高效液相色谱串联质谱法同时测定蜂蜡中16种磺胺类药物的方法

摘要

本发明涉及一种检验检疫方法，尤其涉及一种高效液相色谱串联质谱法同时测定蜂蜡中16种磺胺类药物的方法。该方法采用正己烷预溶解，甲酸水溶液提取，经MCX固相萃取小柱净化，用Agilent Eclipse Plus-C18柱（100mm×2.1 mm,3.5μm）分离，电喷雾离子源正离子多反应监测（MRM）模式串联质谱进行测定。本发明16种磺胺类药物在2 ng/mL-50 ng/mL范围内均具有较好的线性关系，相关系数大于0.995。在2.0μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg添加水平下，实际样品中16种磺胺类药物的回收率在65%-127%之间，相对标准偏差（RSD，n=6）在2.9%-13.5%之间，方法定量限（S/N>10）为2.0μg/kg。本方法快速、灵敏、准确，适用于日常蜂蜡样品中16种磺胺类药物残留的定性、定量分析。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检验检疫方法，尤其涉及一种高效液相色谱串联质谱法同时测定蜂蜡中 16种磺胺类药物的方法。

背景技术

磺胺类药物是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类广谱抗菌药物的总称，因其具有抗菌谱广、 高效、低毒、价格低廉等特点，在畜牧养殖业中被广泛应用于预防和治疗细菌感染性疾病。 因该药物在体内的代谢时间较长，当达到一定浓度时就会对人体的机能产生损害，破坏人的 造血系统，影响人体健康，磺胺二甲基嘧啶等还存在潜在的致癌性。目前，检测蜂产品、水 产品等动物源性食品中磺胺类药物一般采用液相色谱-荧光检测器法和液相色谱-质谱联用方 法。

蜂蜡是一种由工蜂腹部下面四对蜡腺分泌的物质，其主要成分是烷醇和烷酸形成的酯类 等，在化妆品、食品和医药工业上有较广泛的应用。由于蜂蜡的基质不同于蜂蜜、蜂王浆， 其无法采用现有的蜂蜜、蜂王浆中磺胺类药物检测方法进行检测。为保障目前蜂蜡的食品质 量安全，防止磺胺类药物在通过蜂蜡间接污染蜂蜜、蜂王浆等蜂产品。急需建立一种高效液 相色谱串联质谱法同时测定蜂蜡中磺胺类药物的方法。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种高效液相色谱串联质谱法同时测定 蜂蜡中磺胺类药物的方法，该法简便、灵敏度高、基质干扰小等优点，可以用于蜂蜡样品中 磺胺类药物残留的定性和定量分析。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

高效液相色谱串联质谱法同时测定蜂蜡中16种磺胺类药物的方法，所述的16种磺胺类药 物为磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲氧嘧啶、苯甲酰磺胺、磺胺甲基嘧啶、磺胺二 甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺喹啉、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲氧 哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基异恶唑、磺胺吡啶和磺胺邻二甲氧嘧啶，该方法包括以下的 步骤：

1)仪器与试剂选择

1.1)仪器

1260超高效液相色谱-6460三重四极杆串联质谱联用仪，美国Agilent公司；MS 3 digital 漩涡混合器，德国IKA公司；N-EVAP-111氮吹仪，美国Organomation公司；Multifuge X1R离 心机，美国Thermo Scientific公司；

1.2)试剂：

标准品：磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲氧嘧啶、苯甲酰磺胺、磺胺甲基嘧啶、 磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺喹啉、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺 胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基异恶唑、磺胺吡啶和磺胺邻二甲氧嘧啶；甲醇、正己 烷、甲酸均为色谱纯；氨水：25％-28％；MCX固相萃取小柱:500mg/6mL上海安谱公司；

2)标准工作溶液

2.1)标准储备液

分别准确称取0.025g16种磺胺类药物标准品于烧杯中，用甲醇溶解，溶解液全部转移至 25mL容量瓶中分别用甲醇润洗3次，润洗液全部转移至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成 浓度为1mg/mL的标准储备液，贴上标签；

2.2)100μg/mL的混合标准储备液

分别准确吸取1mL的上述16种标准储备液至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成 浓度为100μg/mL的混合标准储备液；

2.3)10ug/mL的混合标准储备液

准确吸取1mL上述16种混合标准储备液至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成 浓度为10ug/mL的混合标准储备液；

2.4)1ug/mL的混合标准储备液

准确吸取1mL混合标准储备液至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1ug/mL 的混合标准储备液；

2.5)内标混合溶液

准确称取一定量的磺胺吡啶-D4、磺胺二甲基嘧啶-D4、，磺胺甲恶唑-D4、磺胺喹噁 啉,13C6、磺胺嘧啶-D4、磺胺噻唑-D4，配制成浓度为200ng/mL的内标混合溶液；

2.6)混合标准工作液

分别准确移取一定量的上述混合标准储备液和内标混合溶液，用纯水稀释配制成浓度分 别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、50ng/mL的标准工作液；

3)提取

称取试样2g，精确至0.01g，置于50mL具塞塑料离心管，加入浓度为200ng/mL的混合 内标50uL，加入10mL正己烷，涡旋超声溶解后加入10mL体积百分比浓度为1％甲酸水溶液涡 旋振荡提取，8000r/min离心5min,取下层水层，待净化；

4)净化

将提取液转移至MCX固相萃取小柱中，MCX固相萃取小柱为500mg/6mL,MCX固相萃取小柱 使用前依次用5mL甲醇，5mL体积百分比浓度为1％的甲酸水溶液活化；弃去淋洗液，用5.0mL 甲醇-水溶液淋洗，甲醇-水溶液体积比为1:1，抽干，用8mL 5％氨水甲醇洗脱，收集全部洗脱 液，在50℃以下水浴中氮吹干，用2.0mL甲醇-0.15％甲酸溶液溶解，甲醇-0.15％甲酸溶液体 积比为1:9摇匀，样液过0.45um滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱测定；

5)色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus-C18柱，100×2.1mm，3.5μm；柱温：40℃；进样量： 20μL；流动相：A为体积百分比浓度为0.15％甲酸水溶液，B为乙腈,梯度洗脱条件如下：

6)质谱条件

扫描方式：正模式扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；干燥气温度(Gas Temp)：325℃； 干燥气流量(Gas Flow)：5L/min；喷雾气压力(Nebulizer)：45psi；鞘气温度(Sheath Gas  Temp)：400℃；鞘气流速(Sheath Gas Flow)：12L/min；毛细管电压(Capillary)：4000V； 16种磺胺类药物的质谱条件如下：

*定量离子。

本发明由于采用了上述的技术方案，建立了同时测定蜂蜡中16种磺胺类药物(磺胺-5- 甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲氧嘧啶、苯甲酰磺胺、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、 磺胺二甲异恶唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺喹啉、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺 甲噻二唑、磺胺甲基异恶唑、磺胺吡啶、磺胺邻二甲氧嘧啶)的超高效液相色谱-串联质谱分 析方法。试样采用正己烷预溶解，甲酸水溶液提取，经MCX固相萃取小柱净化，用Agilent  Eclipse Plus-C18柱(100mm×2.1mm,3.5μm)分离，电喷雾离子源正离子多反应监测(MRM) 模式串联质谱进行测定。本文考察和优化了提取、净化方法和仪器测定条件等。结果表明， 16种磺胺类药物在2ng/mL-50ng/mL范围内均具有较好的线性关系，相关系数大于0.995。在 2.0μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg添加水平下，实际样品中16种磺胺类药物的回收率在 65％-127％之间，相对标准偏差(RSD，n＝6)在2.9％-13.5％之间，方法定量限(S/N>10)为2.0 μg/kg。本方法快速、灵敏、准确，适用于日常蜂蜡样品中16种磺胺类药物残留的定性、定 量分析。

附图说明

图1蜂蜡中16种磺胺的总离子流图(添加水平2.0μg/kg)。

图2蜂蜡中16种磺胺的总离子流图(添加水平5.0μg/kg)。

图3蜂蜡中16种磺胺的总离子流图(添加水平10.0μg/kg)。

图4蜂蜡中磺胺嘧啶的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图5蜂蜡中磺胺噻唑的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图6蜂蜡中磺胺吡啶的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图7蜂蜡中磺胺甲基嘧啶的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图8蜂蜡中磺胺二甲基嘧啶的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图9蜂蜡中磺胺甲氧哒嗪的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图10蜂蜡中苯甲酰磺胺的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图11蜂蜡中磺胺磺胺-5-甲氧嘧啶的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图12蜂蜡中磺胺-6-甲氧嘧啶的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图13蜂蜡中磺胺喹啉的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图14蜂蜡中磺胺邻二甲氧嘧啶的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图15蜂蜡中磺胺二甲氧嘧啶的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图16蜂蜡中磺胺甲基异恶唑的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图17蜂蜡中磺胺甲噻二唑的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图18蜂蜡中磺胺氯哒嗪的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

图19蜂蜡中磺胺二甲异恶唑的MRM色谱图(添加水平2.0μg/kg)。

具体实施方式

1实验部分

1.1仪器与试剂

1260超高效液相色谱-6460三重四极杆串联质谱联用仪(美国Agilent公司)；MS 3 digital 漩涡混合器(德国IKA公司)；N-EVAP-111氮吹仪(美国Organomation公司)；Multifuge X1R 离心机(美国Thermo Scientific公司)。

标准品(德国Dr公司)；甲醇、正己烷、甲酸均为色谱纯，氨水：25％-28％；MCX固相萃 取小柱:500mg/6mL(上海安谱公司)。

1.2标准工作溶液

1.2.1标准储备液(1mg/mL)

分别准确称取0.025g标准品(磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲氧嘧啶、苯甲 酰磺胺、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺喹啉、 磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基异恶唑、磺胺吡啶、磺胺邻 二甲氧嘧啶)于烧杯中，用甲醇溶解，溶解液全部转移至25mL容量瓶中分别用甲醇润洗3次， 润洗液全部转移至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，贴上 标签。

1.2.2混合标准储备液(100μg/mL)

分别准确吸取1mL的上述16种标准储备液(1mg/mL)至10mL容量瓶中，用甲醇稀释 至刻度，配制成浓度为100μg/mL的混合标准储备液。

1.2.3混合标准储备液(10ug/mL)

准确吸取1mL上述16种混合标准储备液(100μg/mL)至10mL容量瓶中，用甲醇稀 释至刻度，配制成浓度为10ug/mL的混合标准储备液。

1.2.4混合标准储备液(1ug/mL)

准确吸取1mL混合标准储备液(10ug/mL)至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配 制成浓度为1ug/mL的混合标准储备液。

1.2.5混合内标标准溶液(100ng/mL)

准确称取一定量的磺胺吡啶-D4、磺胺二甲基嘧啶-D4、，磺胺甲恶唑-D4、磺胺喹噁 啉,13C6、磺胺嘧啶-D4、磺胺噻唑-D4，配制成浓度为200ng/mL的内标混合溶液。

1.2.6混合标准工作液

分别准确移取一定量的上述混合标准储备液和混合内标溶液，用纯水稀释配制成浓度分 别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、50ng/mL的标准工作液。

1.3提取

称取试样2g(精确至0.01g)，置于50mL具塞塑料离心管，加入浓度为200ng/mL的 混合内标50uL，加入10mL正己烷，涡旋超声溶解后加入10mL甲酸水溶液(1％)涡旋振 荡提取，8000r/min离心5min,取下层水层，待净化。

1.4净化

将提取液转移至MCX固相萃取小柱(500mg/6mL,使用前依次用5mL甲醇，5mL甲酸水溶 液(1％)活化)中，弃去淋洗液，用5.0mL甲醇-水(1:1，V/V)淋洗，抽干，用8mL 5％氨 水甲醇洗脱，收集全部洗脱液，在50℃以下水浴中氮吹干，用1.0mL甲醇-0.15％甲酸(1:9) 溶液溶解，摇匀，样液过0.45um滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。

1.5色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus-C18柱(100×2.1mm，3.5μm)；柱温：40℃；进样 量：20μL。流动相：A为0.15％甲酸水溶液，B为乙腈,梯度洗脱条件见表1。

表1梯度洗脱条件

1.6质谱条件

扫描方式：正模式扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；干燥气温度(Gas Temp)：325℃； 干燥气流量(Gas Flow)：5L/min；喷雾气压力(Nebulizer)：45psi；鞘气温度(Sheath Gas  Temp)：400℃；鞘气流速(Sheath Gas Flow)：12L/min；毛细管电压(Capillary)：4000V。

表2磺胺类药物的质谱条件

*定量离子

2结果与讨论

2.1提取溶剂选择

蜂蜡的主要成分有游离脂肪酸、游离脂肪醇、碳水化合物、类胡萝卜素等，属于脂溶性 物质^[1]。所以本文采用加入正己烷溶解蜂蜡样品后，再加入甲酸水溶液提取蜂蜡样品中磺胺 类药物。通过回收率试验表明，该方法能有效的提取出蜂蜡中的测定物质。

2.2方法的线性范围和检出限

配制一系列不同浓度的标准工作溶液(2.0、5.0、10、20、40、50ng/mL),并依次进 样,分别以测定目标物的峰面积Y为纵坐标,以相应的浓度值为横坐标,作标准曲线,见表 2，结果表明,16种磺胺类目标物在2～50ng/mL范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系，相 关系数R²大于0.994。

在阴性样品中添加目标化合物，按照本文的方法测定，10倍信噪比(S/N)对应的添加水 平作为定量限(LOQ)，结果见表3。

表316种磺胺类药物线性方程、检出限、定量限(单位：μg/kg)

2.4方法的回收率和精密度

在2.0μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg三个添加水平下进行阴性样品中添加标准 溶液的方法进行方法回收率试验，每个添加水平重复6次，方法回收率和精密度见表4。结果 表明，16种磺胺类药物的加标回收率范围在65％-127％之间，相对标准偏差(RSD)为2.9％-13.5％， 表明本文所开发的方法能够满足日常检测的要求。

表4阴性样品中目标分析物的添加回收率和精密度(n＝6)

3结论

本实验采用正己烷预溶解，酸性水溶液提取，MCX固相萃取小柱净化等前处理方法提取 净化，超高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定蜂蜡中16种磺胺类药物。结果表明，本方 法具有简便、灵敏、准确的优点，可以用于蜂蜡中痕量磺胺类药物残留的定性和定量分析。