微小分子RNA-1247-5p作为新型肿瘤治疗分子靶标的用途

摘要

本发明提供一种小分子miRNA-1247-5p稳定过表达肝癌细胞系的建立方法及其对肝癌细胞株新陈代谢的调控作用，很可能成为预防与治疗肿瘤的标志物。越来越多的证据表明，microRNA可作为一种癌基因或抑癌基因，参与调控多种癌症的发生和发展过程。本发明通过构建慢病毒侵染肿瘤细胞模型的实验证明，miRNA-1247-5p对肿瘤细胞株HepG2增殖、迁移和侵袭等具有明显抑制作用，具有调控细胞周期及新陈代谢的作用，因此miR-1247-5p很可能成为肿瘤预防与治疗的全新靶点；并且通过靶基因预测数据库及双荧光素酶报告系统证实miR-1247-5p发挥细胞调控作用，是通过特异性靶向抑制癌基因无翅型MMTV整合位点家族成员3(WNT3)的表达来实现的。

说明书

技术领域

本发明涉及一种内源性的非编码小分子RNAs稳定过表达细胞系的建立方法，尤其涉及 miR-1247-5p在肝癌细胞株HepG2细胞稳定过表达细胞系的建立以及其在预防与治疗肝癌疾 病中作为新的肿瘤标志物以及抗肿瘤药物研制中的用途。

背景技术

肝癌是目前世界上发病率仅次于胃癌和食道癌的第三大的恶性肿瘤。肝癌恶性程度极高， 预后较差，死亡率居各种恶性肿瘤前列。肝癌主要分为原发性肝癌以及转移性肝癌两大类， 在我国，肝癌的死亡率占常见肿瘤的第二位。在肝癌的发病机制中，Wnt/β-catenin信号通路 主要通过激活下游c-myc，cyclingD1，c-iun等靶基因的转录而导致肝癌的发生与发展，同时 GSK3β/APC/Axin降解复合体的功能异常也是肝癌进展过程中的重要因素。因此，通过分子 治疗的方法可以有效控制肝癌的发生与发展，开展肝癌发病机制及临床治疗的研究是减轻其 危害的根本途径。

MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性非编码单链RNA，其长约为18～25个核 苷酸。miRNA通过Watson-Crick碱基互补匹配原则，对靶mRNA进行降解或抑制翻译来调 节蛋白的表达。据预测，人类约含有1000个miRNA，参与调控超过30％的蛋白编码基因， 在生物体的生长、发育、分化等方面起着重要的作用。miRNA的异常表达，参与肿瘤的各种 生物学过程，包括肿瘤细胞增殖、凋亡和迁徙、侵袭等。越来越多的证据表明，microRNA 可作为一种癌基因或抑癌基因，参与调控多种癌症的发生和发展过程。依此推断，miRNA可 作为一种癌基因或抑癌基因。

以慢病毒载体作为研究小分子MicroRNA的手段已被多种研究采用，利用慢病毒携带外 源基因可以持续在宿主细胞内稳定表达的特点，可以持续稳定表达对肿瘤细胞有某些特定功 能的基因，建立稳定表达系可以更好的对这一基因的生物学功能以及其应用价值提供模型基 础。

通过miRBase检索成熟miR-1247-5p序列信息，TargetScan、miRanda等进行靶基因预测， miR-1247-5p靶向抑制预测靶基因WNT3基因的表达。无翅型MMTV整合位点家族成员3 (winglesstype MMTV integration site family member3，WNT3)存在于Wnt/β-catenin信号 通路上游。WNT信号通路是一条存在于低等生物至高等生物中的高度保守通路，其通路成 员具有高度同源性，调控了包括动物胚胎早期发育，器官形成，组织再生等生物学过程，在 多个体外肿瘤模型中WNT信号通路均存在不同程度激活。在众多的miRNA中，miR-1247 已经被研究证实在多种肿瘤模型中表达异常，并很可能参与肿瘤的进程，成为潜在的抑癌基 因，而目前miR-1247-5p在肝癌肿瘤细胞中的调控作用机制及对其增殖与凋亡进程影响的研 究仍不清楚，因此，开发以miR-1247-5p为策略的肝癌疾病的预防、诊断和治疗的基础研究 和抗肿瘤药物研究具有重要的意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微小分子RNA-1247-5p(miR-1247-5p)在肝癌细胞HepG2细 胞中稳定表达的方法以及在预防与治疗肝癌疾病及抗肿瘤药物中的作用，所述miR-1247-5p 的核苷酸序列如下所示：5’-ACCCGUCCCGUUCGUCCCCGGA-3’。

本发明的研究基础：

1.本发明成功获得了能够过表达miR-1247-5p的慢病毒颗粒，病毒有效滴度达到1x10⁸TU/ml， 利用慢病毒反复侵染的方法，经过对细胞多次培养传代，荧光显微镜下观察，携带有 miR-1247-5p外源基因的细胞占95％以上，实时荧光定量检测细胞miR-1247-5p表达量上升630 倍。

2.本发明通过TargetScan、miRanda等预测软件对miR-1247-5p进行靶基因预测，通过双荧光素 酶验证了其对WNT3具有特异性靶向抑制作用。

3.本发明通过western blot证实了miR-1247-5p过表达能够特异性明显抑制WNT3蛋白表达水 平。

4.本发明通过CCK-8、Hoechst染色和流式细胞术同时证明，miR-1247-5p通过抑制靶标WNT3 的表达，下调其在肿瘤细胞高表达的水平，调控细胞周期，并使肿瘤细胞调往趋势增加进而 有效抑制细胞的增值，促进肿瘤细胞的凋亡。

5.本发明同时从transwell细胞侵袭实验，证实了miR-1247-5P能有效抑制肿瘤细胞侵袭能力。

6.本发明表明microRNA在临床实践中有非常重要的意义，将成为新一代的肿瘤生物诊断标 志物和用于肿瘤治疗的分子靶标。尤其是开辟了以miR-1247-5p为主的肿瘤疾病全新靶标的研 究，也为研制抗肿瘤新药开辟新的途径。

附图说明

图1显示了pSicoR/miR-1247-5p重组慢病毒侵染HepG2细胞后，显微镜下绿色荧光表达量。

图2显示了提取经过多次传代后的HepG2细胞，实时荧光定量PCR检测miR-1247-5p表达 水平依然维持在较高水平。

图3显示了提取福尔马林固定后石蜡包埋组织中RNA，反转录为cDNA，运用实时荧光定量 PCR方法检测miR-1247-5p在肝癌癌旁组织和癌变组织中表达情况。

图4显示双荧光素酶报告系统验证miR-1247-5p靶向抑制WNT3荧光素酶活性。

图5显示浓缩病毒上清液侵染肿瘤细胞western blot证实了miR-1247-5p过表达能够特异性明 显抑制WNT3蛋白表达水平。

图6显示CCK-8实验验证了miR-1247-5p明显抑制肿瘤细胞HepG2细胞的增殖。

图7显示hoechst染色实验验证了miR-1247-5p明显促进肿瘤细胞HepG2细胞的凋亡。

图8显示流式细胞仪检测结果，miR-1247-5p能够使HepG2细胞凋亡趋势增加。

图9显示Transwell实验验证了miR-1247-5p明显抑制肿瘤细胞HepG2细胞的迁移和侵袭。

具体实施方式

1.miR-1247-5p过表达慢病毒的获得以及稳定表达miR-1247-5p细胞系的建立。

在6孔细胞培养板中接种约1×10⁶个HEK-293T细胞，每孔加入2mL含10％FBS DMEM 完全培养基，37℃，5％CO2培养24h后，细胞密度达到80％～90％时，按照TransLipid  Transfection Reagent说明书，将三质粒系统(pSicoR-miR-1247-5p过表达载体1.5μg，pVSVG 0.45μg，A8.911.05μg)共转染至HEK-293T细胞中，收集转染48h和72h后的上清液。4 ℃3000g离心10min，去除细胞碎片，然后将上清用0.45tm的PVDF滤膜过滤，-80℃分 装保存。运用倍比稀释原则对病毒进行滴度测定，侵染肿瘤细胞系HepG2。

在6孔细胞培养板中接种约1×10⁶个HEK-293T细胞，每孔加入2mL含10％FBS DMEM 完全培养基，37℃，5％CO2培养24h后，以不同感染复数(MOI)利用慢病毒侵染HepG2细胞， 72小时后观察选取细胞状态较好且荧光表达比例较高的孔细胞消化并转移至25cm2培养瓶 中，24小时细胞贴壁后继续以相同感染复数MOI=30侵染细胞，72小时更换细胞培养基，消 化细胞，扩大培养。

2.miR-1247-5p稳定表达细胞系表达量检测

提取经过多次传代的细胞系5S RNA，按照promege反转录试剂盒说明书将RNA反转录 为cDNA。U6作为内参基因，结果采用相对定量法，公式为2^-△△CT。

3.miR-1247-5p石蜡组织表达水平检测收集宁夏医科大学总医院病理科2011年到2012年期间 肝癌病人术后福尔马林固定后石蜡包埋的组织(FFPE)16例，以及癌旁组织福尔马林固定后 石蜡包埋的组织(FFPE)10例，采用FFPE RNA Isolation Kit(OMEGA)从石蜡组织中提取 RNA，运用q-RT PCR方法检测miR-1247-5p在肝癌癌旁和癌变组织中表达情况。连续切片 4-6片，10um厚，二甲苯脱蜡，MicroElute柱子分离纯化RNA，按照promege 反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。U6作为内参基因，结果采用相对定量法，公 式为2^-△△cT

4.pMIR-Report-WNT3-3’UTR表达载体的构建与鉴定。经过HindI II和Spe I限制性内切 酶双酶切的pMIR-Report质粒，用12g/L的琼脂糖凝胶跑电泳并对目的条带进行胶回收，将 线性化的pMIR-Report质粒与WNT33’-UTR连接，反应条件为22℃，2h。将连接产物转化 到大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取单菌落，摇菌，提取质粒DNA，HindIII、Spe I限制性 内切酶双酶切鉴定并测序。

5.双荧光素酶报告系统。将HEK-293T细胞接种于96孔板，使转染时细胞密度达到1× 10⁷/mL。将pSicoR-miR-1247-5p过表达载体和pMIR-Report-WNT3-3’UTR载体共转染至293T 细胞中，同时共转染pMIR-Report-WNT3-3’UTR mut载体及miR-1247-5p inhibitor做对照。每 组共转染海蜃荧光素酶(PRL-TK)做为内参，转染试剂为Tranglipid Transfection Regent。转染 48h后，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光发光情况，并裂解细胞，按照promega双荧光素酶 试剂盒说明书进行操作，所用仪器为微孔板发光分析仪。

6.Western blot analysis。慢病毒侵染常规培养细胞，48h后观察GFP的表达情况，按照凯基 提全蛋白试剂盒说明书提全蛋白，-80℃分装保存。提取的蛋白进行BCA法定量。SDS-PAGE 分离，半干转至PVDF膜，50g/L脱脂奶粉封闭，4℃过夜后，加入兔抗的WNT3抗体(1∶100) 室温摇晃孵育2h后4℃过夜，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔 IgG(1∶5000)孵育2h，充分洗膜后利用ECL化学发光法进行暗室曝光。

7.CCK-8检测细胞增殖情况。慢病毒侵染细胞同上，24、48、72h后终止刺激。更换无血清 培养液，每孔90μL，加入10ul CCK-8溶液，继续培养2h。酶联免疫检测仪检测450nm的 吸光度(A450)值。同时设置调零孔和对照孔，每组设定3复孔实验结果用柱状图或不同时间 段折线图表示。

8.Hoechst染色检测细胞凋亡情况。6孔板放置无菌细胞爬片，接种合适密度的肿瘤细胞， 慢病毒侵染后48h，加入固定液，PBS清洗后，每孔加入0.5ml Hoechst33258染色液，避光 染色5min。去染液，PBS洗两遍，滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的 爬片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。荧光显微镜检测，激发波长350nm左右，发射波 长460nm左右。计数蓝白色的细胞核(凋亡细胞)数量。

9.Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况。细胞侵袭实验：Matrigel基质胶来源于BD公司， 首先将分装冻存在-20℃的新鲜Matrigel在冰上解冻并按照体积比1：8与无血清DMEM 培养基配置成混悬液，包被Transwell(孔径Sum)小室：用无菌镊子将Transwell小室放 入24孔细胞培养板，将制备好的Matrigel混悬液按70ul/室加入24孔板，放入细胞孵育 箱中30min，取出后在超净工作台上风干30min，在Transwell小室的下室内加入500ul含 10％FBS的DMEM培养基，上室中加入制备好的细胞悬液10⁴/孔，细胞常规培养48h，以 镊子小心将Transwell小室取出，弃去上室培养基，用无菌棉签轻将上室内面残余的细胞及 Matrigel胶刮去，滴加90％乙醇在小室的外侧面，固定10min，0.1％结晶紫染色5min，正 置显微镜镜下采集照片，随机选取5个高倍镜视野，计数穿膜的细胞数，并进行统计分析。 细胞迁移实验类似，除了不用铺Matrigel基质胶，上室接种2x10⁴/孔细胞，常规培养24h。