一种离子交换和疏水层析结合分离纯化眼镜蛇毒神经毒素的方法

摘要

本发明具体涉及一种离子交换和疏水层析结合分离纯化眼镜蛇毒神经毒素的方法。该分离纯化方法，包括以下步骤：(1)称取眼镜蛇毒粗品4-5重量份，加入至0.04-0.05体积份水中或pH5.0～7.0的0.01M-0.05M的磷酸盐缓冲液中，搅拌溶解，0-8℃离心，沉淀弃去，上清液过滤，得供试品溶液A，备用；(2)供试品溶液A通过离子交换层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测，收集，得供试品溶液B，备用；(3)供试品溶液B通过疏水层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品；当所述重量份的单位为g时，则对应体积份单位为L。该方法简化了操作步骤，缩短了分离纯化的周期，收率较高，纯度较高，适于眼镜蛇毒神经毒素的工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种离子交换和疏水层析结合分 离纯化眼镜蛇毒神经毒素的方法。

背景技术

眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的毒液，其化学成分复杂，含有多种 蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物学活性。自1933 年Monaelessert和Taguet首次报道眼镜蛇毒对癌组织压迫神经引起疼痛的 病例有显著疗效以来，眼镜蛇毒的镇痛作用得到了深入的研究，其中眼镜 蛇毒神经毒素显示了独特的镇痛作用。眼镜蛇毒神经毒素有长链和短链之 分，短链含60～62个氨基酸，4个二硫键；长链含65～72个氨基酸，5个二 硫键。眼镜蛇毒神经毒素的镇痛机理与吗啡相似，镇痛效果强于吗啡，持 续时间长，无成瘾性和耐药性，起效较吗啡慢，有助于戒除吗啡的毒瘾， 具有独特的治疗作用。

有文献报道，通过眼镜王蛇毒的粗分离、组分的活性鉴定、Sephadex  G-50凝胶柱层析、CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Phenyl- Sepharose HP疏水层析和Sephasil Peptide C18反相层析等步骤分离纯化眼 镜王蛇毒神经毒素。但是，该方法由于需要联合使用凝胶柱层析、离子交 换层析、疏水层析和反相层析等柱层析方法，不仅操作步骤复杂，而且分 离纯化周期长(仅眼镜王蛇毒的粗分离这一步就需要576小时)，使得其应 用范围仅局限于实验室中。

因此，研究一种操作步骤简便、分离纯化周期短、适于工业化生产的 眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法具有重要的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种操作步骤简便、分离纯化周期 短、适于工业化生产的眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)称取眼镜蛇毒粗品4-5重量份，加入至0.04-0.05体积份水中或pH 5.0～7.0的0.01M-0.05M的磷酸盐缓冲液中，搅拌溶解，0-8℃离心，将沉淀弃 去，将上清液进行过滤，得供试品溶液A，备用；

(2)将所述供试品溶液A通过离子交换层析纯化，梯度洗脱，HPLC检 测，收集，得供试品溶液B，备用；

(3)将所述供试品溶液B通过疏水层析纯化，梯度洗脱，HPLC检测， 收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品；

当所述重量份的单位为g时，则对应体积份单位为L。

本发明上述分离纯化方法，所述离子交换层析的介质为CM Sepharose  Fast Flow。

本发明上述分离纯化方法，所述疏水层析的介质为UniPhenyl。

本发明上述分离纯化方法，所述步骤(2)中，以pH 5.0～7.0的0.01M- 0.05M的磷酸盐缓冲液为流动相A，以包括0.8-1.2M Na⁺的pH 5.0～7.0的0.01 M-0.05M的磷酸盐缓冲液为流动相B，所述Na⁺选自硫酸钠、氯化钠、磷酸钠 中的至少一种。

本发明上述分离纯化方法，以包括1M Na⁺的pH 5.0～7.0的0.01M-0.05M 的磷酸盐缓冲液为流动相B。

本发明上述分离纯化方法，所述步骤(3)中，以pH 5.0～7.0的0.01M- 0.05M的磷酸盐缓冲液为流动相A，以包括2.5-3.5MNH₄⁺的pH 5.0～7.0的0.01 M-0.05M的磷酸盐缓冲液为流动相C，所述NH₄⁺选自硫酸铵、醋酸铵中的至 少一种。

本发明上述分离纯化方法，以包括3M NH₄⁺的pH 5.0～7.0的0.01M-0.05M 的磷酸盐缓冲液为流动相C。

本发明上述分离纯化方法，所述步骤(2)中梯度洗脱的步骤为：A：B 体积比为100％：0％，A：B体积比为90％：10％，A：B体积比为85％：15％， A：B体积比为80％：20％，A：B体积比为50％：50％。

本发明上述分离纯化方法，所述步骤(3)中梯度洗脱的步骤为：A：C 体积比为0％：100％，A：C体积比为16.7％：83.3％，A：C体积比为33.3％： 66.7％，A：C体积比为50％：50％，A：C体积比为66.7％：33.3％，A：C体 积比为83.3％：16.7％，A：C体积比为100％：0％。

本发明上述分离纯化方法，所述步骤(2)中，所述梯度洗脱前还包括 以下步骤：先用1-3个柱床体积的流动相B进行活化洗脱，再用2-4个柱床 体积的流动相A进行平衡洗脱；

所述步骤(3)中，所述梯度洗脱前还包括以下步骤：先用1-3个柱床体 积的流动相A进行活化洗脱，再用2-4个柱床体积的流动相C进行平衡洗脱；

所述步骤(1)中，所述过滤为采用45μm PES微孔滤膜进行过滤，所述 离心为采用8000-12000rpm进行离心。

本发明还提供一种上述分离纯化方法得到的眼镜蛇毒神经毒素。

与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有以下优点：

本发明眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，将眼镜蛇毒粗品溶液通过 离子交换层析和疏水层析两步纯化，并进一步优化选择离子交换层析的介 质、离子交换层析的流动相、离子交换层析的梯度洗脱的步骤、疏水层析 的介质、疏水层析的流动相和疏水层析的梯度洗脱的步骤等，简化了操作 步骤，缩短了分离纯化的周期(8-10小时即可完成分离纯化过程)，收率较 高(约50％)，纯度较高(为98.2％)，适于眼镜蛇毒神经毒素的工业化生 产。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实 施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1为实验例1中对照品的C18柱HPLC检测图；

图2为实验例1中实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的C18柱 HPLC检测图；

图3为实验例3抗炎活性实验结果图，1为生理盐水对照组，2为 实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素组。

具体实施方式

实施例1

本实施例眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)称取眼镜蛇毒粗品4.5g，加入至0.045L水中或pH 6.0的0.03M的磷 酸盐缓冲液中，搅拌溶解，4℃采用10000rpm进行离心，将沉淀弃去，将上 清液采用45μmPES微孔滤膜进行过滤，过滤，得供试品溶液A，备用；

(2)将供试品溶液A通过离子交换层析纯化，离子交换层析的介质为 CM Sepharose Fast Flow，以pH 6.0的0.03M的磷酸盐缓冲液为流动相A，以包 括1M氯化钠的pH 6.0的0.03M的磷酸盐缓冲液为流动相B，先用2个柱床体积 的流动相B进行活化，再用3个柱床体积的流动相A进行平衡洗脱，然后梯度 洗脱，梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为100％：0％，A：B体积比为90％： 10％，A：B体积比为85％：15％，A：B体积比为80％：20％，A：B体积比 为50％：50％，HPLC检测，收集，得供试品溶液B，备用；

(3)将供试品溶液B通过疏水层析纯化，疏水层析的介质为UniPhenyl， 以pH 6.0的0.03M的磷酸盐缓冲液为流动相A，以包括3M硫酸铵的pH 6.0的 0.03M的磷酸盐缓冲液为流动相C，先用2个柱床体积的流动相A进行活化洗 脱，再用3个柱床体积的流动相C进行平衡洗脱，然后梯度洗脱，梯度洗脱的 步骤为：A：C体积比为0％：100％，A：C体积比为16.7％：83.3％，A：C体 积比为33.3％：66.7％，A：C体积比为50％：50％，A：C体积比为66.7％： 33.3％，A：C体积比为83.3％：16.7％，A：C体积比为100％：0％，HPLC检 测，收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品。

本实施例整个分离纯化过程仅需8-10小时即可完成，收率约为50％，纯 度为98.2％，适于眼镜蛇毒神经毒素的工业化生产。

实施例2

本实施例眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)称取眼镜蛇毒粗品4g，加入至0.04L水中或pH 5.0的0.01M的磷酸盐 缓冲液中，搅拌溶解，0℃采用8000rpm进行离心，将沉淀弃去，将上清液采 用45μmPES微孔滤膜进行过滤，过滤，得供试品溶液A，备用；

(2)将供试品溶液A通过离子交换层析纯化，离子交换层析的介质为 CM Sepharose Fast Flow，以pH 5.0的0.01M的磷酸盐缓冲液为流动相A，以 包括0.4M硫酸钠的pH 5.0的0.01M的磷酸盐缓冲液为流动相B，先用1个柱床 体积的流动相B进行活化，再用2个柱床体积的流动相A进行平衡洗脱，然后 梯度洗脱，梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为100％：0％，A：B体积比为 90％：10％，A：B体积比为85％：15％，A：B体积比为80％：20％，A：B 体积比为50％：50％，HPLC检测，收集，得供试品溶液B，备用；

(3)将供试品溶液B通过疏水层析纯化，疏水层析的介质为UniPhenyl， 以pH 5.0的0.01M的磷酸盐缓冲液为流动相A，以包括5M醋酸铵的pH 5.0～7.0的0.01M-0.05M的磷酸盐缓冲液为流动相C，先用1个柱床体积的流动 相A进行活化洗脱，再用2个柱床体积的流动相C进行平衡洗脱，然后梯度洗 脱，梯度洗脱的步骤为：A：C体积比为0％：100％，A：C体积比为16.7％： 83.3％，A：C体积比为33.3％：66.7％，A：C体积比为50％：50％，A：C体 积比为66.7％：33.3％，A：C体积比为83.3％：16.7％，A：C体积比为100％： 0％，HPLC检测，收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品。

本实施例整个分离纯化过程仅需8-10小时即可完成，收率约为50％，纯 度为98.2％，适于眼镜蛇毒神经毒素的工业化生产。

实施例3

本实施例眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)称取眼镜蛇毒粗品5g，加入至0.05L水中或pH 7.0的0.05M的磷酸盐 缓冲液中，搅拌溶解，8℃采用12000rpm进行离心，将沉淀弃去，将上清液 采用45μmPES微孔滤膜进行过滤，过滤，得供试品溶液A，备用；

(2)将供试品溶液A通过离子交换层析纯化，离子交换层析的介质为 CM Sepharose Fast Flow，以pH 7.0的0.05M的磷酸盐缓冲液为流动相A，以 包括0.4M磷酸钠的pH 7.0的0.05M的磷酸盐缓冲液为流动相B，先用3个柱床 体积的流动相B进行活化，再用4个柱床体积的流动相A进行平衡洗脱，然后 梯度洗脱，梯度洗脱的步骤为：A：B体积比为100％：0％，A：B体积比为 90％：10％，A：B体积比为85％：15％，A：B体积比为80％：20％，A：B 体积比为50％：50％，HPLC检测，收集，得供试品溶液B，备用；

(3)将供试品溶液B通过疏水层析纯化，疏水层析的介质为UniPhenyl， 以pH 7.0的0.05M的磷酸盐缓冲液为流动相A，以包括3.5M硫酸铵的pH 7.0的 0.05M的磷酸盐缓冲液为流动相C，先用3个柱床体积的流动相A进行活化洗 脱，再用4个柱床体积的流动相C进行平衡洗脱，然后梯度洗脱，梯度洗脱的 步骤为：A：C体积比为0％：100％，A：C体积比为16.7％：83.3％，A：C体 积比为33.3％：66.7％，A：C体积比为50％：50％，A：C体积比为66.7％： 33.3％，A：C体积比为83.3％：16.7％，A：C体积比为100％：0％，HPLC检 测，收集，浓缩，干燥，即得眼镜蛇毒神经毒素的纯品。

本实施例整个分离纯化过程仅需8-10小时即可完成，收率约为50％，纯度 为98.2％，适于眼镜蛇毒神经毒素的工业化生产。

实验例1 纯度检测实验

以购自中国药品生物制品检定所的国家眼镜蛇神经毒素(科博肽)为对 照品，对于实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的纯度通过高效液相色谱法 HPLC检测。

色谱柱：C18(4.6mm×150mm)；流动相：0.1％三氟醋酸溶液为流动相 A，乙腈溶液为流动相B；柱温：25℃；检测波长：280nm，流速：0.5 ml/min。梯度条件：洗脱初始状态流动相B为5％，在15分钟内，流动相B增 至60％，保持10分钟，流动相60％B。通过面积归一化法计算出其纯度。

在优化的C18柱HPLC检测条件下，对照品的纯度为98.4％，如图1所示； 实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的纯度为98.2％，如图2所示。

实验例2 生物学活性实验

以ICR小鼠为实验对象，测定实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素的LD₅₀。

选用18-22g的ICR小鼠10只随机分为一组，设为6个剂量组，皮下注 射不同剂量的实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素，给药后观察48小时，记 录动物毒性反应情况和死亡情况；对死亡动物及时进行尸验，记录病变情况， 并按Bliss方法用SPSS软件计算。

表1 Bliss法计算半数致死量

回归方程y(Probit)＝-54.09+26.433Log(D)

半数致死量LD₅₀＝171.99

LD₅₀(Feiller校正)95％的可信限＝164.6-179.93

LD5＝149.03，LD₉₅＝198.48

实验结果计算如表1所示，LD₅₀为171.99μg/kg。这表明，实施例1制备的 眼镜蛇毒神经毒素的生物学活性较高。

实验例3 抗炎活性实验

以二甲苯致小鼠耳肿胀为模型，选取小鼠20只，随机分为两组，即生理 盐水对照组和实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素溶液组，灌胃给药5天，100 μg/kg/d，末次给药后1h，在小鼠1只耳朵内侧快速推注二甲苯溶液30μl，2h 后，打耳，称取左右耳重，实验结果如图3所示。这表明，与正常的生理盐 水组相比，实施例1制备的眼镜蛇毒神经毒素组肿胀速度明显降低，具有一 定的抗炎活性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。