发色试剂溶液的背景上升抑制方法、发色试剂溶液、试剂盒和测定装置

摘要

本发明涉及发色试剂溶液的背景上升抑制方法、发色试剂溶液、试剂盒和测定装置。提供在保管用于测定试样中的成分、溶解了氧化发色试剂的发色试剂溶液之际用于抑制该发色试剂溶液的背景上升的方法。该方法是用于对保管用于试样中的成分的测定、溶解了氧化发色试剂的发色试剂溶液之际发生的所述发色试剂溶液的背景上升进行抑制的方法，具有将所述发色试剂溶液的氢离子指数(pH)调节成强酸性的调节工序。优选地，在所述调节工序中，所述发色试剂溶液的氢离子指数被调节为2.9以下或2.1以下。优选地，所述发色试剂溶液用于测定氧化应激度。优选地，所述氧化发色试剂是苯二胺衍生物。

说明书

技术领域

本发明涉及用于测定试样中的成分且溶解了氧化发色试剂的发色试剂 溶液的背景上升抑制方法、发色试剂溶液、试剂盒和测定装置。

背景技术

通常，在生物体内所消耗的氧的2％左右被变成活性氧自由基。“活 性氧-自由基”是既是活性氧也是自由基的物质。虽然该活性氧-自由基由 于抗氧化物质或抗氧化酶的活动大半被消除，但是没有被消去的活性氧- 自由基氧化DNA、脂质、酶、蛋白质等生物体成分。已知这些生物体成 分的氧化损伤不只与老化现象的亢进关联，还与糖尿病、高血压、动脉硬 化等疾病的发病关联。

此处，活性氧-自由基和抗氧化物质或抗氧化酶的平衡被定义为氧化 应激。氧化应激的程度称作氧化应激度。“氧化应激度高”是指在生物体 内由活性氧-自由基造成的氧化作用和抗氧化物质等的抗氧化作用的平衡 被破坏，氧化反应亢进的状况。氧化应激度高的状况对生物体来说是不好 的状况。

在专利文献1～3中介绍了用于测定氧化应激度的测定方法。生物体内 的脂质、蛋白质、氨基酸、核酸等由活性氧-自由基受到氧化反应，成为 氢过氧化物(R-OOH)。从而，该氢过氧化物能可成为氧化应激度的指 标。在专利文献1～3中所记载的测定方法中，在生物体内产生的活性氧- 自由基不是被直接计测，而是由此产生的血中的氢过氧化物的浓度被使用 呈色反应测定，生物体内的氧化应激度被综合地评价。

在专利文献1～3中，作为用于上述呈色反应的发色试剂，使用作为氧 化发色试剂的对苯二胺衍生物。该对苯二胺衍生物有灵敏度高，作为在所 述氢过氧化物浓度测定中使用的发色试剂有用。

然而，在所述以往技术中，如下所述，还有可改善的余地。

即，由于对苯二胺衍生物这样的氧化发色试剂在溶液状态下比较不稳 定，容易和溶液中的氧反应，因此容易引起误发色。因此，当以溶液状态 保管时，存在所谓背景上升的问题。作为一个对策，进行将氧化发色试剂 通过冻结干燥作为干燥试剂保管的方法。该干燥试剂在使用时通过溶解液 溶解而被使用。在使用时必须进行这样的前处理作业对测定作业者来说成 为负担。因而，希望氧化发色试剂在溶液状态下能够保管。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：欧洲专利第0783692B1号说明书

专利文献2：美国专利第6,355,489B1号说明书

专利文献3：日本专利公开2009-257909号公报

发明内容

本发明是考虑所述的情况而被作出的，本发明的课题在于，提供在保 管用于试样中的成分的测定且溶解了氧化发色试剂的发色试剂溶液时，用 于抑制该发色试剂溶液的背景上升的方法、抑制了背景上升的发色试剂溶 液、包括该发色试剂溶液的试剂盒和用于使用该试剂盒测定试样中的成分 的测定装置。

为了解决上述的问题，在本发明中讲述了下面的技术手段。

由本发明的第一方面提供的用于抑制发色试剂溶液的背景上升的方 法，是用于对保管发色试剂溶液之际发生的背景上升进行抑制的方法，所 述发色试剂溶液用于试样中的成分的测定，且溶解了氧化发色试剂，其特 征在于，所述方法具有将所述发色试剂溶液的氢离子指数调节成强酸性的 调节工序。

优选地，是如下构成，在所述调节工序中，所述发色试剂溶液的氢离 子指数被调节到2.9以下或2.1以下。

优选地，是如下构成，所述发色试剂溶液用于测定氧化应激度。

优选地，是如下构成，所述氧化发色试剂是苯二胺衍生物。

优选地，是如下构成，所述苯二胺衍生物是对苯二胺衍生物。

优选地，是如下构成，所述对苯二胺衍生物被从下述一般式(I)所表 示的化合物或其盐中选择。

化1

[一般式(I)中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地表示氢原子、甲基、 乙基、异丙基、碳原子数1～4的羟烷基、苯基或卤素基。]

由本发明的第二方面提供的发色试剂溶液是用于试样中的成分的测 定、溶解了氧化发色试剂的发色试剂溶液，其特征在于，氢离子指数被调 节成强酸性。

优选地，所述发色试剂溶液是如下构成，氢离子指数被调节到2.9以 下或2.1以下。

优选地，所述发色试剂溶液是如下构成，用于测定氧化应激度。

优选地，是如下构成，所述氧化发色试剂是苯二胺衍生物。

优选地，是如下构成，所述苯二胺衍生物是对苯二胺衍生物。

优选地，是如下构成，所述对苯二胺衍生物被从下述一般式(I)所表 示的化合物或其盐中选择。

化1

[一般式(I)中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地表示氢原子、甲基、 乙基、异丙基、碳原子数1～4的羟烷基、苯基或卤素基。]

由本发明的第三方面提供的试剂盒是用于试样中的成分的测定的试剂 盒，其特征在于，包括由本发明的第二方面提供的发色试剂溶液。

优选地，所述试剂盒是如下构成，还包括用于稀释所述发色试剂溶液 的稀释液，所述稀释液通过由缓冲剂被调节为适于呈色反应的规定的氢离 子指数，所述发色试剂溶液的氢离子指数通过由所述稀释液稀释来变化成 所述稀释液的所述规定的氢离子指数。

由本发明的第四方面提供的测定装置是用于试样中的成分的测定的测 定装置，其特征在于，被构成为使用由第三方面提供的试剂盒进行测定。

根据采用本发明的一种方式，能够对用于测定试样中的成分、溶解了 氧化发色试剂的发色试剂溶液的背景的上升进行抑制。其结果是，以溶液 状态保管氧化发色试剂成为可能。由此，进行试样中的成分的测定之际节 省了溶解氧化发色试剂的麻烦，因此对测定作业者来说便利。

本发明的其它特点和优点能够参照附图从以下进行的发明的实施方式 的说明知晓。

附图说明

图1是示意性地示出包括含有本发明所涉及的发色试剂溶液的支架和 用于测定该支架的测定装置的测定系统的一例的构成的立体图。

图2是沿着图1所示的测定系统的II-II线的截面图。

图3是示出被填充到图1所示的测定系统的支架中的发色试剂溶液所 溶解的氧化发色试剂的具体例的图。

图4是说明图1所示的测定系统的动作的一例的流程图。

图5是示出实施例2的发色试剂溶液(3)的确认结果的图表。

图6是示出实施例2的发色试剂溶液(4)的确认结果的图表。

图7是示出实施例2的发色试剂溶液(5)的确认结果的图表。

图8是示出实施例2的发色试剂溶液(6)的确认结果的图表。

图9是示出实施例2的发色试剂溶液(7)的确认结果的图表。

图10是示出实施例2的发色试剂溶液(8)的确认结果的图表。

图11是示出实施例3的确认结果的图表。

符号说明

A  测定系统

1  支架

2  测定装置

S  试样

10  试样槽

11  发色试剂溶液槽

12  测光池

13  稀释槽

14  稀释液槽

15  清洗液槽

16  尖端装填处

17  尖端

21  管嘴

22  测光单元

23  调温块

RS1  发色试剂溶液

RS2  测定液

RS3  稀释试样

RS4  稀释液

RS5  清洗液

具体实施方式

以下，参照附图对本发明的优选的实施方式具体地进行说明。在本发 明中使用“～”示出的数值范围表示将“～”是前后所记载的数值分别作为 最小值和最大值包括的范围。另外，在以后的说明中，上下方向等的方向 按照附图的记载。

[测定系统]

图1示出包括应用于本发明的发色试剂溶液、含有该发色试剂溶液的 支架和用于使用该支架来测定生物体中的氧化应激度的测定装置的测定系 统的一例。测定系统A包括支架1和测定装置2。支架1例如设置在小型 的测定装置2上，用于测定试样S所含有的成分的量，测定装置2设置在 诊所或医院的病房。作为试样S中的成分，具体地例如可以举出氢过氧化 物(R-OOH)。该氢过氧化物是生物体内的脂质、蛋白质、氨基酸、核酸 等通过活性氧-自由基受到氧化而产生。由测定得到的氢过氧化物浓度用于 综合地评价生物体内的氧化应激度。作为试样S，具体地，例如举出全 血、血浆、血清、尿、唾液、间质液等生物体试样。这些试样S可以就这 样应用，也可以以稀释液RS4稀释来应用。

[支架]

如图1和图2所示，支架1被多个槽、测光池、尖端装填处等一体化 地形成。支架1相当于本发明所说的试剂盒的一例。支架1例如将聚苯乙 烯作为材料，通过射出成型来制造。支架1在测光池12处使可见光线或 紫外线透过。由此，作为支架1的材料，除了聚苯乙烯之外，还使用聚甲 基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯等。 支架1含有测定氢过氧化物浓度所需要的全部试剂。该支架1制造后被冷 藏着运输/保管。作为冷藏条件，例如可以举出4℃以下。

支架1具有试样槽10、发色试剂溶液槽11、测光池12、稀释槽13、 稀释液槽14、清洗液槽15和尖端装填处16，其中填充的内容物和填充量 如表1所示。在支架1的上表面18上贴着密封层(图示省略)。该密封层 是铝密封层、包括铝箔的多层薄膜、或合成树脂薄膜制成，至少覆盖发色 试剂溶液槽11、稀释液槽14和清洗液槽15。

表1

试样槽10是用于分注试样S的槽。测定作业者测定时使用移液管等 将试样S分注到试样槽10。试样S例如被分注50μL。发色试剂溶液槽11 是用于填充、保管溶解了氧化发色试剂的发色试剂溶液RS1的槽。在发色 试剂溶液槽11中，例如填充有200μL的发色试剂溶液RS1。测光池12容 纳混合了发色试剂溶液RS1和试样S的测定液RS2，是测定由氧化氧化发 色试剂的反应而产生的呈色的部分。稀释槽13通过稀释液RS4来稀释试 样S，是用于生成稀释试样RS3的槽。稀释液槽14是用于填充为了稀释 试样S使用的稀释液RS4的槽。稀释液槽14作为用于保管稀释液RS4的 容器发挥功能。在稀释液槽14中，例如填充400μL稀释液RS4。清洗液 槽15是用于填充用于清洗尖端17的清洗液RS5的槽。在清洗液槽15 中，例如填充400μL清洗液RS5。尖端17用于将试样S、发色试剂溶液 RS1、稀释液RS4从被填充的槽向其它槽转移，或者在混合这些液体时搅 拌。尖端装填处16是用于填装、保持尖端17的地方。尖端装填处16也可 以被作为废液槽使用，废弃不要了的液体。

[发色试剂溶液]

填充在发色试剂溶液槽11中的发色试剂溶液RS1是氧化发色试剂被 溶解在溶剂中的液状试剂。例如使用水作为溶剂。在发色试剂溶液RS1 中，氧化发色试剂的浓度被调节为在测定液RS2中最终为0.2～8mM或 0.4～6.4mM。氧化发色试剂通过一旦被氧化则在分子内产生发色团来呈 色。因此，氧化发色试剂的浓度在发色试剂溶液RS1中，例如被调节为 0.24mM～9.6mM或0.48mM～7.68mM。氧化发色试剂通过被氧化成为半醌 色素或醌色素从而发色。作为氧化发色试剂，使用苯二胺衍生物。特别 地，优选使用对苯二胺衍生物。对苯二胺衍生物特别是以下述一般式(I) 表示的化合物或其盐。

化1

在一般式(I)中，R¹、R²、R³和R⁴分别独立地是氢原子、甲基、乙 基、异丙基、碳原子数1～4的羟烷基、苯基或卤素基。作为碳原子数1～4 的羟烷基，例如可以举出羟甲基、羟乙基、羟丙基。作为羟乙基的例子， 可以举出2-羟乙基。

特别地，在一般式(I)中，R¹、R²、R³和R⁴之中至少1个是甲基、 乙基、异丙基、碳原子数1～4的羟烷基、苯基或卤素基。

或者，R¹、R²、R³和R⁴之中2个以上分别独立地是甲基、乙基、异 丙基、碳原子数1～4的羟烷基、苯基或卤素基。特别地，在R¹、R²、R³和 R⁴之中2个以上分别独立地表示异丙基、碳原子数1～4的羟烷基或苯基的 情况下，可以是相同基团是2个以上，也可以是各个不同的2个以上的基 团。

或者，R¹、R²、R³和R⁴之中至少1个是苯基，且R¹、R²、R³和R⁴之 中至少1个是碳原子数1～4的羟烷基。在这种情况下，在以一般式(I)表 示的化合物中，苯基结合的氮原子和所述羟烷基结合的氮原子可以相同也 可以不同。

或者，以一般式(I)表示的对苯二胺衍生物在是具有上述的取代基 R¹～R⁴之中苯基以外的取代基作为R¹～R⁴的化合物的情况下，也可以是以 一般式(I)表示的化合物的盐。作为该盐的例，可以举出盐酸盐、硫酸 盐、草酸盐或醋酸盐等。

或者，对苯二胺衍生物是在一般式(I)中，R¹是氢原子，R²是氢原 子或异丙基，R³是氢原子、乙基或碳原子数1～4的羟烷基，R⁴是碳原子数 1～4的羟烷基或苯基的化合物。在该情况下，一般式(I)中包括R¹是氢 原子，R²是氢原子，R³是乙基或碳原子数1～4的羟烷基，R⁴是碳原子数 1～4的羟烷基的化合物的盐酸盐、硫酸盐、草酸盐或醋酸盐等。

如上所述，在对苯二胺衍生物中，一般式(I)中包括R¹、R²、R³和 R⁴之中至少1个是碳原子数1～4的羟烷基的化合物。R¹、R²、R³和R⁴之 中至少1个是碳原子数1～4的羟烷基的对苯二胺衍生物作为氧化应激度测 定用试剂，以高灵敏度示出尖锐的吸收。因而，能够通过该对苯二胺衍生 物进行更高精度的氧化应激度测定。

另外，如上所述，在对苯二胺衍生物中包括在一般式(I)中，R¹、 R²、R³和R⁴之中至少1个是苯基的化合物。在对苯二胺衍生物的R¹、 R²、R³和R⁴之中至少1个是苯基的情况下，虽然由于其分子构造而存在 异同，但是由氧化而呈色的色素在420nm～800nm的宽范围的波长区域中 具有吸收波长。

因此，例如在作为氧化应激度测定的生物体试样使用血液的情况下， 通过选择在不受由血红蛋白等血液成分的存在引起的干涉的影响的长波长 侧的波长区域(例如，600nm以上的区域)中也具有吸收波长的上述的对 苯二胺衍生物，高精度的氧化应激度测定成为可能。

另外，虽然存在测定灵敏度根据测定装置2的种类等而产生变动的情 况，但是该对苯二胺衍生物在宽范围的波长区域中具有吸收波长，因此存 在难以受到由测定装置2引起的灵敏度变动的优点。特别地，在使用LED 作为测定的光源的情况下，虽然存在由LED的批间差异引起测定灵敏度变 动的情况，但是即使在这种情况下，通过使用该对苯二胺衍生物，精度高 的氧化应激度测定也成为可能。

作为本发明中的氧化发色试剂，在使用了以一般式(I)表示的化合物 的盐的情况下，由于调制发色试剂溶液时的向溶剂的溶解性提高，因此制 造上便利。

在图3中示出作为氧化发色试剂的对苯二胺衍生物的具体例。化学式 (II)～(X)分别表示N，N-二甲基-1，4-苯二胺(II)、N-乙基-N-(2-羟乙 基)-1，4-苯二胺(III)、N，N-双(2-羟乙基)-1，4-苯二胺(IV)、N-异丙 基-N’-苯基-1，4-苯二胺(V)、N-苯基-1，4-苯二胺(VI)、N-异丙基-N-苯 基-1，4-苯二胺(VII)、N-乙基-N-(2-羟乙基)-1，4-苯二胺硫酸盐 (VIII)、N，N-双(2-羟乙基)-1，4-苯二胺硫酸盐(IX)、N，N-二甲基- 1，4-苯二胺硫酸盐(X)。但是，本发明中的氧化发色试剂不被限定为这 些。

发色试剂溶液RS1被调节为氢离子指数(pH)条件成强酸性。发色试 剂溶液RS1通过添加强酸调节氢离子指数来成为强酸性。作为强酸，可以 使用无机强酸和有机强酸中的任一种。作为无机强酸，例如可以举出硫 酸、盐酸、硝酸、磷酸等。作为有机强酸，例如可以举出乳酸、醋酸、丙 酸、对甲苯磺酸、甘氨酸、邻苯二甲酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、草 酸、酒石酸、醋酸等。另外，也可以混合它们使用。

在发色试剂溶液RS1中，氢离子指数被调节为强酸性。在本发明中， 强酸性例如是低于pH3.0。具体地，在发色试剂溶液RS1中，氢离子指数 被调节为pH2.9以下(pH0～pH2.9)、pH2.5以下(pH0～pH2.5)、pH2.1 以下(pH0～pH2.1)、pH2.0以下(pH0～pH2.0)、pH1.0～pH2.9、 pH1.0～pH2.5、pH1.0～pH2.1、pH1.0～pH2.0或低于pH1.0。发色试剂溶液 RS1被一边核对氢离子指数一边添加强酸来调节。在本发明中，在调节发 色试剂溶液RS1之际，可以先使氢离子指数条件成为强酸性再溶解氧化发 色试剂，也可以先在水等溶剂中溶解氧化发色试剂再将氢离子指数条件调 节成强酸性。

发色试剂溶液RS1可以通过使强酸浓度成为规定的浓度来调节成强酸 性。在该情况下，无机酸或有机酸的浓度例如被添加到0.1M以上、 0.0001mM～1.0M、0.01mM～1.0M和0.1M～1.0M的任一个。

调节结束了的发色试剂溶液RS1例如被每次200μL填充到图1和图2 所示的支架1的发色试剂溶液槽11中。

[稀释液]

稀释液RS4是用于稀释试样S的。另外，稀释液RS4是用于稀释发色 试剂溶液RS1的。当试样S被稀释液RS4稀释时，生成稀释试样RS3。稀 释试样RS3被与发色试剂溶液RS1混合，生成测定液RS2。因而，结果是 稀释液RS4稀释发色试剂溶液RS1。

作为该稀释液RS4，例如被从醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、TRIS-马来 酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液、N- (2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)缓冲液和BIS-TRIS缓冲液等中选 择使用。这些缓冲液中，优选醋酸缓冲液、MES缓冲液、或TRIS-马来酸 缓冲液，更优选醋酸缓冲液。

所述稀释液RS4的氢离子指数被调节到pH3.6～pH5.6或pH4.6～pH5.4 的范围中。稀释液RS4所含有的缓冲剂的浓度被调节为在测定液RS2中最 终成为100mM～400mM或200mM～400mM。因此，缓冲剂的浓度在稀释 液RS4中，例如被调节为667mM～2667mM或1333mM～2667mM。发色试 剂溶液RS1的氢离子指数当被稀释液RS4稀释时，通过所述缓冲剂的缓冲 作用变化成稀释液RS4的氢离子指数。

调节结束了的稀释液RS4例如被每次400μL填充到图1和图2所示的 支架1的稀释液槽14中。

发色试剂溶液RS1或稀释液RS4包括过渡金属盐。该过渡金属盐为了 使由试样S所含有的氢过氧化物群(R-OOH)生成由烷氧基(R-O)和过 氧基(R-OO)构成的自由基而被添加。作为所述过渡金属盐，例如可以 举出硫酸铁(II)(化学式FeSO₄)、硫酸铜(I)(化学式Cu₂SO₄)等。 这之中，硫酸铁(II)更优选。发色试剂溶液RS1或稀释液RS4中的过渡 金属盐的浓度被调节为在测定液RS2中最终在0.0005mM～0.06mM或 0.001mM～0.03mM的范围。因此，所述过渡金属盐在被包括在发色试剂溶 液RS1中的情况下，例如被调节为在0.0006mM～0.072mM或 0.0012mM～0.036mM的范围。另一方面，所述过渡金属盐在被包括在稀释 液RS4中的情况下，例如被调节为在0.003mM～0.4mM或 0.007mM～0.2mM的范围。

[尖端]

尖端17如图1和图2所示，当用于测定氧化应激度的准备时，被安装 在测定装置2的管嘴21(后述)的前端，被从尖端装填处16取出。尖端 17具有通过测定装置2的取样泵单元21A的动作而吸取、排出试样S或发 色试剂溶液RS1等的功能。由此，尖端17被用于支架1内的各液体的转 移或通过吸取/排出进行的搅拌。尖端17被使用聚丙烯或聚乙烯等合成树 脂制造。

[测定装置]

测定装置2是用于使用支架1测定生物体内的氧化应激度的。如图1 和图2所示，测定装置2包括控制部20、管嘴21、测光单元22和调温块 23。

控制部20是用于控制测定装置2的动作处理的。如图1所示，控制部 20经由控制线24与取样泵单元21a、管嘴驱动单元21b、测光单元22、调 温块23等连接。控制部20具有CPU和存储器。在上述的取样泵池21a等 构成要素和所述CPU之间根据需要配置有接口电路。所述CPU通过执行 所述存储器所存储的程序来控制测定装置2的动作处理。所述存储器包括 ROM区域和RAM区域。所述ROM区域容纳测定装置2的动作处理程 序、参数、标准曲线等。所述RAM区域除了动作处理程序等之外，暂时 存储由测光单元22取得的数据。控制部20基于该数据算出吸光度。控制 部20使用所述ROM区域所存储的标准曲线基于所述吸光度算出试样S中 的氢过氧化物浓度，并且算出氧化应激度。另外，控制部20被构成为也 能够直接显示所述吸光度。

如图1所示，管嘴21被构成为通过取样泵单元21a和管嘴驱动单元 21b来进行动作。控制部20通过控制取样泵单元21a和管嘴驱动单元21b 的动作来控制管嘴21的动作。

管嘴21在前端安装尖端17，用于将从支架1内的槽吸取的液体向其 它槽分注或者将混合了的液体通过吸取/排出来混和。管嘴21也具有打开 测定装置2上所设置的支架1的上表面18贴着的密封层(图示省略)的功 能。管嘴21例如以不锈钢等形成，以突破所述密封层而打开孔的方式被 构成。

在氧化应激度测定所需要的槽或测光池等的开口部上开孔之后，管嘴 21将其前端部插入到尖端装填处16所填装的尖端17，从尖端装填处16拔 出尖端17。由此，尖端17被安装到管嘴21上。管嘴21被构成为通过管 嘴驱动单元21b顺着支架1的上表面18上在以箭头N1示出的方向水平移 动至目的位置，并且在以箭头N2示出的方向上下移动。安装了尖端17的 管嘴21移动至目的槽的位置，通过下降来使尖端17的前端部到达所述槽 内的液面。管嘴17通过取样泵单元21a的动作来将槽或测光池内的液体吸 取到尖端17内。其后，管嘴21移动至作为目的的其它槽或测光池，将尖 端17中所吸取的所述液向它们分注而转移。

测光单元22用于测光池12中的测定液RS2的呈色。如图1所示，测 光单元22具有发光部22a和受光部22b。发光部22a和受光部22b当支架 1被设置在测定装置2内时被隔着测光池12对置地配置。发光部22a具有 LED(图示省略)，例如将510nm的光向以箭头N3示出的方向照射。另 一方面，受光部22b具有光电二极管(图示省略)，接受从发光部22a发 出、通过了测光池12的光。测光单元22中的这样的发光、受光的控制由 控制部20进行。

调温块23是用于将支架1调节到适于氧化应激度的测定的温度的。 在调温块23中装有加热器(图示省略)。控制部20通过控制所述加热器 的开启/关闭来控制支架1的温度在规定的范围。控制部20将支架1例如 控制成37℃。

[氧化应激度的测定]

此处，通过图4所示的流程图使用支架1和测定装置2来说明进行氧 化应激度的测定的顺序的一例。测定装置2的动作由控制部20控制。在 测定氧化应激度的d-ROMS测试(Reactive Oxygen Metabolites，活性氧代 谢产物)中，不是直接计测生物体的活性氧-自由基。由此产生的氢过氧化 物(R-OOH)浓度被使用呈色反应测定，生物体内的氧化应激度被综合地 评价。因为氢过氧化物(R-OOH)是通过活性氧-自由基而受到了氧化反 应的脂质、蛋白质、氨基酸、核酸等的总称，成为氧化应激度的指标。

如图2所示，在支架1的发色试剂溶液槽11、稀释液槽14、清洗液 槽15中分别填充有规定量的发色试剂溶液RS1、稀释液RS4、清洗液 RS5。测定作业者例如使用移液管等将试样50μL分注到试样槽10中。在 该例中，作为试样S例如使用血浆。接着，测定作业者向测定装置2设置 支架1。接着，测定作业者关闭测定装置2的盖(图示省略)并按下开始 按钮(图示省略)。此后，测定装置2自动地动作，测定氧化应激度。

管嘴21在图2中如箭头所示下降，将尖端装填处16所装填的尖端17 安装到前端(S1)。安装了尖端17的管嘴21以箭头N1所示在各槽间移 动，在各槽中如箭头N2所示上下移动。安装了尖端17的管嘴21顺着支 架1移动至稀释液槽14，吸取稀释液RS4。其后，管嘴21移动到稀释槽 13，将126μL的稀释液RS4分注到稀释槽13(S2)。其后，管嘴21移动 到试样槽10，在吸取了试样S之后，向稀释槽13移动，将14μL的试样向 稀释槽13分注(S3)。其后，管嘴21向清洗液槽15移动，吸取或排出 清洗液RS5从而清洗尖端17的前端和内部(S4)。

稀释液RS4是醋酸缓冲液，氢离子指数被调节为pH5.0。由此，试样 的氢离子浓度被稳定。并且，在稀释液RS4中，以在测定液RS2中最终为 0.03mM的方式含有硫酸铁(II)(FeSO₄)作为过渡金属盐。因此，稀释 液RS4中的过渡金属盐的浓度例如被调节为0.2mM。由于过渡金属盐的作 用，生成由在生物体中的氧化的过程中被形成了的氢过氧化物群(R- OOH)、由烷氧基(R-O)和过氧基(R-OO)构成的自由基。

接着，管嘴21移动至发色试剂溶液槽11的位置，在吸取了发色试剂 溶液RS1之后，将150μL的发色试剂溶液RS1向测光池12分注(S5)。 接着，管嘴21移动到稀释槽13，在吸取了稀释试样RS3之后，移动到测 光池12的位置，将30μL的稀释试样RS3向测光池12分注(S6)。由 此，测定液RS2的液量成为180μL。管嘴21通过吸取或排出混合了测光 池12中的发色试剂溶液RS1和稀释试样RS3的测定液RS2来进行搅拌 (S7)。调温块23将测光池12以37℃保温5分钟。其后，测光单元22 测定510nm的吸光度(S8)。控制部20使用被事先设定的标准曲线来基 于所述吸光度算出氢过氧化物浓度(S9)。控制部20最终基于所述氢过 氧化物浓度算出氧化应激度。

在发色试剂溶液RS1中，N，N-双(2-羟乙基)-1，4-苯二胺硫酸盐作为 氧化发色试剂被溶解，例如通过添加硫酸成强酸性。在含有醋酸缓冲液的 稀释试样RS3被添加的时刻，测定液RS2的氢离子指数变化成适于呈色反 应的pH5.0。该氧化发色试剂在测光池12中如果接触自由基则被氧化，根 据自由基的量变化成自由基阳离子，呈红紫色。红紫色的呈色的强度反映 处于血中的氢过氧化物的浓度，与受到活性氧-自由基的影响的细胞、作为 分子的副产物的活性氧代谢物(ROMS)的量直接成比例。

在作为试样S测定全血的情况下，能够使用一般式(I)的R¹、R²、 R³和R⁴之中至少1个是苯基的化合物作为氧化发色试剂。如上所述，在 具有该构造的氧化发色试剂通过氧化呈色的情况下，生成在420nm～800nm 的宽范围的波长区域中具有吸收波长的色素。由此，能够以避免了血红蛋 白的吸收的测定波长进行测定。作为该测定波长，例如采用600nm以上的 波长。

如上所述，根据本实施方式，发色试剂溶液RS1成强酸性。由此，使 被溶解的对苯二胺衍生物等的氧化发色试剂被稳定，因此能够抑制氧化发 色试剂被溶解了的发色试剂溶液RS1的背景的上升。这时，氧化发色试剂 的反应性被维持而不变差。因而，将氧化发色试剂作为液状试剂调节/运输 /保管成为可能。由此，省去了在测定氧化应激度之前将氧化发色试剂溶解 到溶剂中的麻烦，因此对测定作业者来说方便。另外，能够迅速地得到精 度好的测定数据。

当在测定中使用自动测定装置时，存在将在测定氧化应激度之前将干 燥氧化发色试剂溶解到水等溶剂中的动作作为所述自动测定装置执行的做 法的情况。在这样的自动测定装置中，充分地进行所述干燥氧化发色试剂 的重新溶解成为确保测定精度的重要因素。然而，存在所述干燥氧化发色 试剂的溶解没有被所述自动测定装置充分地进行，因此测定精度恶化的情 况。与此相对，根据本实施方式，不需要由测定装置2进行的干燥氧化发 色试剂的溶解，因此测定装置2的负担变少。能够带来测定装置2的制造 成本的削减。另外，由于能够直接使用氧化发色试剂完全溶解了的发色试 剂溶液RS1，因此能够将测定精度保持为好的状态。因而，本实施方式的 发色试剂溶液RS1适于在自动地进行氧化应激度的测定的测定装置2中使 用。

在制造冻结干燥试剂等干燥试剂中，需要精度良好地分注溶解了氧化 发色试剂的溶解液的分注设备，或者需要冻结干燥设备。根据本实施方 式，由于能够将氧化发色试剂作为液状试剂调节/运输/保管，因此在制造 氧化应激度测定用支架1之际，不需要特别的分注设备或干燥设备。由 此，能够谋求氧化应激度测定用支架1的制造成本的降低。

支架1还含有用于稀释发色试剂溶液RS1的稀释液RS4，稀释液RS4 通过缓冲剂被调节为适于呈色反应的规定的氢离子指数。由此，被调节成 强酸性的发色试剂溶液RS1的氢离子指数通过被稀释液RS4稀释而变化成 稀释液RS4的氢离子指数。由此，能够精度良好地测定氧化应激度。

本发明不被限定为上述的实施方式的内容。本发明所涉及的发色试剂 溶液的背景的上升抑制方法的工艺的具体的构成可进行各种自由变更。同 样地，本发明所涉及的发色试剂溶液、试剂盒和使用该试剂盒的测定装置 的具体的构成可进行各种自由设计变更。

在本发明中，试剂盒不限于具有多个槽或测光池的支架1。也包括在 试剂盒中将填充了氧化发色试剂被溶解了的强酸性的发色试剂溶液的容 器，和过渡金属盐被溶解了的、填充了用于稀释试样S的稀释液RS4的容 器配套的装置。

另外，在本发明中，测定装置不限于测定支架1的测定装置2。也包 括从瓶吸取试剂，将该试剂向与瓶分体而准备的测光池分注，并测定呈色 的变化的测定装置。

另外，在本发明中，氧化发色试剂不限于苯二胺衍生物。氧化发色试 剂也包括四甲基联苯胺或邻联甲苯胺等联苯胺衍生物。另外，在氧化发色 试剂也包括特林德试剂或吩噻嗪衍生物。

实施例

以下，基于实施例具体地说明本发明的效果。本发明不限于这些实施 例的任一个。

[实施例1]

按照表2所示的处方调制了比较发色试剂溶液(1)、(2)、发色试 剂溶液(1)、(2)。发色试剂溶液(1)、(2)是通过添加硫酸成强酸 性的。作为氧化发色试剂，使用N，N-双(2-羟乙基)-1，4-苯二胺硫酸盐或 N-乙基-N-(2-羟乙基)-1，4-苯二胺硫酸盐。发色试剂溶液(1)、(2)中的 硫酸浓度为0.1M。比较发色试剂溶液(1)、(2)除了不添加硫酸之外与 发色试剂溶液(1)、(2)为相同的组成。

在确认了各试剂溶液的调节后的着色之后，40℃保管14天保管，以 肉眼比较背景着色的程度。着色越强表示背景上升越大。

表2(实施例1的处方)

如表3所示，在调节后，比较发色试剂溶液(1)、(2)、发色试剂 溶液(1)、(2)都是透明的，没有差异。40℃保管了14天之后，比较 发色试剂溶液(1)、(2)都强烈地着色成紫色。另一方面，发色试剂溶 液(1)、(2)分别是稍微粉色或透明的。由此，知晓在强酸性下保管的 溶液的背景的上升被抑制。

表3(实施例1的确认结果)

[实施例2]

按照表4所示的处方来调节比较发色试剂溶液(3)和发色试剂溶液 (3)～(8)。作为氧化发色试剂，使用N，N-双(2-羟乙基)-1，4-苯二胺 硫酸盐。氧化发色试剂的浓度为3.2mM。作为强酸，使用硫酸、盐酸、乳 酸、醋酸、丙酸、对甲苯磺酸。通过添加各种强酸来将各发色试剂溶液的 氢离子指数调节为图7所示的样子。以40℃的条件保管各发色试剂溶液， 调节后，在第3天、第7天测定背景的着色。测定如下地进行，将发色试 剂溶液(3)～(8)分别分注到支架1的测光池12，以能够显示510nm的 吸光度的方式设定测定装置2。比较发色试剂溶液(3)的测定以除了不添 加强酸之外以与发色试剂溶液(3)～(8)相同的条件进行。

表4(实施例2的处方)

氧化发色试剂：N，N-双(2-羟乙基)-1，4-苯二胺硫酸盐

在图5～图10示出结果。图5～图10分别是发色试剂溶液(3)～(8) 和比较发色试剂溶液(3)的比较结果。在各图表中，纵轴表示510nm处 的吸光度，横轴表示在40℃的保管天数。吸光度的变化越大，表示背景上 升越大。各发色试剂溶液的图表与强酸的种类无关示出同样的倾向。即， 发现了如下倾向，与强酸的种类相比氢离子指数低的保管条件更使背景上 升的程度变小。

本发明的支架将在冷蔵条件(4℃以下)的保存作为前提。以冷蔵进 行的保存与在40℃的保存相比预计有绝对良好的保存稳定性。在假想了冷 蔵保存的情况下，从与比较发色试剂溶液(3)的比较确认了如果是比较 的短期间，在pH2.9以下的条件下能抑制背景的着色。另外，确认了如果 是pH2.1以下的条件，即使长时间的保存，也能抑制背景上升。

[实施例3]

按照表5所示的处方调节了比较发色试剂溶液(4)和发色试剂溶液 (9)。作为氧化发色试剂，使用N，N-双(2-羟乙基)-1，4-苯二胺硫酸 盐。在发色试剂溶液(9)中，氧化发色试剂的浓度为3.2mM。作为强 酸，使用对甲苯磺酸。发色试剂溶液(9)中的对甲苯磺酸的浓度调节为 0.1M。比较发色试剂溶液(4)除了不添加强酸之外与发色试剂溶液(9) 是相同条件。

表5(实施例3的处方)

40℃保管比较发色试剂溶液(4)和发色试剂溶液(9)14天，比较调 节后和保管后的反应性。

测定之际，作为试样S，使用了叔丁基氢过氧化物(t-BuOOH)的水 溶液。叔丁基氢过氧化物用作氢过氧化物(R-OOH)的标准物质。叔丁基 氢过氧化物溶液调节为最终的测定液RS2中的浓度(质量％)成0％、 0.025％、0.25％。

稀释液RS4在最终的测定液RS2中，调节为醋酸缓冲液(pH5.0)的 浓度为300mM、FeSO₄的浓度为0.03mM。因此，将醋酸缓冲液(pH5.0) 的浓度调节为2000mM。另外，将FeSO₄的浓度调节为在所述醋酸缓冲液 (pH5.0)中为0.2mM。

测定使用测定系统A按照图4所示的测定流程进行。这时，将测定装 置2设定为能够显示510nm的吸光度。

即，在支架1的发色试剂溶液槽11、稀释液槽14中分别填充规定量 的发色试剂溶液(9)和所述醋酸缓冲液。另外，向试样槽10分注所述叔 丁基氢过氧化物溶液50μL。接着，将支架1设置到测定装置2上，开始测 定。测定装置2的管嘴21将尖端17安装到前端，将稀释液槽14的所述醋 酸缓冲液126μL分注到稀释槽13中。接着，管嘴21吸取试样槽10的所 述叔丁基氢过氧化物溶液，将其14μL向稀释槽13分注。

其后，管嘴21吸取发色试剂溶液槽11的发色试剂溶液(9)，将其 的150μL向测光池12分注。接着，管嘴21从稀释槽13吸取由所述叔丁 基氢过氧化物溶液和所述醋酸缓冲液构成的稀释试样RS3，将30μL的稀 释试样RS3向测光池12分注。管嘴21通过吸取或排出来搅拌测光池12 中的液体，使混合液成为测定液RS2。其后，调温块23以37℃将测光池 12保温5分钟，测光单元22测定510nm的吸光度。

对于比较发色试剂溶液(4)也同样地进行测定。

在图11中示出测定结果。在图表中，纵轴表示510nm处的吸光度， 横轴表示叔丁基氢过氧化物的浓度。在发色试剂溶液RS1中添加对甲苯磺 酸成强酸性的吸光度高，保管后也具有良好的反应性。即，知晓成强酸性 条件的发色试剂溶液(9)与不成强酸性的比较发色试剂溶液(4)相比 较，抑制了背景着色，并且氧化发色试剂的反应性也被保持。

如上所述，知晓根据本发明，能够抑制背景的上升从而运输/保管溶解 了氧化发色试剂的发色试剂溶液RS1。