准。 Rupesh Dash^[31]等发现一种热带蚕丝丝胶蛋白可抑制Caspase-3及Bcl-2在UVB 损伤的人类皮肤角质形成细胞的表达，表明这种热带蚕丝丝胶蛋白可阻止人类 皮肤角质形成细胞的线粒体损伤，从而抑制细胞凋亡。Mei Jing Piao^[32]等发现， 海藻的乙酸乙酯片段通过调节MAPK和Caspase依赖的信号通路，部分抑制 UVB辐射诱导的人角质形成细胞凋亡，使Caspase-3及Caspase-9的表达降低。 Wan-Wen Lai^[33]等证明了乙醇酸(GA)、UVB及GA偕同UVB抑制HaCaT 细胞增殖并诱导凋亡。尤其是GA偕同UVB对细胞凋亡作用，可通过p21， p53，Bax，Caspase-3，4，9，Endo G和AIF过度表达来体现，证明用GA偕 同UVB诱导细胞凋亡的机制涉及线粒体通路，ER依赖性通路，Caspase依赖 性和非依赖通路等。

综上所述，本研究通过免疫组化、Western Blot等检测各项Bcl-2及其信 号传导的相关指标(Bcl-2、Bax、Bid及组织蛋白酶D，Caspase-3、Caspase-9)， 阐释中药方药对UVB造成的急性光损伤是否与Bcl-2诱导的线粒体凋亡途径 相关。结果表明，中药方药可在一定程度上减轻UVB辐射对小鼠表皮的氧化 损伤作用，抑制UVB辐射诱导的细胞凋亡，虽然本实验的一些结果显示，中 药方药对细胞凋亡的抑制趋势与其他组相比无统计学意义，这可能需要我们加 大实验的样本量或提高实验重复次数。同时，本实验也为光敏感性皮肤病的治 疗提供了基础研究的依据，为中药方药的进一步临床及实验研究夯实了理论基 础。

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