一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系及其构建方法

摘要

本发明公开了一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系及其构建方法，该构建方法具体包括如下步骤：(1)肾组织的处理：取鞍带石斑鱼肾组织并进行消毒、切块，处理后浸泡待用；(2)原代培养：上述处理后的鞍带石斑鱼肾组织经胰酶消化液消化、灭菌双蒸水处理后进行原代培养；(3)传代培养：原代培养细胞汇合度达60-90％时进行传代培养，每5-7天传代一次。本发明所构建的肾组织细胞系对石斑鱼虹彩病毒敏感，且细胞病变时间快。因此，该细胞系可很好地应用于石斑鱼虹彩病毒的分离、繁殖及石斑鱼虹彩病毒疫苗研究。同时，也为其它海水鱼类病毒的分离培养及疫苗研制等提供了细胞材料。

说明书

技术领域

本发明属于微生物动物细胞系领域，具体涉及一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系及其构建方法。

背景技术

经过20多年的发展，我国海水养殖取得重大成绩，养殖规模、品种和产量均居于世界前列，海水养殖产量在海洋渔业产量的比重从过去的10％上升到了目前的40％。鞍带石斑鱼(Epinephelus Lanceolatus)，又称龙胆石斑鱼，俗称龙胆，是我国一类重要海水养殖经济鱼类，由于其肉质鲜嫩、营养丰富，加之其生长快，适应性强，已成为我国南方海水养殖的重要对象。近年来，我国海水养殖业迅速发展的同时，也面临着基础研究薄弱、病害发生频繁、抗病优良品种缺乏等突出问题，这已成为制约我国海水养殖产业健康可持续性发展的关键因素，尤其在面对由于病毒导致的爆发性流行病时，常常是束手无策。查清病毒的感染途径及病毒与细胞相互作用机理是从根本上预防和解决众多海洋经济鱼类病毒病的关键。细胞系是鱼类免疫学、功能基因组学和环境毒理学研究的强有力的工具，也是研究生物进化、发育和遗传的良好材料。同时，细胞系也是进行鱼类病毒学研究，分离、鉴定鱼类病毒及研制病毒疫苗所必须的材料。

鱼类的细胞培养起始于20世纪60年代初，迄今为止，已经建立的鱼类细胞系多为淡水鱼类和溯河性鱼类，主要用于病毒学研究，由 海水鱼类建立的细胞系比较少。由于缺少敏感细胞系，海水鱼类病毒的分离、培养及疫苗的研制进展较慢，病毒在海水鱼类养殖过程中的感染、发病作用机理还无法进行深入研究。病毒在体内外都有一定的细胞嗜性限制性。细胞表面受体的存在，往往决定着病毒的宿主范围和对组织及细胞的亲嗜性。此外，病毒增殖的各个过程，如吸附与入侵、脱壳、病毒成分的合成以及装配与释放等都受到细胞因素的影响，而且，病毒增殖本身就是一个极为复杂的过程。殷霞与刘景华在其主编的《动物病毒学》一书中指出，关于哪些类型的细胞对哪些种类的病毒具有敏感性，没有明确的规律性，似乎只能依靠经验，也就是通过实践来发现和验证。

鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性，所以有效的途径是以数量对质量，即制备各种鱼类各种组织的原代细胞，从中筛选出敏感的细胞系。鱼类的肾脏是参与体液免疫的重要器官，同时也是虹彩病毒、草鱼呼肠孤病毒、欧洲鳗鲡病毒等众多鱼类病毒的重要靶器官。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，本发明以鞍带石斑鱼体肾组织为对象，成功建立了鞍带石斑鱼肾组织细胞系，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要研究平台和实验材料。同时，本发明建立的方法也可以应用于从其它鱼类富含血细胞组织中建立细胞系，如肝、脾等组织。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系，该鞍带石斑鱼肾组织细胞系的生物学名称为GGKD，该细胞系于2015年1月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏登记入册编号为CCTCC NO：C201516，请求保藏人为肇庆大华农生物药品有限公司。

本发明所述的一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)肾组织的处理：取鞍带石斑鱼肾组织并进行消毒、切块，处理后浸泡待用；

(2)原代培养：上述处理后的取鞍带石斑鱼肾组织经胰酶消化液消化后进行原代培养；

(3)传代培养：原代培养细胞汇合度达60-90％时进行传代培养，每5-7天传代一次。 

本发明所述的所述构建方法中，具体地，步骤(1)中肾组织的处理：将鲜活的鞍带石斑鱼于含有青霉素和链霉素的高双抗海水中充气暂养24小时，取鲜活鞍带石斑鱼，用酒精对鞍带石斑鱼进行消毒，无菌条件下解剖取肾组织，切块，浸泡于漂洗液进行漂洗。

优选地，所述的漂洗液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素的M199溶液。

本发明所述的所述构建方法中，具体地，所述步骤(2)中原代培养：将步骤(1)得到的肾组织加入胰酶消化液，在室温下消化 20-30min，消化后收集细胞悬液；将细胞悬液加入1-2ml含血清培养液(含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、5-10％胎牛血清的M199溶液)终止消化，并过滤，吸取滤液离心，弃上清，沉淀中加入1ml基础培养液、9ml灭菌水，颠倒混匀后放置15-30s，裂解血细胞；然后加入1ml基础培养液，在100目灭菌滤网上过滤；滤过液离心，加入增值培养液重悬，重悬后，置于28℃恒温培养箱开始原代培养，每2-3天按半量换液方式更换培养液。

优选地，所述基础培养液为M199、MEM和L-15中的一种。

优选地，所述增值培养液为含有20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的M199培养液；或

含有20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的MEM培养液；或

含有20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的L-15培养液。

本发明所述的所述构建方法中，具体地，所述步骤(3)中传代培养：原代培养细胞长至汇合度达60-90％时，加入胰蛋白酶消化，用传代培养液悬起细胞，然后接种于培养瓶内在28℃培养箱中培养，每5-7天传代一次。

优选地，传代培养液为含有5-20％胎牛血清、0.046mM NaCl、100-400IU/ml青霉素、100-400μg/ml链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0-20ng/ml成纤维细胞生长因子的M199培养液；或

含有5-20％胎牛血清、0.046mM NaCl、100-400IU/ml青霉素、100-400μg/ml链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0-20ng/ml成纤维细胞生长因子的MEM培养液；或

含有5-20％胎牛血清、0.046mM NaCl、100-400IU/ml青霉素、100-400μg/ml链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0-20ng/ml成纤维细胞生长因子的L-15培养液。

优选地，步骤(3)中传代传至第2代时，将培养液中成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的浓度降为8ng/ml；传至第5-10代时，将培养液中胎牛血清浓度降为15％，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的浓度降为4ng/ml，青霉素浓度降至100IU/ml、链霉素浓度降至100μg/ml；传至第15-20代时，将培养液中成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的浓度降为零，胎牛血清含量降至8-10％。

实施本发明的鞍带石斑鱼肾组织细胞系及其构建方法，具有以下有益效果：

(1)采用本发明的技术方案，对鞍带石斑鱼肾组织进行了原代及传代培养，取得了较好的培养效果，从而建立了鞍带石斑鱼肾组织细胞系，可连续传至65代。

(2)细胞系可连续传代，因此能提供大量的鞍带石斑鱼肾组织 来源细胞，且细胞增殖培养液配方简单，无需添加外源生长因子，传代细胞能维持良好的生长状态，并可对其进行冷冻保存。

(3)本发明所构建的肾组织细胞系对石斑鱼虹彩病毒敏感，且细胞病变时间快。因此，该细胞系可很好地应用于石斑鱼虹彩病毒的分离、繁殖及石斑鱼虹彩病毒疫苗研究。同时，也为其它海水鱼类病毒的分离培养及疫苗研制等提供了细胞材料。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1是本发明较佳实施例1的鞍带石斑鱼肾组织原代培养细胞图；

图2是本发明较佳实施例1的鞍带石斑鱼肾组织传代培养细胞图；

图3是本发明不同培养液对肾组织细胞生长的影响的图表；

图4是本发明不同胎血清浓度对肾组织细胞生长的影响的图表；

图5是本发明较佳实施例1的第54代肾组织细胞中期染色体分裂相图；

图6是本发明较佳实施例1的第54代肾组织细胞染色体数目分析图；

图7是本发明较佳实施例1的石斑鱼虹彩病毒感染肾组织细胞0h的CPE观察图；

图8是本发明较佳实施例1的石斑鱼虹彩病毒感染肾组织细胞24h的CPE观察图。

图9是本发明较佳实施例1的石斑鱼虹彩病毒感染肾组织细胞60h的CPE观察图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

本发明采用的鞍带石斑鱼购自广东大麟洋海洋生物有限公司，经分子方法验证未感染水产动物病毒，体重160g。

试剂：胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Gibco公司；0.25％胰蛋白酶(Trypsin)购自Gibco公司；PSN抗体混合液(青霉素penicillin，链霉素streptomycin，制霉菌素nystatin)购自Gibco 公司；重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human fibroblast growth factor-basic，FGF-basic)、重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor，EGF)均购自PeproTech公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自Sigma公司；MEM(Eagle's minimum essential medium)、Leibovitz’s L-15、M199培养液购自Life Technologies公司，培养液按产品说明书配制后过滤除菌，4℃保存备用。

肾是鱼类重要的造血器官，采用胰酶消化法进行肾组织细胞原代培养时，消化过滤的细胞悬液中血细胞占绝大部分。接种细胞量高时，培养表面被血细胞占满；接种细胞量低时，贴壁组织细胞少，分散且成单个，原代培养难以成功。因此，富含血细胞器官组织的原代培养能否成功，其中一个重要的影响因素是如何有效地提高原代培养时接种细胞中能贴壁组织细胞的量。

本发明的一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系，该鞍带石斑鱼肾脏组织细胞系的生物学名称为GGKD，该细胞系于2015年1月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏登记入册编号为CCTCC NO：C201516，请求保藏人为肇庆大华农生物药品有限公司。

本发明的一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)肾组织的处理：将鲜活的鞍带石斑鱼于的含有青霉素和链霉素的高双抗海水(其中，青霉素和链霉素的浓度均为1000IU/ml)中充气暂养24小时，取鲜活鞍带石斑鱼，用医用酒精浸泡1-5min对鞍带石斑鱼进行整体消毒，然后用75％酒精再次消毒，消毒后，在无菌条件下的超净工作台内解剖取肾组织，用刀片将肾组织切块，用漂洗液冲洗4-6次，去除血细胞。

其中，漂洗液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素的M199溶液。

(2)原代培养：将步骤(1)得到的肾组织加入胰酶消化液，在室温下消化20-30min，消化后收集细胞悬液；加入1-2ml含血清培养液(所述含血清培养液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、5-10％胎牛血清的M199溶液)终止消化，并用100目灭菌滤网过滤，吸取滤液至1.5ml离心管中，1800转离心8-10min，弃上清，沉淀加入1ml基础培养液、9ml灭菌水，颠倒混匀后放置15-30s， 裂解血细胞；然后加入1ml基础培养液，在100目灭菌滤网上过滤；滤过液离心收集细胞，加入增值培养液重悬，重悬后，置于28℃恒温培养箱开始原代培养，每2-3天按半量换液方式更换培养液；所述基础培养液为M199、MEM和L-15中的一种。

其中，增值培养液为含有20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的M199培养液；或

含有20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的MEM培养液；或

含有20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的L-15培养液。

(3)传代培养：原代培养细胞长至汇合度达60-90％时(汇合度:细胞在瓶中增殖时,出现在细胞间的粘连和排列状态,达到某种状态用汇合度％表示)，加入0.25％胰蛋白酶室温下消化2-3min，用传代培养液悬起细胞，吹下贴壁细胞，然后将细胞悬液接种于2个25cm²的培养瓶内在28℃培养箱中培养，每5-7天传代一次。

其中，传代培养液为含有5-20％胎牛血清、0.046mM(mmol/L)NaCl、100-400IU/ml青霉素、100-400μg/ml链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0-20ng/ml成纤维细胞生长因子的M199培养液；或

含有5-20％胎牛血清、0.046mM NaCl、100-400IU/ml青霉素、100-400μg/ml链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0-20ng/ml成纤维细胞生长因子的MEM培养液；或

含有5-20％胎牛血清、0.046mM NaCl、100-400IU/ml青霉素、100-400μg/ml链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0-20ng/ml成纤维细胞生长因子的L-15培养液。

本发明进行传代培养的过程中，发明人发现当传至第2代时，若将传代培养液中成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的浓度降为8ng/ml，细胞生长速度快；而若在传至第5-10代时，将传代培养液中胎牛血清浓度降为15％，成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的浓度降为4ng/ml，青霉素浓度降至100IU/ml、链霉素浓度降至100μg/ml不仅能加速细胞的生长；但是，综合考虑培养液的成本及细胞生长速度及细胞的存活能力，可以在传至第15-20代时，将传代培养液中成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的浓度降为零，胎牛血清含量降至8-10％。当然，传至第15-20代时，可将传代培养液中成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的浓度降为零，胎牛血清含量降至8-10％，降低了培养液的成本，同时也不影响细胞生长速度及细胞的存活能力。

实施例1

鞍带石斑鱼肾组织细胞系的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)肾组织的处理：将鲜活的鞍带石斑鱼于浓度为1000IU/ml的青霉素和链霉素高双抗海水中充气暂养24小时，取鲜活鞍带石斑鱼，用医用酒精浸泡1-5min对鞍带石斑鱼进行整体消毒，然后用75％酒精再次消毒，消毒后，在无菌条件下的超净工作台内解剖取肾组织，用刀片将肾组织切块，用漂洗液(含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素的M199溶液)冲洗4-6次，去除血细胞。

(2)原代培养：将步骤(1)得到的肾组织加入胰酶消化液，在室温下消化20-30min，消化后收集细胞悬液；加入1-2ml含血清培养液(含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、5-10％胎牛血清的M199溶液)终止消化，并用100目灭菌滤网过滤，吸取滤液至1.5ml离心管中，1800转离心8-10min，弃上清，沉淀加入1ml M199基础培养液、9ml灭菌水，颠倒混匀后放置15-30s，裂解血细胞；然后加入1ml M199基础培养液，在100目灭菌滤网上过滤；滤过液离心收集细胞，加入增值培养液重悬，重悬后，置于28℃恒温培养箱开始原代培养，每2-3天按半量换液方式更换培养液；

其中，所述增值培养液为含有20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的M199培养液(简称M199培养液)；

(3)传代培养：原代培养细胞长至汇合度为60-90％时，加入0.25％胰蛋白酶室温下消化2-3min，用传代培养液悬起细胞，吹下贴壁细胞，然后将细胞悬液接种于2个25cm²的培养瓶内在28℃培养箱 中培养，每5-7天传代一次；

其中，所述传代培养液为5-20％胎牛血清、0.046mM NaCl、100-400IU/ml青霉素、100-400μg/ml链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0-20ng/ml成纤维细胞生长因子的M199培养液。

实施例2

鞍带石斑鱼肾组织细胞系的构建方法，按照实施例1的步骤，与实施例1的区别在于：在该实施例中，

所述基础培养液为MEM基础培养液。

所述增值培养液为含有20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤维细胞生长因子的MEM培养液(简称MEM培养液)；

所述传代培养液为含有5-20％胎牛血清、0.046mM NaCl、100-400IU/ml青霉素、100-400μg/ml链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0-20ng/ml成纤维细胞生长因子的MEM培养液。

实施例3

鞍带石斑鱼肾组织细胞系的构建方法，按照实施例1的步骤，与实施例1的区别在于：在该实施例中，

所述基础培养液为L-15基础培养液；

所述增值培养液为含有20％胎牛血清、0.046mM NaCl、400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素、20ng/ml表皮生长因子及20ng/ml成纤 维细胞生长因子的L-15培养液(简称L-15培养液)；

所述传代培养液为含有5-20％胎牛血清、0.046mM NaCl、100-400IU/ml青霉素、100-400μg/ml链霉素、0-20ng/ml表皮生长因子及0-20ng/ml成纤维细胞生长因子的L-15培养液。

在上述实施例1-3的基础上，进一步的，当传至第2代时，将传代培养液中FGF-basic、EGF浓度降为8ng/ml；当传至第5-10代时，将传代培养液中胎牛血清浓度降为15％，FGF-basic、EGF浓度降为4ng/ml，青霉素浓度降至100IU/ml，链霉素浓度降至100μg/ml；当传至第15-20代时，将传代培养液中FGF-basic、EGF浓度降为零，胎牛血清含量降至8-10％。

本发明实施例1-3采用无菌水低渗裂解了绝大部分血细胞，大大提高了接种细胞中组织细胞的含量；采用本发明开展肾组织细胞的原代培养，5-7天细胞汇合度即达50％-70％，较大地提高了富含血细胞器官组织原代细胞培养的成功率。

原代培养分别在M199、MEM和L-15三种不同培养液中启动。观察结果显示，M199培养液中贴壁细胞多，且生长速度快；而在MEM、L-15培养液中贴壁细胞少，细胞增殖能力较低。可见M199培养液是适于鞍带石斑鱼肾组织细胞原代培养的最佳培养液。

具体地，参见实施例1中细胞生长状态，细胞低代次时，上皮样和成纤维样细胞同时存在，如图1所示；随着传代的进行，上皮样细胞逐渐为主要形态，如图2所示；细胞能稳定增殖，目前细胞已传至 65代以上。

在本发明，我们进一步考察了不同培养液以及FBS浓度对细胞生长的影响。

1.不同培养液对细胞生长情况的影响。

取上述实施1的22×10⁴个鞍带石斑鱼肾组织细胞系(54-56代)，将细胞分别接种于含10％FBS的M199培养液、含10％FBS的MEM培养液和含10％FBS的L15营养液中，28℃下培养。于培养后1、3、5、7天用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞系在不同培养液中的生长曲线。

如图3所示，鞍带石斑鱼肾组织细胞在M199培养液中生长速度明显高于L15、MEM培养液。

2.细胞在不同FBS浓度下的生长情况、染色体的形态数目、病毒感染实验。

按照实施例1的步骤分别将22×10⁴个细胞接种于含有2％、5％、10％或15％FBS的M199培养液中，28℃下培养。于培养后1、3、5、7天用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞系在不同FBS浓度的生长曲线。

结果显示，如图4所示，细胞生长速度与添加胎牛血清浓度成正比，胎牛血清浓度为10-15％时，细胞生长快，但鉴于培养液的成本控制原因，在传代培养时，特别是传至第15-20代后，胎牛血清浓度可适当降低至8-10％。

结果验证

1.对通过本发明的方法获得的鞍带石斑鱼肾组织细胞系细胞的冻存后复苏性能力进行验证，具体步骤如下：

1)取实施例1处于对数生长期的细胞，经胰酶消化后获得单细胞悬液，160g离心10min，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入适量配置好的细胞冻存液(含20-30％FBS、10％DMSO的M199培养液)，重悬，转移入1.8ml无菌冻存管中；将冻存管放入程序降温盒中，-80℃冰箱过夜，隔天放入液氮中长期保存；

2)对上述冻存的细胞进行复苏，将冻存管从液氮罐中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化，加至含6-8ml培养液的细胞瓶中，28℃培养箱中培养，隔天换液。

不同代次细胞冻存后复苏率为82％-96％，复苏细胞能够贴壁并生长分裂，并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。

2.对通过本发明的方法获得的鞍带石斑鱼肾组织细胞系的染色体分析具体步骤如下：

取上述实施1的鞍带石斑鱼肾组织细胞系(54代)，分别将54代的细胞贴壁稳定生长36-48h，加入终浓度0.6-1.0μg/ml秋水仙素作用4-8h，胰酶消化后160g离心10min回收细胞；75mM KCl 37℃低渗处理30min，再加入2ml固定液(甲醇：冰醋酸3：1)预固定；160g离心10min，弃上清，加固定液室温固定30min；重复固定步骤2-3次；最后一次固定留适量固定液，轻柔吹匀；吸取固定悬液，15cm 高处滴于-20℃预冷的载玻片上，迅速用力将液滴吹散，室温晾干；姬姆萨染液染色10min，油镜下观察实施例1-3的细胞染色体形态，计数染色体数目。

染色体数目和核型是细胞遗传学的基础，是鉴定生物种属和性别等较为准确的指标；在细胞培养的过程中，染色体常用来鉴定细胞的来源、是否发生转化的可靠指标。上述染色体分析的结果显示：实施例1的细胞在统计的116个分裂相中，染色体数目从32-58不等，但53.4％的分裂相染色体数目为48条，如图5-6所示，符合鞍带石斑鱼染色体数目特征。虽然染色体数目分布不均匀，但二倍体染色体数目出现频率是最高的，其他非整倍体只占了很小的比例。

3.对通过本发明的方法获得的鞍带石斑鱼肾组织细胞系的病毒感染实验，具体步骤如下：

1)取上述实施例1的鞍带石斑鱼肾组织细胞系(62代)；

2)细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)观察：待接种细胞铺满25cm²细胞瓶底后，将病毒溶液加入细胞培养瓶中，28℃孵育1小时，弃病毒溶液，更换为含4-6％胎牛血清的新鲜M199细胞培养液，继续培养，每天用倒置显微镜观查细胞病变。

3)滴度测定：细胞完全病变后，收取病毒悬液，将收获的病毒液10倍系列稀释至10^-7，每个稀释度重复6孔，加入接种了上述细胞的96孔板中，28℃培养箱中培养，每天观察CPE产生，按照Reed&Muench(Reed and Muench,1938)方法计算病毒滴度。

细胞变圆为病毒感染后的光镜观察的一个描述，病毒感染后导致细胞变圆、死亡。如图7-9所示，结果显示，石斑鱼虹彩病毒感染细胞24小时后观察到明显的CPE，感染60小时后80％以上的细胞变圆，早期的CPE特征主要为细胞圆缩，折光性增高；感染60小时之后，圆缩细胞逐渐变多，整个细胞单层形成一种网状联结；最后细胞单层完全解体。石斑鱼虹彩病毒感染上述细胞完全CPE后测定病毒感染滴度，滴度达到10^7.6TCID₅₀mL^-1。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。