一种高脂诱导灵长类动物黄斑变性模型的方法

摘要

本发明公开了一种高脂诱导灵长类动物黄斑变性模型的方法，该方法将患有玻璃膜疣病变的非人灵长类动物，用高脂饲料喂养，每天喂养3次，每次喂养量为75-100克，喂养60-110天，即可得到稳定的黄斑变性模型。本发明能获得接近于人类自然发生的干性或湿性眼底黄斑变性动物模型，且能够保存Bruch’s膜完整，模型稳定不可逆，动物依从性好，无须手术或处死动物检查，造模成本很低，为研究黄斑变性模型的发病机制、治疗药物的筛选及药效学评价提供理想的动物模型。

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物疾病模型的建立方法，特别是涉及一种高脂诱导灵长类动物黄斑变性 模型的方法。

背景技术

黄斑变性是一种慢性眼病，其病理机制主要为眼睛黄斑区结构的衰老性改变，分为年龄 相关性黄斑变性(又称老年性黄斑变性，age-related macular degeneration，ADM)和少年 黄斑变性两种。ADM是发生在视网膜色素上皮层、Bruch’s膜、脉络膜毛细血管的变性疾病， 其患病率随年龄的增长而增加，在英、美等发达国家，ADM是65岁以上老年人致盲眼病中最 常见的原因，随着我国人口老龄化的加快，该病有明显的上升趋势。ADM分为干性和湿性两 种类型，其中干性ADM又称为萎缩性或非渗出性AMD，湿性又称为渗出性AMD。干性AMD特点 为进行性视网膜色素上皮萎缩或凋零，导致感光细胞变性，引起中心视力减退，双眼同时发 病，视力下降缓慢。湿性AMD特点为视网膜色素上皮与Bruch’s膜之间有来自脉络膜的新生 血管形成，导致浆液性和(或)出血性视网膜色素上皮和(或)神经上皮脱离，双眼先后发病， 视力下降较急。湿性ADM患者由于伴有脉络膜新生血管(CNV)，常导致黄斑反复出血，对患 者视功能的损害更为严重。目前ADM仍然无明确有效的治疗手段，ADM发病机理和治疗方法 成为当今社会的研究热点，当务之急是建立良好的黄斑变性动物模型，为该病的发病机制研 究、药效学研究和其他转化医学临床前研究提供稳定的模型载体。

很多科学家用多种方法制备黄斑变性动物模型。如激光诱导CNV模型，激光通过对视网膜 产生机械损伤、热效应和光化学等生物效应，造成Bruch’s膜破坏，使视网膜在炎症修复过 程中产生新生血管。另还有：模型基因修饰小鼠动物模型、手术诱导脉络膜新生血管模型等， 但目前提供的ADM模型均存在以下不足：(1)选用小鼠、大鼠等非灵长类动物作为模型，非 灵长类动物与人类ADM存在种属差异，其眼睛结构、发病过程及病理特点与人存在较大的差异； (2)Bruch’s膜被破坏；(3)产生过多的生长因子。目前，尚没有能够完全模拟人黄斑变 性发生发展的理想的动物模型。

发明内容

针对上述黄斑变性动物模型存在的不足，本发明提供一种高脂诱导灵长类动物黄斑变性 模型的方法，该方法以患有玻璃膜疣病变的非人灵长类动物为对象，通过高脂饲料诱导,获得 稳定不可逆的能够完全模拟人黄斑变性发生发展的动物模型，为黄斑变性发病机理的研究、 治疗药物的筛选、药效学评价等提供良好的模型载体。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高脂诱导灵长类动物黄斑变性模型的方法，该方法将患有玻璃膜疣病变的非人灵长 类动物，用高脂饲料喂养，每天喂养3次，每次喂养量为75-100克，喂养60-110天，即可 得到稳定的黄斑变性模型。

以上所述高脂诱导灵长类动物黄斑变性模型的方法，在喂养60天后，参照人类临床诊断 标准，通过眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影和光学相干断层扫描对非人灵长类动物进行 跟踪观察，每周观察1次，当观察到视网膜色素上皮萎缩或视网膜色素上皮与Bruch’s膜之 间有新生血管形成时，即可得到稳定的黄斑变性模型。

以上所述高脂诱导灵长类动物黄斑变性模型的方法，所述高脂饲料为专为灵长类动物研 制的高脂饲料，包括以下重量份比的原料：基础饲料73份、猪油26份、植物油24份、蛋清 2份、蔗糖2份；所述基础饲料包括以下重量百分比的原料：大米570份、面粉80份、豆粕 150份、大豆45份、大豆浓缩蛋白40份、鱼粉20份、鸡肉粉50份、豆油8份、磷酸氢钙 12份、氯化胆碱1.5份、碳酸钙粉3.6份、泛酸钙0.15份、食盐3.7份、维生素C 0.2份、 维生素E 0.1份。其制备方法参照我公司已获授权专利：灵长类实验型高脂饲料及其制备方 法，ZL 201210581731.0。

玻璃膜疣是一种发生在脉络膜、视网膜的一种变性疾病，是色素上皮细胞异常代谢产物 在视网膜上的异常沉积所致，早期视功能可不受损害，有些患者出现生理盲点扩大，严重者 也可出现弓形暗点，视野缩窄或视力下降。本发明所述的患有玻璃膜疣病变的非人灵长类动 物是指在眼底后极部或黄斑部经过眼底彩色照相诊断具有异常代谢物沉积的症状。

以上所述高脂诱导灵长类动物黄斑变性模型的方法，所述高脂饲料为专利。

黄斑变性，大多发生于45岁以上，其患病率随年龄的增长而增高。以上所述高脂诱导灵 长类动物黄斑变性模型的方法，所述非人灵长类动物优选为中老年非人灵长类动物，年龄为 ≥10岁。

灵长类动物与人类基因同源性高，免疫反应与人相似，在所有动物中眼球及生理生化指 标与人类最为相似，因此，本发明选用非人灵长类动物作为黄斑变性的动物模型。所述的非 人灵长类动物，可为猿、猴、猩猩等，优选为食蟹猴。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：

(1)本发明将患有玻璃膜疣病变的非人灵长类动物，通过高脂饲料的饮食自然诱导，能 获得接近于人类自然发生的干性或湿性眼底黄斑变性动物模型，且能够保存Bruch’s膜完整， 模型稳定不可逆，为黄斑变性发病机理的研究、治疗药物的筛选、药效学评价等提供良好的 模型载体。

(2)本发明采用的高脂饲料为专门针对非人灵长类动物设计的，高脂饲料配方中含有动 物脂肪猪油，同时还有相当比例的植物油，配方中油脂的含量高达28.8-51.8％，高于其他高 脂饲料，饲料中含有蔗糖，口感好，饲喂者只需将高脂饲料放入取食盘中，动物便会自己取 用，对其有很好的依从性，方便、易操作，可长期喂养，能构建灵长类动物模拟人类摄食高 脂食品的真实天然的生物环境。本发明采用的高脂饲料诱导并加速了动物黄斑变性模型的形 成，动物喂养60-110天后，即可得到稳定不可逆的黄斑变性模型，建模的成功率为90％以上。

(3)本发明通过眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影和光学相干断层扫描，检查非人灵 长类动物是否患有玻璃膜疣、干性或湿性眼底黄斑变性疾病，所用的检查方法灵敏度高、特 异性强、操作简单，可以活体检查，对动物伤害小，得到稳定的黄斑变性模型后，动物仍然 可以进行药效学试验。

(4)本发明选用的非人灵长类动物，与人类基因同源性高，免疫反应与人相似，在所有 动物中眼球及生理生化指标与人类最为相似，所建立的黄斑变性模型，其疾病的发生、病理 过程与人类相似度很高，能够模拟人黄斑变性的发生发展。

附图说明

图1为患有玻璃膜疣的食蟹猴眼底彩色照相图

图2为患有玻璃膜疣的食蟹猴荧光素眼底血管造影图

图3为诱导食蟹猴湿性黄斑变性双眼的眼底彩色照相图

图4为诱导食蟹猴湿性黄斑变性双眼的荧光素眼底血管造影图

图5为诱导食蟹猴湿性黄斑变性双眼的光学相干断层扫描图

图6为诱导食蟹猴干性黄斑变性左眼的眼底彩色照相图

图7为诱导食蟹猴干性黄斑变性左眼的荧光素眼底血管造影图

图8为诱导食蟹猴干性黄斑变性左眼的光学相干断层扫描图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明，但不限制本发明的保护范围和应用范围。

一、主要仪器、试验材料

1.主要仪器：

(1)眼底照相机：购买于日本托普康公司。

(2)OCT检查仪：购买于德国海德堡公司。

(3)眼底荧光血管造影仪：购买于日本托普康公司公司。

2.试验材料：

(1)基础饲料的制备方法，包括以下步骤：

a.取大米、大豆、豆粕，分别粉碎、过60目筛，得粉碎好的大米粉、大豆粉、豆粕粉；

b.取维生素E 0.1kg、豆油8kg，混匀，按等量递增法加入面粉，混匀，过60目筛，得 分散均匀的面粉混合物A；

c.取氯化胆碱1.5kg、维生素C 0.2kg、泛酸钙0.15kg，混匀，加入石粉3.6kg，混匀， 再加入食盐3.7kg、磷酸氢钙12kg，混匀，得混合物B；

d.取大豆粉45kg、大豆浓缩蛋白40kg、鱼粉20kg、鸡肉粉50kg及混合物A、B，混匀， 得混合物C；

e.取大米粉570kg、豆粕粉150kg和混合物C，置混料箱内搅拌混合均匀，放入100℃的 烘箱中干燥至水分≤10％，取出，即得。

(2)高脂饲料的制备方法，包括以下步骤：

取猪油26kg、花生油24kg、鸡蛋清2kg、蔗糖2kg，搅拌，混匀，加入到73kg上述制备 好的基础饲料中，再加入适量水，搅拌成均匀的饼干面糊，继续揉搓使之成为面团，将面团 切成等量的小方块，放入180℃的烤箱中烤干，取出，即得。

二、试验动物

本试验使用的食蟹猴由广西雄森灵长类养殖繁育中心提供。经常规的检疫和体检、无肢 体残损，动物正常行为习性完整，检查报告包括临床检查和实验室检查内容，均参照国家标 准执行。本研究在广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司AAALAC(Association  forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal)国际资质认证实验室完成。

食蟹猴经过眼底照相机检查，选取在眼底后极部或黄斑部具有异常代谢物沉积的症状的 食蟹猴18只，年龄10-18岁，其中12只母猴，6只公猴，并将它们随机分为空白组、实验 组，空白组8只，实验组10只。

患有玻璃膜疣的食蟹猴(编号为1)眼底彩色照相见图1。可以看出双眼底后极部可见少 量点状黄色病变，为异常代谢物沉积的症状，未见其他病变。结论：双眼底玻璃膜疣。

患有玻璃膜疣的食蟹猴(编号为1)荧光素眼底血管造影图见图2。可以看出双眼底后极 部可见少量点状荧光，右眼较为明显，未见其他异常荧光。结论：双眼底患有玻璃膜疣。

三、建模方法

1.空白组的喂养方法：用上述制备好的基础饲料喂养，每天喂养3次，每次喂养量为 75-100克。

2.实验组的喂养方法：用上述制备好的高脂饲料喂养，每天喂养3次，每次喂养量为 75-100克。

3.建模观察：喂养60天，通过眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影和光学相干断层扫描 对非人灵长类动物进行跟踪观察，观察频率每个星期观察一次。当观察到视网膜色素上皮萎 缩时，得到稳定的干性黄斑变性模型；当观察到视网膜色素上皮与Bruch’s膜之间有新生血 管形成时，即可得到稳定的湿性黄斑变性模型。

四、实验结果

1.空白组情况：空白组8只食蟹猴，喂养60天至130天期间，每个星期对非人灵长类动 物进行跟踪观察1次。分别通过眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影和光学相干断层扫描对 空白组8只食蟹猴进行检测，结果表明：8只食蟹猴与试验前情况基本一样：眼底后极部或 黄斑部具有异常代谢物沉积的症状，未见明显加重症状，也没有出现色素上皮萎缩或脉络膜 新生血管症状，即均没有出现黄斑变性病变。

2.试验组情况

本发明经过130天的喂养和观察检测，只有1例未出现黄斑病变，建模的成功率为90％， 且能获得湿性或干性两种类型黄斑变性模型，其中有20％为湿性黄斑变性模型，有70％为干性 黄斑变性模型，得到的模型很稳定，没有发生自发性恢复现象，试验中食蟹猴的依从性好， 无须手术或处死动物检查，且造模成本很低，为研究黄斑变性模型的发病机制、治疗药物的 筛选及药效学评价提供理想的动物模型。具体情况详见表1。

表1试验组黄斑变性模型情况表

编号 年龄(岁) 确诊时间(天) 模型类型 1 15 74 干性 2 16 95 湿性 3 11 60 干性 4 17 102 干性 5 13 109 干性 6 11 130 无 7 10 81 干性 8 15 95 干性 9 18 67 干性 10 14 81 湿性

以下为本发明诱导成功的两种类型模型情况：

(1)湿性黄斑变性模型(编号为2食蟹猴)情况

见图3。双眼的眼底彩色照相下玻璃体腔清晰，未见玻璃体增殖；视乳头边界清晰，颜 色淡红；黄斑中心凹反光环消失，双眼黄斑区均可见1.5PD大小的脉络膜萎缩区，右眼萎缩 区中央还可见一1/4PD大小的黄白色渗出灶；血管走行未见迂曲，视网膜平伏，未见视网膜 脱色素、出血、渗出等情况。

见图4。双眼的荧光素眼底血管造影检查，视网膜循环时间正常，视乳头荧光边界清晰， 未见异常高荧光；双眼黄斑区中央均可见一1/2PD大小低荧光区，其余后极部未见异常荧光， 血管未见阻塞、遮蔽荧光、以及荧光渗漏，背景荧光正常，未见荧光渗漏。

见图5。双眼的光学相干断层扫描，成像清晰，可见黄斑中心凹变浅，视网膜各层层次 分明，视网膜厚度在正常范围内，视神经纤维层厚度正常，Bruch’s膜尚完整；右眼脉络膜 在黄斑区可见囊性扩张，其余血管无扩张；左眼黄斑区在RPE层和脉络膜之间可见隆起，声 像较强，为新生血管。

结果表明：左眼黄斑区脉络膜新生血管，出现湿性黄斑变性病变。

(2)干性黄斑变性模型(编号为1食蟹猴)情况

见图6。左眼眼底彩色照相下玻璃体腔清晰，未见玻璃体增殖；视乳头边界清晰，颜色 淡红；黄斑中心凹反光环清晰，血管走行未见迂曲，视网膜平伏，可见眼底较多点状黄白色 病变，未见视网膜出血、渗出等情况。

见图7。左眼荧光素眼底血管造影检查，视网膜循环时间正常，视乳头荧光边界清晰， 未见异常高荧光；黄斑区以及后极部可见较多量窗样荧光，与眼底照相点状黄白色病变对应， 其余未见异常荧光，血管未见阻塞、遮蔽荧光、以及荧光渗漏，背景荧光正常，未见荧光渗 漏。

见图8。左眼光学相干断层扫描，成像清晰，可见黄斑中心凹存在，视网膜各层层次分 明，视网膜厚度在正常范围内，视神经纤维层厚度正常，Bruch’s膜完整光滑；所见脉络膜 平整，血管无扩张。

结果表明：左眼眼底部分色素上皮损害，出现干性黄斑变性病变。