一种乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂及其检测方法

摘要

本发明涉及一种利用化学抑制法来检测乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂。本试剂包括试剂R1和试剂R2，其特征在于，所述试剂R1包含：生物缓冲液其中溶质在试剂R1中的浓度为50-150mmol/L，L-乳酸锂1.0-1.5mmol/L，过氯酸钠1.5-2.5mol/L，羟基乙叉二膦酸1-5 ml/L，十八烷基三甲基溴化铵 0.1-1g/L，聚氧乙烯烷基醚 0.1-1 ml/L，防腐剂 0.5-5ml/L；所述试剂R2包含：缓冲液 其中溶质在试剂R1中的浓度为50-150mmol/L，NAD+ 8-12mmol/L，防腐剂 0.5-5 ml/L。本乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂具有准确度高、价格低廉的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及乳酸脱氢酶同工酶1的检测领域，具体涉及一种利用化学抑制法来检测乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂和检测方法。

背景技术

乳酸脱氧酶有5种同工酶形式，即LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，可用电泳法进行分离。人体心肌、肾、红细胞以LDH1和LDH2为最多。肝和横纹肌则以LDH4和LDH5为主。脾、胰、甲状腺、肾上腺中LDH3较多。乳酸脱氢酶同工酶是观察心肌疾病、肝胆疾病等的指标之一。

乳酸脱氢酶同工酶是指催化同一反应(乳酸-丙酮酸)而结构不同的一组酶类。其广泛分布于全身各组织，而LDH1绝大部分分布于心肌细胞中，所以当心肌细胞发生病变或损伤时，LDH1急剧升高，因此测定LDH1对诊断心脏疾病具有较高的灵敏性。另外，检测LDH1的活力还可作为治疗心肌梗死、心肌炎、心肌损伤新药筛选的一项指标。

目前用于同工酶的检测方法主要有化学抑制法、免疫抑制法、热变性法、电泳法、亲和层析法。用于乳酸脱氢酶同工酶的检测方法主要有化学连续检测法，可使用的化学抑制剂主要有高氯酸盐、羟基化合物和硫氰酸胍，这几种方法都有优缺点，其中电泳法有点事准确可靠，能够了解整个LDH同工酶谱的情况，信息全面，缺点是灵敏度差，操作时间长，而且对仪器和操作人员的要求高，离子交换层析法的结果也非常的准确，但是操作要求也非常高并且操作时间也非常长，而使用化学抑制法和免疫法则操作简单，使用时间短，非常适合推广，而相对于免疫法，则化学抑制法的价格更加的低廉，但是化学抑制法由于可选用的抑制剂较多，由于抑制剂的种类不同和抑制剂的含量不同会导致检测试剂的特异性较差，容易受到其他乳酸脱氢酶同工酶的干扰，或者过度抑制的情况，本发明根据这一问题，在化学抑制剂法的基础上建立一种特异性强的化学抑制法检测血清乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种高准确度的利用化学抑制法检测血清乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂。

同时还提供了一种利用本发明的检测试剂检测乳酸脱氢酶同工酶1的检测方法。

乳酸脱氢酶催化L-乳酸与NAD+反应生成NADH,NADH在340nm处有特异吸收峰，其生成的速率与血清中的LDH1的活性成正比。化学抑制剂为LDH的M亚基的特异抑制剂，在340nm处测定NADH的生成速率，即可测出LDH1活性。

本发明的具体内容如下：

一种乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，其特征在于，所述试剂R1包含：生物缓冲液 其中溶质在试剂R1中的浓度为50-150mmol/L，

L-乳酸锂 1.0-1.5mmol/L，

过氯酸钠 1.5-2.5mol/L，

羟基乙叉二膦酸 1-5ml/L，

十八烷基三甲基溴化铵 0.1-1g/L，

聚氧乙烯烷基醚 0.1-1ml/L，

防腐剂 0.5-5ml/L；

所述试剂R2包含：缓冲液 其中溶质在试剂R1中的浓度为50-150mmol/L，

NAD+ 8-12mmol/L，

防腐剂 0.5-5ml/L。

更为优化的，所述试剂R1中还包括：抗坏血酸氧化酶 1-5KU/L，和/或胆红素氧化酶1-3KU/L。

更为优化的，所述试剂R2中还包括：明胶 1-5g/L。

优选的，所述试剂R1中生物缓冲液为CAPS缓冲液，其溶质在试剂R1中的浓度为100mmol/L的，在25℃时，CAPS缓冲液的PH为9.7。

优选的，所述试剂R2中缓冲液为酒石酸缓冲液，其溶质在试剂R1中的浓度为100mmol/L，在25℃时，酒石酸缓冲液的pH为3.5。

优选的，所述防腐剂为Proclin系列300型。

优选的，所述试剂R1与试剂R2的体积比为5:1。

一种上述检测试剂用于检测乳酸脱氢酶同工酶1的检测方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)量取试剂R1和试剂R2；

(2)将待测血清与试剂R1混合，测得波长为340nm时的吸光度A1；

(3)将试剂R2加入步骤(2)的混合溶液内，3-8min后，测得波长为340nm时的吸光度A2。

上述检测方法，更为又换为，步骤(3)中的反应时间为5min。

试剂R1和试剂R2的制备方法为在将各原料量取好，加入到容器中，混合均匀即可。

Proclin系列300型简称为PC-300。

本发明在试剂R1和R2中分别使用了CAPS(3－(环己氨基)－1－丙磺酸)缓冲液和酒石酸缓冲液，在试剂中使用的CAPS(3－(环己氨基)－1－丙磺酸)缓冲液是生物缓冲液，对在保证缓冲能力的同时，不会对反应体系产生负面影响；在试剂的R1中加入了十八烷基三甲基溴化铵和聚氧乙烯烷基醚(即EMULGEN-707)两种表面活性剂，这两种表面活性剂能有较好的提高试剂的乳化作用，从而提高试剂的准确度和特异性；在R1生化试剂中优先选择了过氯酸钠作为化学抑制剂，能过较好的提高检测试剂的特异性；在试剂R1中加入了羟基乙叉二膦酸，能够有效的螯合重金属离子，并且能够较好的提高试剂的准确性；本发明还在试剂中加入了抗化学酸氧化酶和胆红素氧化酶，能够有效的去除抗坏血酸和胆红素的干扰。

本乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂具有准确度高、价格低廉的优点，可广泛的推广于乳酸脱氢酶同工酶1的检测领域。

本乳酸脱氢酶同工酶1的检测方法，其原理就是，A2与A1的差值，与标准液的使用同样方法测得的数值的差值之比乘以标准液的LDH1的浓度，就是待测血清的浓度，具有速度快，准确度高的优点。

附图说明

图1为配方2和电泳法相关性曲线图

图2为配方3和电泳法相关性曲线图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

(1)配方1：试剂R1的组分为： 

TRIS缓冲液 100mmol/L，

L-乳酸锂 1.3mmol/L，

硫氰酸胍 2mol/L，

叠氮钠(防腐剂) 0.5ml/L；

试剂R2的组分为： 

磷酸盐缓冲液 100mmol/L，

NAD+ 10mmol/L，

叠氮钠(防腐剂) 0.5ml/L；

(2)配方2：试剂R1的组分为： 

CAPS(3－(环己氨基)－1－丙磺酸)缓冲液 50mmol/L，

L-乳酸锂 1.3mmol/L，

过氯酸钠 2mol/L，

羟基乙叉二膦酸 1ml/L

十八烷基三甲基溴化铵 0.1g/L，

EMULGEN-707 0.1ml/L，

抗坏血酸氧化酶 1KU/L，

胆红素氧化酶 1KU/L，

PC-300(防腐剂) 0.5ml/L；

试剂R2的组分为： 

酒石酸缓冲液 100mmol/L，

NAD+ 10mmol/L，

明胶 1g/L，

PC-300(防腐剂) 0.5ml/L；

(3)配方3：试剂R1的组分为： 

CAPS(3－(环己氨基)－1－丙磺酸)缓冲液 100mmol/L，

L-乳酸锂 1.3mmol/L，

过氯酸钠 2mol/L，

羟基乙叉二膦酸 5ml/L

十八烷基三甲基溴化铵 1g/L，

EMULGEN-707 1ml/L，

抗坏血酸氧化酶 5KU/L，

胆红素氧化酶 3KU/L，

PC-300(防腐剂) 3ml/L；

试剂R2的组分为： 

酒石酸缓冲液 100mmol/L，

NAD+ 10mmol/L，

明胶 5g/L，

PC-300(防腐剂) 0.5ml/L；

(4)检测方法： 

在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，本检测试验采用日立7180全自动分析仪，利用终点法进行测定，检测主波长为340nm，利用速率法进行测定，分别将R1和R2按照5:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作步骤如表1：

表1

计算方法：乳酸脱氢酶同工酶1含量(U/L)＝(ΔA测定÷ΔA标准)×C标准。

(5)干扰性试验： 

取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求，然后分别用配方2和配方3的试剂，同时对比测定血清中乳酸脱氢酶同工酶1的含量,加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2，相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－无干扰物质的样本的测定均值)/无干扰物质的测定均值×100％。

由表2可以看出，抗坏血酸、胆红素、血红蛋白和甘油三酯对配方2和配方3的测试结果没有明显干扰，说明本检测试剂具有较强的抗干扰能力。

表2

(6)相关性实验： 

取20个临床血清样本，样本号分别为1、2、3——20，每个样本混合均匀，均分为4份，分别通过配方1、配方2、配方3的速率法与电泳法共4种方法，检测血清乳酸脱氢酶同工酶1的含量，检测结果如表3所示。并获得了用配方2和配方3两种试剂分别与电泳法检测结果的相关性曲线(如图1和图2所示)，通过检测结果显示，通过配方2试剂和配方3试剂的检测结果与电泳法检测血清乳酸脱氢酶同工酶1的结果的相关系数分别为0.9993和0.9977，说明本乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂具有极高的准确性。

表3

R² 。