一种玉米小斑病菌产孢培养基及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种玉米小斑病菌产孢培养基及其制备方法和应用。该培养基包括马铃薯、甘露醇、琼脂粉和水，其中，马铃薯200g/L，甘露醇5～10g/L，琼脂粉14g/L。玉米小斑病菌在该产孢培养基表面培养，28℃黑暗培养6～7天，培养基表面即可产生大量形态一致、萌发效果好、萌发率高的分生孢子，产孢量约为等量PDA培养基产孢量的1.2～3.6倍，萌发率可达90％以上。该玉米小斑病菌产孢培养基适合病菌的继代培养，可以用于病菌药剂筛选和病菌致病性测定中。

说明书

技术领域

本发明涉及植物病原真菌研究技术领域，具体地说，涉及一种玉米小斑病菌产孢培养 基及其制备方法和应用。

背景技术

玉米小斑病(Southern corn leafblight)是玉米生产上重要的病害，在我国分布广泛。 玉米小斑病属气流传播的病害。玉米小斑病菌产生的分生孢子在病菌传播、侵染和致病中 起着重要的作用，分生孢子可借助气流或者雨水传播到田间生长的玉米叶片上，在有游离 水滴的时候，分生孢子4-8h即可萌发产生芽管并侵入玉米叶片的表皮细胞，3-4d内即可形 成病斑，之后病斑产生分生孢子，借助气流传播，对田间生长的玉米进行重复侵染。目前 利用作物品种抗病性及药剂处理是防治该病害的主要措施，然而在病菌致病性测定、品种 抗病性鉴定和防治药剂筛选试验中往往需要大量的人工培养的分生孢子作为研究试验材 料，而分生孢子来源及其萌发效果将直接影响着试验结果的准确性。

现有技术中常采用PDA培养基或高梁粒培养基进行玉米小斑病菌产孢培养。研究发现， 由前者培养获得的孢子形态常大小不一、孢子萌发率低、萌发芽管长短不一，而后者在病 菌培养产孢过程中较为繁琐，需洗去高梁粒表面的菌丝，然后暴露在空气中使之产孢，操 作不当易造成污染，产孢量下降，因此寻找一种简便的适宜玉米小斑病菌大量产孢的培养 基具有一定的意义。

在杀菌剂抑制病原真菌孢子萌发试验中，通常采用凹玻片法。采用凹玻片法，玉米小 斑病菌孢子萌发效果很差，萌发不整齐。采用水琼脂平板表面萌发法由于病菌孢子接触的 水分和氧气较一致，玉米小斑病菌孢子萌发效果明显好于凹玻片法。但是，采用水琼脂平 板表面萌发法进行杀菌剂抑制病原真菌孢子萌发试验，通常需要相应浓度的药液进行孢子 悬浮液的配制，然后再涂布含药平板表面，操作过程比凹玻片法复杂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有利于玉米小斑病菌生长的产孢培养基及其制备方法和应 用。

本发明具体的技术方案如下：

本发明提供一种玉米小斑病菌产孢培养基，包括马铃薯、甘露醇、琼脂粉和水，其中， 马铃薯200g/L，甘露醇5～10g/L，琼脂粉14g/L。

本发明还提供上述玉米小斑病菌产孢培养基的制备方法，具体为：将200g马铃薯洗净 后切块，加水煮沸20-40min，将滤渣过滤，在滤液中加水补足至1L，并向其中加入5-10g 甘露醇和14g琼脂粉混合溶解，灭菌冷却得到玉米小斑病菌产孢培养基。优选的，制备产 孢培养基过程中的灭菌条件为：121℃灭菌25min。

本发明还包括上述玉米小斑病菌产孢培养基的应用，具体为玉米小斑病菌产孢培养基 在病菌药剂筛选或在病菌致病性测定中的应用。

其中，所述玉米小斑病菌产孢培养基在病菌药剂筛选过程中，首先需要先培养玉米小 斑病菌的分生孢子，以便于后期的接种。通常情况下，制备的产孢培养基在接种前需将其 制平板冷却至凝固，再将活化的病菌菌块移至产孢培养基表面，28℃黑暗培养6～7天，培 养基表面即可产生大量形态一致、萌发效果好、萌发率高的分生孢子，产孢量约为等量PDA 培养基产量的1.2～3.6倍，萌发率可达90％以上，明显高于PDA培养基培养产生的孢子。

用本发明提供的玉米小斑病菌产孢培养基(下面简称甘露醇培养基)在28℃黑暗条件 下培养病菌6～7天，使之产生大量的分生孢子后，在含有分生孢子培养基表面用无菌滤纸 片覆盖，待滤纸片润湿后，将滤纸片移至含不同浓度药剂的水琼脂培养基表面，使沾有孢 子的滤纸片一面朝下，待该滤纸片与培养基表面接触后，部分孢子能粘附在水琼脂培养基 表面，再用镊子转移滤纸片至培养基表面另一处，重复在培养基表面转移滤纸，最后除去 滤纸片完成玉米小斑病菌在培养基上的接种。本发明中对滤纸片在所述产孢培养基表面转 移次数没有特殊限制，可以根据实际情况决定转移次数，优选转移不超过3次。本发明对 滤纸的规格、形状、大小等没有具体的限制，可以根据实际情况选择合适的滤纸进行接种。 在本发明中使用的滤纸为1.5×1.5cm的方形滤纸片。

接种完成后，在滤纸片处理的区域作相应的标记，然后盖上培养皿皿盖，在28℃黑暗 培养3h后，观察病菌孢子的萌发情况，依据孢子萌发率大小评价药剂对孢子萌发的抑制效 果，筛选出抑菌效果好的药剂种类。本发明使用的滤纸片每皿可处理9个区域。本发明对 病菌孢子萌发情况的具体观察方式没有具体的限定，优选使用100倍显微镜进行观察。

由于病菌在甘露醇培养基中培养能产生大量的、萌发效果好的分生孢子，用滤纸片转 移孢子至含不同浓度的药剂平板中，无需使用相应浓度药液稀释，利用玉米小斑病菌孢子 的萌发特性便能有效快速地筛选出抑制孢子萌发效果好的药剂种类及其浓度。该方法减少 了常规药剂筛选试验中一些不必要的环节，且接种的区域孢子分布较集中，十分便于观察。

本发明还包括玉米小斑病菌产孢培养基在病菌致病性测定中的应用，具体方法为：将 活化的玉米小斑病菌菌块移至所述产孢培养基表面，28℃黑暗培养6～7天，获得分生孢子； 在所述产孢培养基表面注入清水，并刮洗培养基表面的孢子，过滤后用清水稀释孢子悬浮 液，使分生孢子终浓度为1-10×10⁵个/mL，将孢子悬浮液进行玉米植株喷雾接种，接种后 调查玉米叶片发病情况，评价病菌对玉米的致病性。优选接种后的植株用塑料薄膜覆盖保 湿处理，保湿处理时间优选为2天。

本发明提供的玉米小斑病菌产孢培养基制作方法简便，制作成本低于常规的PDA培养 基和PSA培养基。病菌在该培养基生长，平板菌落长势良好，产孢能力、孢子萌发效果及 接种致病效果明显优于常规培养基，尤其适用于病菌的继代培养。产孢量约为等量PDA培 养基产量的1.2～3.6倍，萌发率可达90％以上，明显高于PDA培养基培养产生的孢子。在 药剂抑制病原菌孢子萌发试验中，采用本发明提供的方法，既保障了适宜孢子萌发的条件， 又减少了常规药剂筛选试验中一些不必要的环节，利用该病菌孢子的萌发特性便能快速有 效地筛选出抑制孢子萌发效果好的药剂种类及其浓度。本发明提供的玉米小斑病菌产孢培 养基及其应用方法可为病菌的深入研究提供参考。

附图说明

下面结合附图对本发明做详细说明：

图1是玉米小斑病菌在不同浓度的甘露醇培养基上培养的菌落形态；其中从左至右从 上至下甘露醇的含量分别为0、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％；

图2是玉米小斑病菌在不同培养基上培养的菌落形态；从左至右依次为1％甘露醇、 PDA、PSA培养基；

图3是玉米小斑病菌在不同培养基上继代培养5代的菌落形态；从左至右依次为1％甘 露醇、0.5％甘露醇、PDA培养基；

图4是玉米小斑病菌在不同培养基上培养的孢子形态；从左至右依次为1％甘露醇、 PSA、PDA培养基；

图5是不同培养基上培养的孢子在水琼脂平板上的萌发形态；从左至右依次为1％甘露 醇、PSA、PDA培养基；

图6为用滤纸片转移不同培养基培养的孢子至水琼脂平板表面的过程示意图；其中， 左边为1.0％甘露醇培养基，右边为PDA培养基；

图7为100倍镜下滤纸片上孢子粘附在水琼脂平板上的情况；其中，a为1.0％甘露醇 培养基用滤纸片1次转移的孢子，b为PDA培养基用滤纸片1次转移的孢子，c为从图a 所示培养基用滤纸片2次转移的孢子，d为从图b所示培养基用滤纸片2次转移的孢子。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。

实施例1：不同培养基对病菌菌丝生长、产孢的影响

供试菌株：玉米小斑病菌FJ。

供试培养基：甘露醇培养基、马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)、马铃薯蔗糖培养基 (PSA培养基)和1.4％水琼脂培养基。

其中甘露醇培养基的制备方法如下：

马铃薯称重洗净后切小块，加水煮沸0.5h，用纱布滤去马铃薯，加水补足至1L，分装三 角瓶，然后按比例加入甘露醇和琼脂粉，121℃灭菌25min，待培养基冷却至50℃左右，倒入 直径为8.9cm的培养皿内，每皿约25ml，备用。制备不同浓度甘露醇培养基原料的质量如表 1：

表1甘露醇培养基各原料的质量

  马铃薯(g) 琼脂粉(g) 甘露醇(g) 水 0.5％甘露醇培养基 200 14 5 补足至1L

1.0％甘露醇培养基 200 14 10 补足至1L 1.5％甘露醇培养基 200 14 15 补足至1L 2.0％甘露醇培养基 200 14 20 补足至1L 2.5％甘露醇培养基 200 14 25 补足至1L

试验方法：病菌活化好后，用直径5mm的打孔器在菌落边缘切取菌龄一致的菌饼，并用 接种针将菌饼接种到培养基平板中央，菌丝面朝下，每处理6次重复。28℃黑暗培养7天(继 代培养重复此操作)，采用十字交叉法测量菌落直径，然后在各培养基表面分别注入无菌水 25mL，用无菌玻片的一端刮洗菌落表面上的分生孢子后，使孢子分散在水中，用无菌纱布过 滤，制孢子悬浮液，并在显微镜下用血球计数板测定孢子悬浮液浓度，比较不同培养基的产 孢量。将分生孢子悬浮液稀释至100倍显微镜下每视野50～100孢子,取0.5mL孢子悬浮液 涂布于水琼脂平板表面(含1.4％琼脂粉)，于28℃黑暗条件下培养3h，100倍显微镜下观察 水琼脂平板表面孢子的萌发情况，每处理随机观察200个孢子，6次重复，凡孢子芽管大于 孢子的短半径时即算萌发，否则不算萌发。计算孢子悬浮液孢子浓度及孢子萌发率。

结果与分析

从表2可知，培养基对病菌菌丝生长及产孢有明显的影响，病菌在含不同浓度甘露醇培 养基上生长、产孢效果均显著好于PDA培养基和PSA培养基，产孢量约为等量PDA培养 基产量的1.2～1.6倍。由甘露醇培养基培养获得的孢子形态完美，其萌发率高于93％，萌发芽 管长度高达孢子长轴长4倍，而由PDA培养基和PSA培养基培养获得的孢子萌发率分别为 82.45％和86.53％，萌发芽管长度达孢子长轴长3.5倍，表明甘露醇培养基适合玉米小斑病菌 生长和产孢。

表2不同培养基对玉米小斑病菌菌丝生长、产孢的影响

基于甘露醇成本考虑，我们选用0.5％甘露醇培养基和1.0％甘露醇培养基进行病菌继代 培养试验，试验结果从表3可知，病菌在供试的不同培养基中继代培养5代，对病菌的产孢 量有一定的影响，由0.5％甘露醇培养基和1.0％甘露醇培养基培养获得的产孢量显著高于 PDA培养基，产孢量约为等量PDA培养基产量的3.6倍。产孢稳定性、孢子萌发率及个体正 常的孢子比率也显著好于PDA培养基，前者萌发芽管长度达孢子长轴长4倍，后者萌发芽管 长度达孢子长轴长3.5倍。与PDA培养基相比，甘露醇培养基更适宜病菌的继代培养。从经 济成本考虑，对玉米小斑病菌的产孢培养可选择0.5％甘露醇培养基。

表3继代培养5代条件下不同培养基对玉米小斑病菌菌丝生长及产孢的影响

*孢子长轴低于正常孢子长轴的3/4，视为个体不正常的孢子。

实施例2：甘露醇培养基培养的孢子在药剂筛选中的应用

供试菌株：玉米小斑病菌FJ。

供试药剂：吡唑醚菌酯原药(德国巴斯夫股份有限公司)、异菌脲原药(江苏辉丰有限公 司)和氟啶胺原药(利尔化学有限公司)。

供试培养基：含0.5％甘露醇培养基和1.4％水琼脂培养基。

含药培养基的配制：在预备试验的基础上，分别配制表4不同浓度药剂的水琼脂培养基， 设不加药的培养基作对照，重复3次(3皿)。

试验方法：采用0.5％甘露醇培养基培养病菌6～7天，然后在相同菌龄的培养基表面用无 菌的滤纸方片(大小约1.5×1.5cm)覆盖，待滤纸片润湿后，将滤纸片移至含不同浓度药剂的 水琼脂培养基表面，使沾有孢子的滤纸片一面朝下，待该滤纸片与培养基表面接触后，部分 孢子能粘附在培养基表面，再用镊子移除滤纸片至另一处培养基表面，可转移3次，最后除 去滤纸片，并在滤纸片处理的区域作相应的标记，每皿处理6个区域。盖上培养皿皿盖，在 28℃黑暗培养3h后，100倍显微镜下观察病菌孢子的萌发情况，每处理随机观察200个孢子， 6次重复，记载萌发的孢子数及未萌发的孢子数，计算孢子萌发抑制率及其EC₅₀值。依据孢 子萌发抑制率评价药剂对孢子萌发的抑制效果，筛选出抑菌效果好的药剂种类。

孢子萌发抑制率(％)＝[(对照孢子萌发率－处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率]×100

试验结果

选用对病菌菌丝生长具有较好抑制作用的吡唑醚菌酯、异菌脲和氟啶胺(EC₅₀分别为 1.0040，0.6788和0.1446μg/mL)三种药剂进行孢子萌发抑制试验，试验结果从表4可知，供 试的三种药剂对病菌孢子萌发均有较好的抑制效果，其中以吡唑醚菌酯和氟啶胺对孢子萌发 抑制效果好于异菌脲。利用玉米小斑病菌孢子的萌发特性(在水琼脂平板3h萌发率达到最大 值)，采用本发明提供孢子来源及抑制孢子萌发方法，能在短时间内有效筛选出抑制孢子萌发 效果好的药剂种类及其浓度，为田间玉米小斑病防治药剂的合理使用提供参考。

表4不同药剂处理对病菌孢子萌发的抑制效果

实施例3：甘露醇培养基培养的孢子在病菌致病性测定中的应用

供试菌株：玉米小斑病菌FJ

供试玉米品种：T1402

供试培养基：0.5％甘露醇培养基、1.0％甘露醇培养基、PDA培养基和PSA培养基。

试验方法：玉米小斑病菌活化好后，用接种针将病菌菌饼接种到培养基平板中央，菌丝 面朝下，28℃黑暗培养7天(继代培养重复此操作)，获得大量分生孢子后，在培养基表面注 入清水，并用无菌玻片一端刮洗培养基表面的孢子，用双层无菌纱布过滤，用清水稀释孢子 悬浮液，使分生孢子终浓度为1-10×10⁵个/mL，将孢子悬浮液进行玉米植株(5～6叶期)喷雾 接种，接种后的植株用塑料薄膜覆盖保湿处理2天(环境温度20-26℃)，接种7～10天后调查 玉米叶片发病情况，病叶分级标准参照中国人民共和国农业行业标准，玉米抗病虫性鉴定技 术规范，NY/T 1248.2—2006，比较不同方式培养的病菌孢子对玉米的致病性大小。

表5不同培养基对病菌致病性的影响

试验结果

结果从表5可知，在试验1组中，由1.0％甘露醇培养基培养获得孢子接种发病效果显著 好于常规培养基PSA培养基和PDA培养基的接种发病效果。在试验2组中，病菌继代培养5 代后，由0.5％甘露醇培养基和1.0％甘露醇培养基培养获得孢子接种发病效果仍显著好于PDA 培养基的接种发病效果，表明0.5％甘露醇培养基和1.0％甘露醇培养基培养获得的孢子具有 较强的毒力，该培养基适合病菌的继代培养，培养至第5代，病菌致病力稳定，该培养基可 为病菌的致病性测定及品种的抗病性鉴定提供理想的人工接种菌源。

上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方 式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施 方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特 点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。