一种向日葵白锈病菌和黑茎病菌的多重DPO-PCR检测试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的多重DPO-PCR检测试剂盒及其应用。本发明的多重DPO-PCR检测试剂盒包括一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的引物组，所述引物组由引物1、引物2、引物3和引物4组成。通过试验证明：本发明的DPO引物和检测试剂盒具有特异性好、准确性高和灵敏度高的特点，可用于向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的检测、区分以及鉴定。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种向日葵白锈病菌和黑茎病菌的多重 DPO-PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

向日葵白锈病菌(Albugo tragopogonis(Pers.)Gray)是引起向日葵白锈病的病原菌， 该病菌在国外少数国家和地区严重发生、经济影响大、传入风险高，成为国际上关注 的检疫性有害生物。向日葵黑茎病菌(Leptosphaeria lindquistii Frezzi)是引起向日葵黑 茎病的病菌，严重的病田发病率达100％，对向日葵生产造成毁灭性危害，是一种重要 的检疫性病原菌。因此，对这两种病原菌进行准确的检疫鉴定非常重要，而传统形态 学方法鉴定周期长、时效性差。利用血清学和分子生物学技术鉴定这两种菌的方法已 有建立，包括PCR、RFLP等，但这些方法有些需要酶切，检测过程复杂；有些特异 性不强或依赖较昂贵的仪器设备，难以在实验室之间推广。因此，建立一种特异性强、 且能同时快速检测这两种菌的检测方法显得非常重要。

DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各自 独立的特异性引物区域，5′端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列 由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚 次黄嘌呤(Inosine,I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时 寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引 物结构，并且研究表明5′和3′引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将 不能进行，而且由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构且对退 火温度不敏感。该技术的优点主要在于它对退火温度、镁离子浓度等影响普通多重PCR 的关键因素不敏感，适用范围广，而且该技术特异性强，扩增效率高，为多重PCR技 术的应用提供了新的前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何检测待测菌株是向日葵白锈病菌和向日葵黑茎 病菌。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈 病菌还是向日葵黑茎病菌的引物组。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌 的引物组由引物1、引物2、引物3和引物4组成：

所述引物1为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；

所述引物2为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

所述引物3为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

所述引物4为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白 锈病菌还是向日葵黑茎病菌的PCR试剂。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌 的PCR试剂包括上述引物组。

上述PCR试剂中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述PCR 试剂中的终浓度均为0.4μmol/L。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵白 锈病菌还是向日葵黑茎病菌的试剂盒。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌 的试剂盒包括上述引物组或上述PCR试剂。

上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测菌株是向日葵 白锈病菌还是向日葵黑茎病菌中的应用也属于本发明的保护范围。

上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在区分或辅助区分向日葵白锈病菌和 向日葵黑茎病菌中的应用也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种检测或辅助检测待测菌株是向日葵 白锈病菌还是向日葵黑茎病菌的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是向日葵白锈病菌还是向日葵黑茎病菌 的方法包括如下步骤：

(1)用上述引物组对待测菌株进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)检测所述PCR扩增产物的大小；

若所述PCR扩增产物含有大小为307bp的片段，则待测菌株为或候选为向日葵白 锈病菌；

若所述PCR扩增产物含有大小为388bp的片段，则待测菌株为或候选为向日葵黑 茎病菌

上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测菌株的基因组DNA。

上述方法中，所述PCR扩增为多重DPO-PCR。

上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为45-65℃。

上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为60℃。

上述方法在检测或辅助检测向日葵白锈病和/或向日葵黑茎病的病菌中的应用 也属于本发明的保护范围。

本发明根据向日葵白锈病菌大亚基核糖体RNA基因序列和向日葵黑茎病菌的 ITS-5.8S rRNA基因序列，设计了特异性DPO引物，并基于该引物建立了向日葵白锈 病菌和向日葵黑茎病菌的多重DPO-PCR检测方法，可同时对向日葵白锈病菌和向日 葵黑茎病菌进行定性检测。通过实验证明：本发明的多重DPO-PCR方法特异性好， 灵敏度高，而且对退火温度不敏感，适用范围广，基于多重DPO-PCR方法对向日葵 白锈病菌和向日葵黑茎病菌进行定性检测方法灵敏、准确、简便和快速，对进出口相 关货物及产品检验检疫、病害防治预测具有指导意义。

附图说明

图1为多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测结果。其中，1：向日葵黑茎病菌和向 日葵白锈病菌；2：向日葵黑茎病菌；3：向日葵白锈病菌；4：阴性对照。

图2为特异性实验的电泳检测结果。其中，1：向日葵黑茎病菌和向日葵白锈病菌； 2：向日葵黑茎病菌；3：向日葵白锈病菌；4：向日葵黑白轮枝菌；5：向日葵大丽轮 枝菌；6：向日葵茎溃疡病菌；7：向日葵霜霉病菌；8：向日葵菌核病菌；9：向日葵 褐斑病菌；10：向日葵锈病菌；11：阴性对照。

图3为退火温度敏感实验的电泳检测结果。其中，1-5：退火温度分别为45℃、 50℃、55℃、60℃和65℃。

图4为灵敏度实验的电泳检测结果。其中，1-5：2种病原菌DNA模板量依次为 50ng、5ng、0.5ng、0.05ng和0.005ng。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的向日葵白锈病菌(Albugo tragopogonis(Pers.)Gray)在文献“向日葵 白锈病菌巢式PCR检测方法的研究”中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获 得。

下述实施例中的向日葵黑茎病菌(Leptosphaeria lindquistii Frezzi)在文献“向日葵 黑茎病菌分离检测及其RFLP分析”中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获得。

实施例1、一种检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的方法

一、多重DPO-PCR引物组的设计

根据向日葵白锈病菌大亚基核糖体RNA基因序列和向日葵黑茎病菌的ITS-5.8S rRNA基因序列，设计了如下检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的多重DPO-PCR 检测引物组(引物序列中的I为次黄嘌呤)：

BS-DPO-F：CGAATTGTAGTCTATCGAGGCCAAGIIIIIACGCAGGATCC(序列1)；

BS-DPO-R：GGAATGGACAGCGGACGCIIIIIGCTTCCCT(序列2)；

HJ-DPO-F：GATGCCGGTACTCTGGGTCTTTIIIIICATGTACC(序列3)；

HJ-DPO-R：ATTGTTTTGAGGCGAGTTTCCCIIIIIGGAAACAT(序列4)；

其中，BS-DPO-F和BS-DPO-R为检测向日葵白锈病菌的引物，产物大小为307bp； HJ-DPO-F和HJ-DPO-R为检测向日葵黑茎病菌的引物，产物大小为388bp。

二、检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的方法

1、DNA的提取

参照试剂盒操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科 技有限公司)分别提取向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的基因组DNA。

2、多重DPO-PCR扩增

采用BS-DPO-F、BS-DPO-R、HJ-DPO-F、HJ-DPO-R共4条多重DPO-PCR引物， 分别以如下四组的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，分别得到多重 DPO-PCR扩增产物：

组1以向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的基因组DNA(向日葵白锈病菌和向日 葵黑茎病菌各1μL)为模板；

组2以向日葵黑茎病菌的基因组DNA为模板；

组3以向日葵白锈病菌的基因组DNA为模板；

组4以超纯水为DNA模板(阴性对照)。

多重DPO-PCR反应体系如表1所示。其中，Mix 2内含dNTPs、MgCl₂、反应缓 冲液；Mix 1内含DNA聚合酶，Mix 2和Mix 1均为宝生物工程(大连)有限公司， 货号为RR060A。

多重DPO-PCR反应条件：94℃预变性1min；然后94℃变性30s，60℃退火90s， 72℃延伸90s，在此条件下进行35个循环；最后72℃再延伸5min。

表1、多重DPO-PCR反应体系

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，取5μL的多重DPO-PCR扩增产物于2.0％琼脂糖凝 胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果并对扩增产物进行测序。

结果如图1所示：组1(向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的基因组DNA)的PCR 扩增产物含有2条带，大小分别为307bp和388bp；组2(向日葵黑茎病菌的基因组 DNA)的PCR扩增产物只含有1个条带，大小为388bp；组3(向日葵白锈病菌的基 因组DNA)的PCR扩增产物只含有1个条带，大小为307bp；组4的阴性对照无条带。 说明本发明的多重DPO-PCR引物的可以快速有效的检测向日葵白锈病菌和向日葵黑 茎病菌。

实施例2、多重DPO-PCR引物的特异性检测

1、DNA的提取

参照试剂盒操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科 技有限公司)提取表2中的感病植株或纯菌株(保存于伊犁出入境检验检疫局)的基 因组DNA。具体方法如下：对不可培养的菌株(表2中编号为5、8、9)可直接采集 感病植株，液氮充分研磨后提取DNA；对可培养的菌株(表2中编号为1、2、3、4、 6、7)经5-7天纯培养后，挑取菌丝冷冻干燥后，用液氮充分研磨提取DNA。

表2、供试菌株

2、多重DPO-PCR扩增

采用实施例1的步骤二的检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的方法，分别以 步骤1中提取的9种菌的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，得到多重 DPO-PCR扩增产物，同时设置阳性对照(同时加入向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌 的基因组DNA)和阴性对照(超纯水作为DNA模板)。

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物于2.0％琼脂 糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果并对扩增产物进行测序。

结果如图2所示：阳性对照的PCR扩增产物含有2条带，大小分别为307bp和 388bp；阴性对照无条带；向日葵白锈病菌的基因组DNA的PCR扩增产物大小为307 bp的片段，向日葵黑茎病菌的基因组DNA的PCR扩增产物大小为388bp的片段，其 余菌株均无条带，证明本发明的多重DPO-PCR引物的特异性很好。

实施例3、多重DPO-PCR引物的退火温度敏感性检测

1、DNA的提取

采用试剂盒法(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技 有限公司)分别提取向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的基因组DNA。

2、多重DPO-PCR扩增

以步骤1获得的向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的基因组DNA为模板，采用 实施例1的步骤二中的同时检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的方法，用不同的 退火温度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)分别进行PCR扩增，其余反应条件不变， 分别得到多重DPO-PCR扩增产物。

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物于2.0％琼脂 糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果并对扩增产物进行测序。

结果如图3所示：电泳检测结果显示用不同的退火温度(45℃、50℃、55℃、60℃、 65℃)进行PCR扩增得到的PCR扩增产物均含有大小为307bp和388bp的片段，无 非特异性扩增条带，亮度基本一致，说明本发明的多重DPO-PCR引物对退火温度不 敏感。

实施例4、多重DPO-PCR引物的灵敏度检测

1、DNA的提取

采用试剂盒法(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技 有限公司)分别提取向日葵白锈病菌(从感病叶片洗涤、离心富集病原孢子提取DNA) 和向日葵黑茎病菌的基因组DNA。并将得到的基因组DNA进行10倍稀释，分别制 备得到浓度分别为50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL和0.005ng/μL的向日葵白 锈病菌和浓度为50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL和0.005ng/μL的向日葵黑茎 病菌的基因组DNA。

2、多重DPO-PCR扩增

采用实施例1的步骤二中的检测向日葵白锈病菌和向日葵黑茎病菌的方法，分别 以如下5组的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，分别得到多重DPO-PCR 扩增产物：

组1：以50ng/μL的向日葵白锈病菌基因组DNA(1μL)和50ng/μL的向日葵黑 茎病菌的基因组DNA(1μL)为模板；

组2：5ng/μL的向日葵白锈病菌基因组DNA(1μL)和5ng/μL的向日葵黑茎病菌 的基因组DNA(1μL)为模板；

组3：0.5ng/μL的向日葵白锈病菌基因组DNA(1μL)和0.5ng/μL的向日葵黑茎 病菌的基因组DNA(1μL)为模板；

组4：0.05ng/μL的向日葵白锈病菌基因组DNA(1μL)和0.05ng/μL的向日葵黑 茎病菌的基因组DNA(1μL)为模板；

组5：0.005ng/μL的向日葵白锈病菌基因组DNA(1μL)和0.005ng/μL的向日葵 黑茎病菌的基因组DNA(1μL)为模板；

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物于2.0％琼脂 糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。

结果如图4所示：本发明多重DPO-PCR引物具有较高的灵敏度，灵敏度为0.05ng。