一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物及试剂盒

摘要

本发明公开了一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物，包括上游引物MrNV-QF1和下游引物MrNV-QR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。发明人据此建立了一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明检测方法及其试剂盒应用于MrNV的检测，无需将反转录和PCR反应分开，操作便捷且灵敏快速，有利于快速检测MrNV及防控WTD。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测病毒领域，尤其涉及一种一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物及试剂盒。

背景技术

罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus，MrNV)是罗氏沼虾白尾病(white tail disease，WTD)的重要病原，主要危害罗氏沼虾淡化苗，可导致病虾出现肌肉白浊、白斑或白尾症状，在短时间内大量死亡，虾池中累积死亡率一般为30％～70％，严重时达90％以上。WTD最早于1987年由Nash等在泰国率先报道，随后逐渐波及到中国台湾、法属瓜特罗普岛和安替列群岛以及中国大陆地区。在我国，WTD最早于1996年前后出现在广东、广西一带，以后迅速传播到浙江、江苏、上海等地，2000年起在全国范围内广泛流行，给罗氏沼虾养殖业的发展造成了极大的危害。目前，该病已被列为世界动物卫生组织(OIE)必须申报的疫病和我国水生动物二类疫病。因此，开发MrNV检测技术对有效控制WTD的发生与流行、保障罗氏沼虾养殖业的健康发展具有重要意义。

针对MrNV的检测方法主要有原位杂交、ELISA、胶体金试纸条、RT-PCR及RT-LAMP检测法等。但是，在实际检测工作中，原位杂交和ELISA检测所需时间长；胶体金试纸条虽速度快捷、操作方便，但灵敏度较低；RT-PCR对潜伏感染样品难以检出；套式RT-PCR和RT-LAMP虽灵敏、快速，但容易交叉污染，且不能定量。

荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，对整个PCR反应扩增过程进行了实时监测和连续分析扩增相关荧光信号，监测到的荧光信号随反应变化可以绘制成一条曲线，最后通过标准曲线对未知核酸模板进行定量分析。该法具有操作简单、灵敏高等优点。SYBR Green I荧光定量PCR是在反应中加入能结合于双链DNA螺旋小沟的SYBR Green I，在激发光照射下产生荧光，通过监测荧光强度而监测PCR物量，在病原体检测中广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏快速、操作便捷的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物及试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物，包括上游引物MrNV-QF1和下游引物MrNV-QR1，它们分别具有以下的碱基序列：

上游引物MrNV-QF1：5'-ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3'(序列表SEQ.ID.No.1)，

下游引物MrNV-QR1：5'-GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3'(序列表SEQ.ID.No.2)。

一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒，包括含有上游引物MrNV-QF1和下游引物MrNV-QR1的一步法荧光定量RT-PCR反应液，它们分别具有以下的碱基序列：

上游引物MrNV-QF1：5'-ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3'，

下游引物MrNV-QR1：5'-GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3'。

该试剂盒含有以下试剂：

(1)一步法荧光定量RT-PCR反应液(A液)；

(2)阳性对照(P液)，含MrNV基因的RNA片段；

(3)阴性对照(N液)，不含MrNV基因的RNA片段；

(4)工作标准品；

一步法荧光定量RT-PCR反应液由2×One StepRT-PCR Buffer，PrimeScript 1step Enzyme Mix，上、下游引物，ROX Reference Dye II(50X)，H₂O组成。

一步法荧光定量RT-PCR反应液共2.3mL，每剂反应液为23μL，由2×One StepRT-PCR Bμffer 12.5μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0μL，浓度为10μmol/L的上、下游引物各1.0μL，ROX Reference Dye II(50X)0.5μL，H₂O 7.0μL组成。

阳性对照和阴性对照各200μL。

工作标准品包括含有1×10⁸(B1液)、1×10⁷(B2液)、1×10⁶(B3液)、1×10⁵(B4液)、1×10⁴(B5液)、1×10³(B6液)、1×10²(B7液)、1×10¹(B8液)拷贝/μL的标准品RNA各200μL。

针对目前缺乏对罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)及其所致罗氏沼虾白尾病(WTD)进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究筛选了特异性的引物(上游引物MrNV-QF1和下游引物MrNV-QR1)，据此建立了一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明检测方法及其试剂盒应用于MrNV的检测，无需将反转录和PCR反应分开，操作便捷且灵敏快速，有利于快速检测MrNV及防控WTD。

附图说明

图1是标准品RNA一步法荧光定量RT-PCR曲线，图中1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18、19-21、22-24分别表示标准品RNA为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL的扩增曲线；25:阴性对照；26:空白对照。

图2是标准品RNA一步法荧光定量RT-PCR的标准曲线。

图3是标准品RNA一步法荧光定量RT-PCR的融解曲线，图中1-24表示标准品RNA(1×10⁸～1×10¹拷贝/μL，每个浓度做3个平行)的溶解曲线；25:阴性对照；26:空白对照

图4是一步法荧光定量RT-PCR特异性试验结果图，图中扩增曲线分别为：1:MrNV；2:TSV；3:WSSV；4:IHHNV；5:阴性对照；6:空白对照

具体实施方式

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：

QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGEN公司；One StepPrimeScript^TMRT-PCRKit II购自宝生物工程(大连)有限公司；荧光定量PCR仪为安捷伦公司的Mx3005P；pGM-T载体购自北京天根生化科技有限公司；DNaseⅠ、T7体外转录试剂盒购自Fermentas；2×TaqPCR Master Mix、质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶快速回收DNA试剂盒购自北京艾德莱生物技术有限公司。

罗氏沼虾野田村病毒(MrNV)记载在《罗氏沼虾诺达病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用》，上海海洋大学学报，2012，21(1)：54-59，公众可从广西水产科学研究院获得。

桃拉综合征病毒(TSV)记载在《对虾Taura综合征病毒RT-PCT检测方法的改进及应用》，上海水产大学学报，2008，17(5)：525-529，公众可从广西水产科学研究院获得。

白斑综合征病毒(WSSV)记载在《凡纳滨对虾白斑综合征病毒广西株变异区基因的比较分析》，病毒学报，2014，30(1)：51-56，公众可从广西水产科学研究院获得。

传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)记载在《广西凡纳滨对虾IHHNV感染情况的调查与分析》，南方农业学报，2013，44(12)：2089-2093，公众可从广西水产科学研究院获得。

实施例1、引物设计与合成

根据MrNV基因序列(GenBank No.HQ287005)的保守区域设计一对特异性引物，上游引物MrNV-QF1：5'-ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3'，下游引物MrNV-QR1：5'-GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3'，预期扩增片段大小为119bp，由宝生物工程(大连)有限公司合成，用DEPC处理水稀释至20pmol/μl，-20℃保存备用。

实施例2、一步法荧光定量RT-PCR检测方法的建立

(1)样品的制备

取50～100mg待检虾苗或成虾的鳃丝、肌肉组织，加500μl TN缓冲液(20mMTris/HCl，0.4M NaCl，pH 7.4)匀浆，离心取上清。采用RNA提取试剂盒(QIAamp ViralRNA Mini Kit)按其说明书提取罗氏沼虾野田村病毒总RNA，用核酸蛋白测定仪测定病毒RNA纯度及浓度，保存于-80℃备用。

(2)标准品的制备

以事先构建保存的质粒为模板扩增出MrNV衣壳蛋白基因片段，克隆入pGM-T载体，经鉴定阳性后提取质粒DNA单酶切线性化，纯化回收产物按T7体外转录试剂盒说明进行体外转录获得阳性模板RNA。测定RNA浓度和纯度，换算成拷贝数是3.2×10¹⁰拷贝/μL，并稀释成1×10⁸～1×10¹拷贝/μL 8个梯度作为标准品。

(3)引物浓度确定

以相同浓度的标准品RNA为模板，将引物终浓度在0.1～0.8μmol/L之间进行一步法荧光定量RT-PCR，当引物终浓度为0.4μmol/L时，一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR对标准品RNA的检测可获得较小的Ct值且无非特异性扩增，确定反应体系中引物终浓度为0.4μmol/L。

(4)标准曲线建立(图1-3)

以已知拷贝数的标准品RNA(1×10⁸～1×10¹拷贝/μL)为模板进行一步法SYBR GreenI荧光定量RT-PCR，每个梯度做三个平行，25μL体系中加入：2×One StepRT-PCRBuffer 12.5μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0μL，上下游引物(10μmol/L)各1.0μL，ROX Reference Dye II(50X)0.5μL，RNA 2.0μL，H₂O 7.0μL，同时设以健康无MrNV罗氏沼虾肌肉组织RNA和灭菌DEPC水为模板的阴性对照和空白对照。反应条件参照试剂说明进行一步法，反转录反应：42℃15min，95℃10s；PCR反应：40个循环，95℃5s，60℃45s；融解曲线分析：95℃1min，55℃30s，然后以0.01℃/秒逐渐升温到95℃并全程采集荧光信号，最后95℃30s结束，根据融解曲线判断反应的特异性。

结果，一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR对标准品RNA(1×10⁸～1×10¹拷贝/μL)的扩增曲线呈现明显的S型，而阴性对照和空白对照均没有出现扩增，反应动力学范围达8个数量级，标准品RNA为1×10⁸拷贝时，Ct值最小，为10.5；标准品RNA为10拷贝时，Ct值约为34.5，灵敏度较高，可检测到相当于10个拷贝数的病毒粒子。利用仪器数据分析软件进行分析可得标准曲线：Y＝-3.391×LOG(X)+37.98，Eff.(扩增效率)和RSq(相关系数方值)分别为97.2％和1.000，起始模板浓度的对数与Ct值之间呈良好的线性关系。融解曲线只有单一的波峰，产物Tm值均一，在81.17～81.25℃之间，未见有引物二聚体形成及其他非特异扩增，引物具有很好的特异性。可见，建立的标准曲线能够准确地反映目的产物的扩增。

检测中以Ct值34为界限，若检测样品有“S”型扩增曲线，且Ct值≤34，则检测样品可判断为MrNV阳性，否则样品判断为MrNV阴性。

(5)特异性试验(图4)

以MrNV、TSV、WSSV及IHHNV 4种病毒的核酸为模板，并设以健康无MrNV罗氏沼虾肌肉组织RNA和灭菌DEPC处理水为模板的阴性对照和空白对照，相同条件下同时进行一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR，结果只有MrNV出现阳性扩增曲线，而TSV、WSSV及IHHNV 3种病毒未出现扩增曲线，具有MrNV检测特异性。

实施例3、检测试剂盒的组装

根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。该试剂盒含有以下试剂：

(1)一步法荧光定量RT-PCR反应液(A液)：共2.3mL，每剂反应液为23μL，由2×OneStepRT-PCR Buffer 12.5μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0μL，浓度为10μmol/L的上、下游引物各1.0μL，ROX Reference Dye II(50X)0.5μL，H₂O 7.0μL组成。

(2)阳性对照(P液)：含MrNV基因的RNA片段，200μL；

(3)阴性对照(N液)：不含MrNV基因的RNA片段，200μL；

(4)工作标准品：包括含有1×10⁸(B1液)、1×10⁷(B2液)、1×10⁶(B3液)、1×10⁵(B4液)、1×10⁴(B5液)、1×10³(B6液)、1×10²(B7液)、1×10¹(B8液)拷贝/μL的标准品RNA各200μL。

按25μL体系计算，试剂盒含量可用于100份样检测，以单样份计量，25μL体系中含有的反应液(A液)23μL，使用时25μL体系取A液23μL加入2μL RNA。

试剂盒的稳定性

将试剂盒保存于-20℃，选取B3液、B4液和B5液三个浓度的标准品RNA分别在间隔10天和第20天进行一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR试验，每个浓度做3个重复，计算Ct值的变异系数，验证试剂盒的稳定性和重复性，经过数据分析得到组内及组间的变异系数，组内试验Ct值变异系数为0.15％～0.83％，组间实验Ct值变异系数为0.56％～0.95％，一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR试剂盒具有良好的重复性和稳定性。

表1试剂盒的稳定性试验结果